无菌检验基础标准操作专项规程SOP.doc

文件名称
无菌检验标准操作规程（SOP）
页码：1/5
文件编号
YZ-Q3(z)-ZL-10-
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第三版
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目标：制订无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。
范围：本标准适适用于本企业大容量注射剂无菌检验操作。
责任者：质管部、化验室主任、QC检验员
内容：
1、标准依据：《中国药典》二部附录XI H。
2、简述：无菌检验方法系用于检验药品是否无菌一个方法。检验项目包含需气菌、厌气菌及真菌检验。若供试品符合该项检验方法相关要求，仅表明了在该检验条件下未发觉微生物污染。
3、环境要求：该项检验应在环境洁净度万级（C级）背景下局部百级（A级）单向流区域内或隔离系统中进行。其全过程必需严格遵守无菌操作。预防微生物污染，但所采取方法不得影响供试品中微生物检出。操作前环境洁净度应经验证。日常检验需对试验环境进行监控。
5、方法验证：进行该项检验前应根据《无菌检验方法验证规程》确定该方法适用性。
4、人员要求：无菌检验人员必需含有微生物专业知识，并经过无菌技术培训。
6、检验数量及检验量：
6.1、接种每种培养基所需最少检验数量:2%或10个（取较少者），供试品无菌检验若采取薄膜过滤法，应增加1/2最小检验数量作阳性对照用；若采取直接过滤法，应增加供试品无菌检验时每个培养基容器接种样品量作阳性对照用。
6.2、每支供试品接入每种培养基最少许:半量（100ml≤V≤200ml），采取薄膜过滤法时，检验量应不少于直接接种供试品总接种量，只要供试品特征许可，应将全部容器内全部内容物过滤。
7、细菌培养温度为30～35℃，真菌培养温度为23～28℃。
8、仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、离心机、双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器（针头）、剪刀、镊子、注射器盒、75％酒精棉球、紫外光灯365nm、真空泵、一次性使用集菌培养器。
9、消毒剂配制：
9.1、75％乙醇溶液（配制酒精棉球用）。
9.2、0.2％新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。
9.3、2％来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。
10、试剂及培养基配制：
10.1、0.1％蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶解，滤清，调整PH值至7.1±0.2，分装，灭菌。
10.2、pH7.0灭菌氯化钠－蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml微温溶解，滤清，分装，灭菌。
10.3、依据供试品特征，可选择其它经验证适宜溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂。
10.4、硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保留备用。分装容器应合适，其装量和容器高度百分比应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超出培养基深度1/2。供试品接种前，培养基氧化层高度不得超出培养基深度1/5，不然须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超出20分钟），快速冷却只限加热一次，并应预防被污染。
10.5、改良马丁培养基：取商品干燥培养基28.5g，加水1000ml，加热溶解，分装，121℃高压灭菌15分钟（若干燥培养基结块应勿使用）。
10.6、选择性培养基：
按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验
10.7、营养肉汤培养基：按商品说明称取培养基，配制，加热，溶解，分装，按培养基说明高压灭菌，保留备用。
10.8、营养琼脂培养基：取商品干燥培养基3.4g，加蒸馏水1000ml，加热溶解分装，121℃高压灭菌15分钟。
10.9、改良马丁琼脂培养基：取商品干燥培养基制备或按改良马丁培养基处方及制法，加入14.0g琼脂，调整PH值使灭菌后PH值为6.4±0.2，分装，121℃高压灭菌15分钟。
10.10、制备好培养基应保留在2～25℃，避光环境中。培养基若保留于非密闭容器中，通常在三周内使用。若保留于密闭容器中，通常可在十二个月内使用。
11、试验前准备工作
11.1、用具洗刷
11.1.1、玻璃器皿：如试管、量筒、移液管、刻度吸管、离心管、三角瓶、双碟等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用蒸馏水洗涤4～5次，倒置，晾干。试管、移液管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。
11.1.2、注射器用水冲洗后，用洗涤剂冲洗，然后用水冲洗洁净，再用蒸馏水冲洗3次。
11.1.3、剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗洁净，再用蒸馏水洗涤3次。
11.1.4、多用薄膜过滤器，玻璃管等用饮用水及蒸馏水洗净、晾干。
11.1.5、洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。
11.2、用具包扎及灭菌
11.2.1、移液管、刻度吸管在管口上端内，松松塞入少许脱脂药品，然后每支管用白纸严密卷好，再用两层牛皮纸一起包扎。
11.2.2、洗涤洁净注射器及适配针头各部件和剪刀、镊子一并入垫有纱布铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。
11.2.3、试管、三角瓶等在管（瓶）口塞上纱布棉纱用牛皮纸包装严密。
11.2.6、将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。
11.2.7、将以上包扎好用具在121℃蒸汽灭菌20分钟。或采取适宜灭菌方法。（适宜高温灭菌器皿可采取160℃干热灭菌）
11.2.8、物品灭菌完成，勿立即置冷处，以免急速冷却造成染菌，应置恒温培养箱中干燥。
11.3、洁净室清洁和灭菌
11.3.1、洁净室及超净台，每七天用高锰酸钾加甲醛薰蒸灭菌。
11.3.2、在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2%新洁尔灭溶液或2%来苏尔或75％乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，超净台空气过滤器自净半小时。操作完成后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌30分钟以上。
12、操作
12.1、开启传输窗外侧门，将物品表面消毒后置传输窗内，关闭窗门。
12.2、操作人员按《进入洁净室更衣程序》洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于试验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续用紫外灯照射半小时，关灯，再将用具放入超净台内。
12.3、培养基适用性检验：无菌检验用硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合无菌性检验及灵敏度检验要求。本检验可在供试品检验前或和供试品检验同时进行。
12.3.1、无菌效果检验：每批培养基随机取不少于5支（瓶）培养14天，应无菌生长。
12.3.2、灵敏度检验：
12.3.2.1、菌种及菌液制备：
12.3.2.1.1、检验用菌种包含：
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003]
铜绿假单胞菌（Pstudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10 104]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501]
生孢梭菌（Clostridium sporgenes）[CMCC(B)64 941]
白色念珠菌（Candida albicaus）[CMCC(F)98 001]
黑曲菌（Aspergillus niger）[CMCC(F)98 003]
12.3.2.1.2、菌液制备方法：铜绿假单胞菌菌悬液制备方法同金黄色葡萄球菌菌悬液制备方法。
12.3.2.2、培养基接种：取每管装量为12ml硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100CFU金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另一支不接种，作为空白对照，培养3天；每管装量为9ml改良马丁培养基5支分别接种小于100CFU白色念珠菌、黑曲菌各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。
12.3.2.3、结果判定：空白对照管应无菌生长，若加菌培养基管均生长良好，判定该培养基灵敏度符合要求。
12.4、配制培养基应在凉暗处保留，通常不得超出2周。临用前细菌和霉菌培养基分别经30～35℃和20～25℃培养不少于48小时和72小时，证实无菌生长时方可使用。
12.5、阳性对照试验：
12.5.1、应依据供试品特征选择阳性对照菌，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌供试品以生孢梭菌为对照品；抗真菌供试品以白色念珠菌为对照品。
12.5.2、阳性对照试验菌液制备同方法验证试验。
12.5.3、取各阳性对照菌悬液（含菌量小于100CFU）及供试品（用量同供试品无菌检验每份培养基接种样品量），以无菌操作加入对应培养基中，培养48～72小时，检验应生长良好。（阳性对照试验操作应和微生物程度检验操作隔离进行，预防交叉污染）。
12.6、阴性对照试验：取供试品对应溶剂或稀释剂冲洗液同法操作，培养14日应无菌生长。
12.7、供试品检验：
12.7.1、供试品外部消毒：包装瓶外壁用75％乙醇擦拭，待干。
12.7.2、供试品制备：用灭菌镊子取出注射器，在火焰旁将针芯插入针管并安上针头，注射器针头应快速经过火焰数次，用注射器以无菌操作直接吸收供试液。或抽至已灭菌玻璃容器中，用稀释剂稀释为供试液，如为可溶于水固体供试品，应取要求量，加入适宜灭菌稀释液溶解做为供试液。
12.7.3、直接接种法：
取供试品，按上述操作进行外部消毒和制备后，用灭菌注射器以无菌操作自每管中吸收供试品，在近火焰旁以左手持培养基，右手半握拳，以小指和无名指拔开培养基管棉塞，管口经过火焰，移至火焰下侧，分别将各供试品1ml（或要求量，除另有要求外，每个容器中培养基用量应符合接种供试品体积不得大于培养基体积10%）沿培养基管壁加入各培养基管内，每个供试品均分别接种硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基各5管，另取硫乙醇酸盐流体培养基管一支，同法操作，操作结束后，接种对照菌液1ml（小于100CFU）作为供试品阳性对照。硫乙醇酸盐流体培养基，每管装量不少于15ml，改良马丁培养基不少于10ml。注入供试液时，切勿向液面直射，以免将空气中氧带入培养基中，并在火焰旁将塞子塞严。接种后轻轻振动使均匀。
12.7.4、薄膜过滤法
12.4.1水溶性供试液过滤前应先将少许冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充足干燥。为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量通常为100ml，且总冲洗量不得超出1000ml，以避免滤膜上微生物受损伤。
12.7.4、2硫乙醇酸盐流体培养基在30～35℃培养14天，改良马丁培养基在23～28℃培养14天。培养期间应逐日检验是否有菌生长，并填写无菌检验统计。如供试品管出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观判定时，可取该培养液接种在另一支相同新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判定是否有菌。
12.8结果判定：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。不然，试验无效。
若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合要求;若供试品管中任何显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合要求，除非能充足证实试验结果无效，即生长微生物非供试品所含。当符合下列最少一个条件时，方可判试验结果无效：
（1） 无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不符合无菌检验要求；
（2）回顾无菌试验过程，发觉有可能引发微生物污染原因；
（3）供试品管中生长微生物经判定后，确证是因无菌试验中所使用物品和（或） 无菌操作技术不妥引发。试验若经确定无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检验，若无菌生长，判供试品符合要求；若有菌生长，判供试品不符合要求。