消瘀健脾止鼾方对间歇性缺氧小鼠血清HIF-1α、IFN-γ及IL-4水平的影响.pdf

ChengChinehypo)nt药理毒理39Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床消瘀健脾止鼾方对间歇性缺氧小鼠血清HIF及IL-4水平的影响F郑洁，卢蓉蓉，蒋路云?摘要 目的：消瘀健脾止鼾方是四川省名中医蒋路云主任医师多年临床经验方，在治疗痰瘀互结型阻塞性睡眠呼吸暂停综合征具有明显的临床疗效，通过对间歇性缺氧小鼠模型血清中HIF-1、IFN-及IL-4的含量变化评价消瘀健脾止方的药效。方法：采用低氧氧仓建立间歇性缺氧小鼠模型，将小鼠分为正常组、模型组、给药组治疗2 周，对比观察分析三组在治疗前后的一般行为学表现以及血清HIF-1、IFN-、IL-4含量变化。结果：消瘀健脾止鼾方可有效降低血清HIF-1、IFN-及IL-4的表达。结论：消痰健脾止軒方能降低HIF-1、IFN-、IL-4为代表的炎症因子水平，对机体间歇性缺氧有明显的改善作用。关键词 消疼健脾止軒方；阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（OSAHS）；间歇性缺氧；HIF-1；IFN-；IL-4中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号 16 7 4-92 6 X(2023)06-007-04Effect of Xiao-Yu-Jian-Pi-Zhi-Han prescription on serum levels of HIF-1a,IFN-y,and IL-4 on mice with intermittexia IZHENG Jie,LU Rong-rong,JIANG Lu-yun/(1.School of Clinical Medicine,Chengdu University of Traditionalse Medicine,Chengdu 610075,Sichuan;2.The Afiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,gdu610032,Sichuan)Abstract Objective:Xiao-Yu-Jian-Pi-Zhi-Han prescription is a formula of Chief Physician Dr.Jiang Lu-yun with manyyears of clinical experience,who is also Sichuan Famous Chinese Medicine Doctor.The prescription has obvious clinical eficacyin the treatment of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome with interconnection of phlegm and stagnation.The eficacy ofXiao-Yu-Jian-Pi-Zhi-Han prescription was evaluated by changes in the serum levels of HIF-1,IFN-and IL-4 in an experimentalmice model of intermittent hypoxia.Method:A mice model of intermittent hypoxia was established by using a hypoxic oxygenchamber.The mice were divided into normal group,model group and drug administration group for 2 weeks,and the generalbehavioral performance and changes in serum HIF-la,IFN-and IL-4 levels of the three groups before and after treatment werecompared and analyzed.Result:Xiao-Yu-Jian-Pi-Zhi-Han prescription effectively reduced the expression of serum HIF-1a,IFN-and IL-4.Conclusion:Xiao-Yu-Jian-Pi-Zhi-Han prescription can reduce the level of inflammatory factors represented by HIF-la,IFN-and IL-4,and has a significant ameliorating effect on intermittent hypoxia in the organism.Key words Xiao-Yu-Jian-Pi-Zhi-Han prescription;obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome(OSAHS);intermittenthypoxia;HIF-1;IFN-;IL-4阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructivesleep apnea-hypopnea syndrome，O SA H S）作为临床常见睡眠障碍疾病，可导致机体氧化应激、全身炎症反应及自主神经功能紊乱等问题。前期临床研究表明2 ，OSAHS患者中医证型主要为痰瘀互结证痰湿证 痰热证 肺脾气虚证=脾肾阳虚证，通过使用消健脾止鼾方联合一般行为疗法治疗痰瘀互结基金项目】国家自然科学基金项目（8 2 17 4198）作者单位 1.成都中医药大学临床医学院，四川成都6 10 0 7 5；2.成都中医药大学附属医院，四川成都6 10 0 32作者简介 郑洁（1996-），女，在读硕士研究生，主要从事中西医结合耳鼻咽喉临床与基础研究Tel:13207130709Email:通讯作者 蒋路云（196 9-），男，硕士学历，主任医师，主要从事中西医结合耳鼻咽喉临床与基础研究Tel:139081915333Email:收稿日期 2 0 2 3-0 4-0 1型OSAHS患者，可以降低患者BMI指数（身体质量指数）及AHI指数（呼吸暂停低通气指数）、提高LSpO2（最低血氧饱和度），且疗效肯定、安全稳定、无副作用。反复间歇性缺氧是OSAHS的主要表现之一，而缺氧诱导因子是与机体氧代谢有关的关键因子。LuD等人3 的研究表明，OSAHS与缺氧诱导因子1（H I F-1）的表达有关，且OSAHS缺氧程度越严重，HIF-1的活性越强。GabryelskaA等人(4也提出OSAHS的间歇性缺氧可以让血清HIF-1表达上调。JanmohammadiP等人5 进行的一项Meta分析显示，OSAHS不仅与HIF-1密切相关，血清干扰素（IFN-）的表达也高于健康人。TamCS等人通过对113名儿童的研究表明，患有OSAHS的儿童，其IFN-水平显著升高。除上述两个因子外，白细胞介素作为一种参与一系列炎症途径的细胞因子，也常见40：Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床于OSAHS的研究中。YiM等人门通过研究白细胞介素与OSAHS的关系，发现白介素-4（IL-4）在OSAHS患者中表达升高。TanHL等人8 通过对包括IL-4在内的各种炎性因子进行研究，发现OSAHS患儿表现为促炎状态。因此，在以往OSAHS有关的研究中，HIF-1、IFN-及IL-4是不可忽视的主要因子。HIF-1、I FN-及IL-4是机体应答缺氧应激及气道炎症的关键因子。本文针对消瘀健脾止鼾方对OSAHS间歇性缺氧的治疗效果进行研究，通过建立间歇性缺氧小鼠模型，对上述关键血清因子进行检测，进一步佐证临床疗效，探讨消瘀健脾止鼾方在治疗OSAHS间歇性缺氧方面中的作用机制。1实验材料1.1实验动物36只4周龄大小的雄性C57BL/6J健康小鼠（体重为2 0-2 2 g），由达硕生物科技有限公司提供，许可证编号SYXK（川）2 0 2 1-2 46。于特定无病原体条件下适应性喂养至3天后，按照研究目的将实验小鼠随机分为三组即A组（空白对照组：常氧）、B组（模型组）、C组（模型+消瘀健脾止鼾方治疗组），每组12 只小鼠。1.2实验药物与试剂消瘀健脾止鼾方组成：酒川芎、三七粉、石菖蒲、法半夏、地龙、牡蛎、浙贝母、黄芪、白术、茯苓、党参、山药、甘草。由四川新绿色药业有限公司制成免煎颗粒，所使用的中药颗粒机均为同一批次。检测试剂盒为血红蛋白测定试剂盒（C021-1-1），南京建成生物工程研究所生产；Mouse HIF-1ELISAKIT（ZC-38 10 2），上海苗彩生物科技有限公司生产，Mouse IFN-ELISAKIT（ZC-37 90 5），上海苗彩生物科技有限公司生产MouseIL-4ELISAKIT（ZC-37 98 6），上海苗彩生物科技有限公司生产。2实验方法2.1动物造模参考MateikaJH的实验方法复制慢性间歇性缺氧实验动物模型。将A组小鼠放置于常氧环境（氧含量浓度为2 1%），B组与C组小鼠放置于密闭氧舱内，开启氧仓开关，调节氧气及氮气比例，使舱内氧浓度至10%，持续8 h，后恢复氧舱内常氧环境16 h，持续造模4周。造模成功标准：2 周后各组ELISA检测血红蛋白含量，A与B、C 组有显著差异即视为造模成功。2.2给药方法A组不做干预。造模2 周后B组以0.5mL蒸馏水灌胃，每日1次。C组参考实验动物用药剂量换算：一副消瘀健脾止鼾方颗粒约重2 1g，以成人平均体重7 0kg计算动物给药量，成人用法：每日一副，一日三次口服。根据人和小鼠间的换算系数9.1，计算出C组小鼠消瘀健脾止鼾方颗粒每日给药剂量为2.7 3g:kg，为能更好地体现中药灌胃组与其他两组的疗效差异，故采用双倍高剂量治疗性给药，即5.46 gkg，按此比例将免煎颗粒溶于蒸馏水用以灌胃，每日1次。治疗性灌胃治疗与造模同步进行，持续2 周。2.3标本采集及检测造模2 周后，A组12 只小鼠，以及在B组及C组中随机抽取12 只小鼠，共计2 4只小鼠于眼眶静脉采血0.2 mL用于检测造模结果；造模4周后，夜间8:0 0后不再投放食物，于次日早晨8:0 0 将3组动物按序号称重记录，用戊巴比妥钠（50 mgkg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后腹主动脉采血，1.5mL离心管收集血液0.8 mL左右，室温放置3h后，8 0 0 0 rmin的离心机离心10 min（离心半径6 cm），收集上层血清，分装于1.5mL离心管中-8 0 C冰箱保存待测。通过ELISA试剂盒检测血清中HIF-1、I FN-及IL-4水平。2.4统计学方法用SPSS26.0统计软件对所有数据进行统计学分析，对所有数据采用（均数土标准差）的方式来表示并进行方差齐性检验，若方差齐，则采用单因素方差分析，并用LSD法进行两两比较；如若方差不齐，则选用Games-Howell法进行两两分析。P0.05表示差异具有统计学意义。3结果3.1造模结果统计结果显示，与A组相比，B组+C组小鼠全血中血红蛋白含量明显升高，差异显著，具有统计学意义（P0.01），提示造模成功。详见表1。表1造模2 周后各组小鼠全血中血红蛋白含量的变化(XSD)组别只数含量（gL)A组1287.0404.896B组+C组12107.0113.994*注：与A组比较，*P0.05,*P0.013.2行为症状学造模前，各组小鼠精神状态良好，活动正常，进食及排泄无异常，皮毛光滑，无明显呼吸音，无异常行为。造模过程中，低氧模型组及中药灌胃组均出现活动量减少，喜卧少动，采食减弱，二便较空白组无明显变化，无明显呼吸音，皮毛光泽度降低，喜成41Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床团聚集于氧舱出风口。随着灌胃治疗的进行，C组较前饮食量逐渐增加，活动量逐渐增加，进食量逐渐增加，仍有成团聚于氧舱出风口的表现，二便较前无明显变化。整个实验过程中无实验小鼠死亡。3.3各组小鼠血清中HIF-1、I FN-、I L-4水平统计结果显示，与A组相比，B组、C组小鼠血清中HIF-1浓度明显升高，差异极显著（P0.01），进一步验证造模成功。与B组相比，C组小鼠血清中HIF-1浓度降低，差异显著（P0.05），说明消瘀健脾止鼾方可通过降低HIF-1水平达到治疗OSAHS的临床疗效。与A组相比，B组小鼠血清中IFN-浓度明显升高，差异显著，具备统计学意义（P 0.0 5）。与B组相比，C组小鼠血清中IFN-浓度降低，差异显著，具备统计学意义（P0.05）。与A组相比，B组小鼠血清中IL-4浓度升高，差异显著（P0.05）。与B组相比，C组小鼠血清中IL-4浓度降低，差异显著音（P0.05）。详见表2。表2 各组小鼠血清中HIF-1、I FN-、I L-4水平比较(xSD)组别只数HIF-1(pg:mL)IFN-y(pg:mL)IL-4(pg:mL)A组127.0981.529112.60912.96423.9013.416B组1212.2721.841*140.24719.286*28.5115.174*C组1210.6471.792*121.65119.953*24.5615.213*注：与A组比较，*P0.05，*P 0.0 1；与B组相比，P0.05,*P0.014讨论中医学认为，OSAHS为本虚标实、虚实夹杂之证，多是肺脾气虚为本，气滞、痰凝、血瘀为标。随着越来越多的研究表明，OSAHS的基本发病机制为上气道塌陷和解因素而致的慢性间歇性缺氧，即对应了中医学中痰瘀互结等病机。李呆在内外伤辨惑论饮食劳倦论提出：“脾胃一虚，肺气先绝。因此，中医学在治疗OSAHS时根据其病因病机，多采用健脾理气、消瘀祛痰等治疗原则进行用药。由于动物与人类在上气道的解剖结构和生理学上存在很大差异，目前还没有动物模型可以完全模拟OSAHS患者的病理解剖学和病理生理特征。本实验主要研究OSAHS患者的间歇性缺氧的特征，故将实验动物置于可控氧气浓度的培养系统内，使实验动物处于缺氧环境，模拟出不同程度的呼吸暂停低通气指数，从而制造出一种以间歇性缺氧为特点的实验动物模型。本研究在“痰瘀互结”理论指导下，探讨消瘀健脾止方对间歇性缺氧小鼠的治疗作用。消瘀健脾止鼾方以川芎、三七为君药，二者均可行气活血，上提药力以达头面，得以消肿散瘀；石菖蒲开窍豁痰化湿，半夏燥湿化痰消痞，二者相伍，共为臣药，增君药涤痰通窍之力；余药配伍，补中益气，运化中焦，共为佐药，辅以甘草调和诸药、缓和药性。且有药理研究发现，川芎可抑制HIF-1的表达12 炎症反应在OSAHS的发生和发展中起着至关重要的作用，OSAHS的间歇性缺氧特征可导致炎症反应的发生，同时炎性反应又可诱导气道重塑，进一步加深OSAHS患者的缺氧状态3。HIF-1是细胞对低氧反应的一个重要转录因子14，在OSAHS发病过程中，HIF-1可随细胞内氧含量浓度变化而介导不同的转录因子，在低氧环境下调节多种靶基因以适应机体的缺氧状态，维持氧稳态。同时，HIF-1与气道慢性炎症和气道重塑有密切关系15。因此，HIF-1的水平在一定程度上反应OSAHS的缺氧程度。由TH1细胞分泌的IFN-是一种多效性细胞因子，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节功能6 。在炎症环境中，IFN-激活免疫反应并刺激病原体的消除，它还可以防止免疫系统的过度激活和组织损伤17。IL-4作为参与炎症反应的因子，主要由活化的Th2亚群分泌，并影响着Th2亚群的分化18)，IL-4通过辅助T细胞特异性分泌，参与并调控细胞的凋亡。当Th1/Th2失去平衡时便会引发一系列炎症反应，导致免疫失衡并加重气道重塑风险。通过减少IFN-及IL-4的表达，可以调整Th1/Th2平衡，可有效减轻炎症造成的气道重塑，改善小鼠间歇性缺氧症状 9。本文研究结果显示，通过建立间歇性缺氧小鼠模型，可使小鼠血清血清HIF-1、IFN-及IL-4表达增加，消瘀健脾止鼾方可通过降低鼾症小鼠血清HIF-1、I FN-及IL-4的表达，达到对间歇性缺氧的治疗效果。目前OSAHS治疗主要是以佩戴无创正压通气机及手术治疗为主，前者需要长期佩戴，患者舒适性及依从性较差，手术存在风险高、易复发等缺点，目前国内外尚无公认有效治疗药物2 0，消瘀健脾止鼾方通过前期临床观察得出该方对OSAHS有明确疗效，本实验相关实验数据进一步验证了该方对OSAHS间歇性缺氧的治疗效果，可为推广该方治疗OSAHS提供理论依据，可进一步彰显中医药独特优势。上接第38 页（责任编辑：陈思敏）42Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2023;14(6)中药与临床参考文献1闫慧.MHR与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者心律失常的相关性研究D.新疆医科大学,2 0 2 2.2廖洁.消瘀健脾止鼾方治疗痰瘀互结型鼾眠的临床疗效观察与分析D.成都中医药大学,2 0 2 2.3 Lu D,Li N,Yao X,et al.Potential inflammatory markers inobstructive sleep apnea-hypopnea syndromeJ.Bosn J BasicMed Sci,2017,17(1):47-53.4 Gabryelska A,Szmyd B,Szemraj J,et al.Patients with obstruc-tive sleep apnea present with chronic upregulation of serumHIF-1 proteinJ.J Clin Sleep 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