分子生物学-基因工程和核酸杂交.ppt

14 基因工程基因工程基因工程基因工程（DNA recombination）：又称）：又称DNA重重组技技术（gene engineering），是指将外源是指将外源基因基因通通过体外重体外重组后后导入受体入受体细胞，并使其能在受体胞，并使其能在受体细胞内胞内复制和表达复制和表达的的技技术。分子克隆分子克隆（molecular cloning）：是指将目的）：是指将目的DNA片片段段与与载体重体重组，然后，然后导入受体入受体细胞，并在受体胞，并在受体细胞中胞中复复制制、扩增，以增，以获得得该DNA分子大量拷分子大量拷贝的技的技术。24.1 工具酶工具酶1.限制性核酸内切限制性核酸内切酶2.DNA聚合聚合酶3.DNA连接接酶4.碱性磷酸碱性磷酸酶5.T4多核苷酸激多核苷酸激酶6.核酸核酸酶S131、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶限制性核酸内切限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：）：简称限制称限制酶，是一，是一类能能识别和和切割双切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解特定核苷酸序列的核酸水解酶。4第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶限制性核酸内切酶命名限制性核酸内切酶命名5作用作用 三种限制性核酸内切酶的作用三种限制性核酸内切酶的作用酶活性酶活性 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 核酸内切酶核酸内切酶 甲基化酶甲基化酶 甲基化酶甲基化酶 ATPATP酶酶 DNADNA解旋酶解旋酶DNADNA链上的链上的 无无 有有 有有特异识别位点特异识别位点DNADNA链上的链上的 无无 在识别序列内在识别序列内 在识别序列外在识别序列外特异切割位点特异切割位点在分子克隆中在分子克隆中 无无 有有 无无的重要意义的重要意义6限制限制酶能能识别双双链DNA特异的特异的4 8个碱基个碱基对，并在此序列内并在此序列内特异切割特异切割DNA。限制限制酶功能：根据需要在功能：根据需要在特定的位点特定的位点上精确切上精确切割双割双链DNA分子。分子。回文回文结构构（palindrome structure）：）：指双指双链DNA分子上按分子上按对称称轴排列的反向互排列的反向互补序列（常序列（常为限制限制酶所所识别）。）。限制性核酸内切酶的作用限制性核酸内切酶的作用75 GAATTC3 ATATGC5 3 EcoR的识别序列：的识别序列：对称轴对称轴3 CTTAAG5 8粘性末端粘性末端（sticky end）：）：指限制酶错位切开两条对称轴指限制酶错位切开两条对称轴互补互补DNA双链所产生的末端。双链所产生的末端。平末端平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端。双链所产生的末端。GAATTCCTTAAGEcoRCCC GGGGGG CCCSma9101112同工异源酶同工异源酶（isoschizomers）：指）：指来源不同，但能识别来源不同，但能识别和切割同一位点的酶。和切割同一位点的酶。同尾酶同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶。同粘性末端的酶。如：如：BamH 和和Bst（G GATCC）Xho 和和 Pae R7（C TCGAG）如：如：BamH（G GATC C）Sau 3A（N GATC N）。）。由此产生的由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在片段可借粘性末端相互连接，在DNA重重组时具有更大的灵活性。组时具有更大的灵活性。131）DNA聚合聚合酶和和Klenow片段片段大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶（E.Coli DNA polymerase）是）是单一多一多肽链的多功能的多功能酶，分子，分子量量为103kD，它具有，它具有3种种酶活性：活性：5 3 DNA聚合聚合酶活性活性 3 5 核酸外切核酸外切酶活性活性 5 3 核酸外切核酸外切酶活性活性2、DNA聚合酶聚合酶 14 5 3 外切酶外切酶 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外切酶外切酶 (103kD)Klenow 片段片段 N C 5 3 聚合酶聚合酶 3 5 外切酶外切酶(68kD)35kD(小小)68kD(大大)N枯草杆菌枯草杆菌蛋白酶蛋白酶 DNA聚合酶聚合酶 15补齐双双链DNA的的3 末端，同末端，同时可使可使3 末端末端DNA标记上同位素。上同位素。cDNA克隆中，合成克隆中，合成cDNA第二第二链。DNA序列分析。序列分析。Klenow片段的主要用途片段的主要用途16Taq DNA聚合聚合酶（简称称Taq 酶）是一种耐）是一种耐热的的DNA聚合聚合酶，分子量，分子量为65Kd，最佳作用温度，最佳作用温度是是7080，Taq酶具有具有5 3 聚合聚合酶活性活性和和依依赖于聚合作用的于聚合作用的5 3 外切外切酶活性活性。Taq DNA聚合聚合酶可用于可用于DNA测序及通序及通过聚合聚合酶链反反应（PCR）对DNA分子的特定序列分子的特定序列进行体行体外外扩增。增。2）Taq DNA聚合酶聚合酶17逆逆转录酶（reverse transcriptase）是依是依赖RNA的的DNA聚合聚合酶，它以，它以RNA为模板，模板，4种种dNTP为底物，催化合成底物，催化合成DNA，此，此过程称程称为逆逆转录过程。程。逆逆转录酶是多功能是多功能酶。RNA指指导的的DNA聚合聚合酶活性（活性（RDDP）核糖核酸核糖核酸酶H活性（活性（RNaseH）DNA聚合聚合酶活性（活性（DDDP）3）逆转录酶）逆转录酶185 3 3 5 RNA(用用 表示表示)RNA-DNA 杂化分子杂化分子 3 5 RNase （核酸酶核酸酶H活性活性)DDDP （DNA聚合酶活性聚合酶活性）4种种dNTP RDDP （逆转录酶逆转录酶）引物、引物、4种种dNTP 病毒双链病毒双链DNA用用 表示）表示）（cDNA第二链第二链(complementary DNA，cDNA)与病毒与病毒RNA 互补的互补的DNA(用用 表示表示)5 3 3 5 5 3 5 3 19末端脱氧核苷末端脱氧核苷酰转移移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端称末端转移移酶）：）：分子量分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到移到单链或双或双链DNA分子的分子的3 末端末端-OH上。上。末端末端转移移酶的功能主要有：的功能主要有：在在载体或目的基因体或目的基因 3 末端加上互末端加上互补的同的同质多聚尾，多聚尾，形成形成人工粘性末端人工粘性末端，便于，便于DNA重重组连接。接。用于用于DNA 3 末端的同位素探末端的同位素探针标记。4）末端脱氧核苷酰转移酶）末端脱氧核苷酰转移酶20(A、G、C、T)n nOH5 5 335 5 33OH5 5 3 3 5 5 33(A、G、C、T)n n Mg2+dNTPnppiMg2+dNTPnppi5 5 33OH5 5 33OH 5 5 335 5 33(A、G、C、T)n n Co2+dNTPnppiCo2+dNTPnppi（1）底物是）底物是单链单链DNA或有或有3 突出末端突出末端的双链的双链DNA，需要，需要Mg2+。（2）底物是）底物是平端平端或或3 凹端凹端的双链的双链DNA，需要，需要Co2+。(A、G、C、T)n n21DNA连接接酶（DNA ligase）：称：称为基因工程的基因工程的缝纫针，它的主要功能是，它的主要功能是催化两个互催化两个互补粘性末粘性末端或平末端双端或平末端双链DNADNA分子的分子的5 5 磷酸基磷酸基团与与3 3 羟基形成基形成磷酸二磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平，将具有相同粘性末端或平末端的末端的DNADNA连接起来。接起来。DNA连接接酶包括包括大大肠杆菌杆菌DNA连接接酶和和T4DNA连接接酶两种两种类型。型。3、DNA连接酶连接酶2223碱性磷酸碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去的作用是催化去除除DNA、RNA或或dNTP上的上的 5-磷酸基磷酸基团。主要用途。主要用途有：有：除去除去DNA片段上的片段上的5 磷酸以防自身磷酸以防自身连接。接。在使用在使用T4多核苷酸激多核苷酸激酶和和32P同位素同位素标记前，从前，从RNA或或DNA上除去上除去5 端的端的磷酸。磷酸。4、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶 5-pCpGpC -OH 3 碱性磷酸酶碱性磷酸酶5-CpGpC -OH 3 5-p3-HO5-HO3-HO245、T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 5-CpGpC -OH 3p+ADP+ATP5-CpGpC -OH 3T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶前向反应前向反应：交换反应交换反应：5-CpGpC -OH 3+ADP -32P dATP 二硫苏糖醇二硫苏糖醇,Mg2+过量过量ADPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶p*+ATP25核酸核酸酶S1可水解双可水解双链DNA、RNA或或DNA-RNA杂交分交分子中的子中的单链部分部分。其主要作用有：。其主要作用有：除去粘性末端以除去粘性末端以产生生平末端平末端。除去除去cDNA合成合成时形成的形成的发夹结构构。分析分析RNA的的茎茎环结构构和和DNA-RNA分子的分子的杂交交情况。情况。6、核酸酶、核酸酶S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1核酸酶核酸酶S1S1+264.2 载体载体载体体（vector）：指能携）：指能携带外源外源DNA片段片段导入入宿主宿主细胞胞进行行扩增或表达的工具。增或表达的工具。载体的本体的本质为DNA。制制备的目的基因或的目的基因或DNA片段必片段必须与合适的与合适的载体体连接形接形成重成重组体，才能体，才能进入受体入受体细胞并胞并进行复制和表达。行复制和表达。常用的常用的载体有：体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等。粒和病毒等。271、克隆载体、克隆载体克隆克隆载体体：能将能将载体外源体外源DNA在受体在受体细胞中复胞中复制、制、扩增并增并产生足生足够量目的量目的DNA的的载体。体。28能能自我复制自我复制并具并具较高的拷高的拷贝数。数。分子量一般分子量一般 10Kb。带有有遗传筛选标记。有适当的有适当的限制限制酶酶切位点切位点，便于外源，便于外源DNA的插的插入和入和筛选。v多克隆位点多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：）：载体上具有的多个限制体上具有的多个限制酶的的单一一酶切位点。切位点。克隆载体应具备的特征克隆载体应具备的特征291）质粒克隆载体）质粒克隆载体质粒克隆载体的主要用途：质粒克隆载体的主要用途：用于保存和扩增用于保存和扩增 2Kb目的目的DNA。构建构建cDNA文库。文库。目的目的DNA的测序。的测序。作为核酸杂交时的探针来源。作为核酸杂交时的探针来源。30pBR322质粒克隆载体质粒克隆载体pBR322质粒是由一系列粒是由一系列大大肠杆菌杆菌质粒粒DNA通通过DNA重重组技技术构建而成的双构建而成的双链克隆克隆载体，体，长为4.36Kb。它含有一个能保它含有一个能保证高拷高拷贝自我复制的自我复制的复制起始点复制起始点（Ori），并装有），并装有四四环素抗性（素抗性（Tetr）基因）基因和和氨氨苄青霉青霉素抗性（素抗性（Ampr）基因）基因供菌落供菌落筛选。在在这两个抗性基因中分两个抗性基因中分别含有含有BamH I和和Pst I等限制等限制酶的的单一一酶切位点切位点，用于插入外源，用于插入外源DNA片段。如有外源片段。如有外源基因的插入，会基因的插入，会导致致这些些标志性基因的失活。志性基因的失活。31 复制复制起始点起始点抗药基因抗药基因抗药基因抗药基因pBR322载体载体32pUC系列载体系列载体 pUC系列系列载体是由体是由pBR322质粒和粒和M13噬菌体重噬菌体重组构建构建而成的而成的双双链DNA质粒粒载体。体。pUC18和和pUC19质粒粒长约2.69Kb，除多克隆位点互，除多克隆位点互为相相反方向排列外，其它序列均相同。反方向排列外，其它序列均相同。pUC质粒含粒含Ampr，可供菌落，可供菌落筛选。载体中装入一个来体中装入一个来自大自大肠杆菌乳糖操杆菌乳糖操纵子的子的lacZ 基因基因，该基因序列中含基因序列中含有有多克隆位点多克隆位点。33pUC18载体载体342）噬菌体克隆载体）噬菌体克隆载体噬菌体噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染：指感染细菌的病菌的病毒。毒。按其生活周期分按其生活周期分为两种两种类型：型：1.溶菌性噬菌体：溶菌性噬菌体：指噬菌体感染指噬菌体感染细胞后，胞后，连续增殖，直到增殖，直到细菌裂解，菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它放的噬菌体又可感染其它细菌。菌。2.溶原性噬菌体：溶原性噬菌体：指噬菌体感染指噬菌体感染细胞后，可将自身的胞后，可将自身的DNA整合到整合到细菌的染色体中，和菌的染色体中，和细菌染色体一起复制。菌染色体一起复制。35野生型的野生型的 噬菌体是噬菌体是线性双性双链DNA，全，全长约48.5Kb，其，其中中60%（约30Kb）是溶菌生）是溶菌生长所必需，中所必需，中间40%的区的区域域为非必需，非必需，可被外源可被外源DNA片段代替而不影响片段代替而不影响 噬菌体噬菌体的生存。的生存。噬菌体噬菌体5 末端含末端含12核苷酸的互核苷酸的互补单链顺序，是天然的序，是天然的粘性末端，称粘性末端，称为cos位点位点，噬菌体感染宿主菌后，其粘噬菌体感染宿主菌后，其粘端通端通过碱基配碱基配对而而结合，形成合，形成环状状DNA分子。分子。噬菌体载体噬菌体载体36 噬菌体载体的结构噬菌体载体的结构 37 噬菌体载体的特点噬菌体载体的特点重重组噬菌体的分子量必噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的在野生型噬菌体的75%105%之之间。筛选标记：l外源基因插入型：外源基因插入型：蓝白斑白斑(LacZ)筛选。l外源基因置外源基因置换型：噬菌斑数目（型：噬菌斑数目（转染率高染率高100 1000倍）。倍）。38 噬菌体载体的用途噬菌体载体的用途 用作一般的克隆用作一般的克隆载体。体。用于构建基因用于构建基因组或或cDNA文文库（22Kb）。）。用于抗体用于抗体库或随机或随机肽库的构建。的构建。核酸的序列分析。核酸的序列分析。39M13噬菌体噬菌体野生型野生型M13M13噬菌体噬菌体为6.4Kb6.4Kb左右的左右的闭环正正链DNADNA分子。克分子。克隆的隆的外源基因片段外源基因片段1kb1kb1kb1kb。M13M13噬菌体能以噬菌体能以单链和双和双链两种方式存在，可用两种方式存在，可用于于感染感染(经包装的包装的单链DNA)DNA)和和转化化(双双链DNA)DNA)。M13M13中引入的多克隆位点，正好插入中引入的多克隆位点，正好插入LacZLacZ基因内，可利基因内，可利用用蓝白色噬菌斑白色噬菌斑筛选重重组体。体。M13M13噬菌体只降低宿主噬菌体只降低宿主细胞的生胞的生长速度，而不溶解宿主速度，而不溶解宿主细胞（胞（呈呈溶源状溶源状态生生长，故可从故可从细菌培养液中菌培养液中获得噬得噬菌体，制菌体，制备单链DNADNA）。）。40M13噬菌体噬菌体在细菌内的复制模式图在细菌内的复制模式图噬菌体噬菌体正链正链复制复制复制型复制型DNA经经pIIpII蛋白蛋白造缺口造缺口355335滚环复制滚环复制释出单链释出单链DNADNA(正链正链)经经pIIpII蛋白蛋白剪切剪切进入下进入下一循环一循环41粘粒粘粒(cosmid)是由是由质粒和粒和 噬菌体的噬菌体的cos位点构位点构建而成。建而成。粘粒粘粒粘粒粘粒载载体体体体组组成：成：成：成：质粒复制的粒复制的起始位点起始位点(Ori)。携携带抗抗药基因。基因。用于插入目的基因的用于插入目的基因的单一一酶切切位点。位点。噬菌体的噬菌体的cos位点。位点。3）粘粒克隆载体）粘粒克隆载体42粘粒载体的粘粒载体的特点特点粘粒粘粒载体大小体大小为46Kb，而，而插入外源基因插入外源基因长达达4050kb。加入加入 噬菌体噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装部和尾部蛋白，可将粘粒包装成成类似于似于 噬菌体的具感染能力的噬菌体的具感染能力的颗粒粒，容易，容易进入大入大肠杆菌。杆菌。粘粒粘粒进入入细菌后菌后则完全失去噬菌体的功能，而完全失去噬菌体的功能，而表表现质粒的特性。粒的特性。43粘粒载体的粘粒载体的用途用途 克隆大片段克隆大片段DNA。构建基因构建基因组文文库。442、表达载体、表达载体表达表达载体体是指能将外源基因在受体是指能将外源基因在受体细胞中有效胞中有效转录和正确翻和正确翻译的的载体。体。基因表达、合成有功能的蛋白基因表达、合成有功能的蛋白质依依赖于于基因的基因的有效有效转录、mRNA正确的翻正确的翻译和翻和翻译后加工。后加工。45报告基因（报告基因（reporter gene）为了判断某一待了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采序列的生物活性，常采用用报告基因方法。告基因方法。报告基因告基因：是指：是指处于待于待测基因下游并通基因下游并通过转录和表达水平来和表达水平来反映上游待反映上游待测基因功能基因功能的基因，的基因，又称又称报道基因。道基因。461）原核细胞表达载体）原核细胞表达载体真核基因在原核真核基因在原核细胞中表达需要保胞中表达需要保证外源基因：外源基因：插入方向的正确性；插入方向的正确性；受原核启受原核启动子的控制；子的控制；必必须能在原核能在原核细胞中有效胞中有效转录和有效翻和有效翻译。外源基因在原核外源基因在原核细胞中表达需要重要胞中表达需要重要调控元件。控元件。47原核原核细胞的表达胞的表达载体主要是体主要是大大肠杆菌表达杆菌表达载体体。大大肠杆菌表达杆菌表达载体是在克隆体是在克隆载体的基体的基础上上导入入表达系表达系统调控元件：控元件：启启动子子核糖体核糖体结合位点合位点转录终止信号。止信号。48（1）启动子（）启动子（promoter）如乳糖启如乳糖启动子（子（Lac）、色氨酸启）、色氨酸启动子（子（Trp）、）、Tac启启动子（子（Trp-Lac）以及）以及PL和和PR启启动子等。子等。5 TTGACATATAAT/3-35区区 -10区区 转录起始点转录起始点Pribnow boxDNA原核细胞启动子示意图原核细胞启动子示意图49（2）SD序列序列mRNA50（3）终止子（）终止子（terminator）终止子：止子：一个基因的一个基因的3 末端有一特定的末端有一特定的DNA序序列，它具有被列，它具有被RNA聚合聚合酶识别并停止并停止转录的功的功能。能。该序列含有一段富含序列含有一段富含A/T和富含和富含G/C的的回文回文对称称结构，构，终止子止子转录后形成的后形成的RNA具有具有茎茎环状局状局部二部二级结构构。51 -NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGC TTTTTTNNN-DNA-NNTT CGCGGCNNNNGGCCGCGAAAAAANNN-G/C富含区富含区2G/C富含区富含区1A/T富含区富含区5 3 5 3 RNA-NNAAGCGCCGNNNNCCGGCGCUUUUUUNNN-OH5 3 RNARNA结构结构5 G C NN NN CC GC GC GG CG CA UA U NNNN UUUU-OH 3 DNADNADNADNA转录的强转录的强转录的强转录的强终止子模式图终止子模式图终止子模式图终止子模式图转录转录52非融合型表达非融合型表达载体：体：产生外源蛋白，易被原核生外源蛋白，易被原核细胞蛋胞蛋白白酶降解。如降解。如pKK223-3质粒粒载体。体。分泌型表达分泌型表达载体：体：产生生带信号信号肽的分泌型融合蛋白，的分泌型融合蛋白，可减少外源蛋白被降解以及使蛋白可减少外源蛋白被降解以及使蛋白质能在能在细胞外正确胞外正确折叠，易提取。如折叠，易提取。如PINlll系列。系列。融合型表达融合型表达载体：体：产生由生由较短的原核短的原核细胞多胞多肽和真核和真核细胞蛋白胞蛋白质构成的融合蛋白，具有抗原性，构成的融合蛋白，具有抗原性，较天然的天然的外源蛋白外源蛋白稳定。如定。如pGEX系列。系列。原核细胞表达载体的类型原核细胞表达载体的类型53真核表达真核表达载体的真核表达元件有：体的真核表达元件有：启启动子子/增增强子子终止位点和加止位点和加poly A信号信号。原核原核质粒序列粒序列：包括复制起始序列和抗：包括复制起始序列和抗药基因基因标记。启启动子子：转录起起始始位位点点上上游游2530bp有有富富含含AT的的TATA框框，TATA框框的的上上游游约100200bp处为上上游游启启动子元件。子元件。增增强子子（enhancer）：是是一一类显著著提提高高基基因因转录效效率的率的顺式作用元件。式作用元件。终止子和加止子和加polyA信号（信号（AAUAA）。）。2）哺乳动物细胞表达载体）哺乳动物细胞表达载体541.目的基因的目的基因的获取取2.载体的体的选择3.目的基因和目的基因和载体的体的连接接4.重重组DNA导入受体入受体细胞胞5.重重组体的体的筛选和和鉴定定4.3 基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤55连接连接含含重组子重组子的的阳性克隆阳性克隆载体载体+目的基因目的基因转化、筛选转化、筛选和和鉴定鉴定阳性克隆阳性克隆DNADNA重组体重组体+受体细胞受体细胞基因工程的基本步骤基因工程的基本步骤 分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛分、切、接、转、筛56 1）从基因文库中获取）从基因文库中获取2）逆转录合成）逆转录合成cDNA3）人工合成）人工合成DNA片段片段4）直接从染色体）直接从染色体DNA中分离目的基因中分离目的基因1、目的基因的获取、目的基因的获取571）从基因文库中获取）从基因文库中获取目的基因：目的基因：指被研究的某一基因或指被研究的某一基因或DNA序列，序列，即需要克隆或表达的基因。即需要克隆或表达的基因。基因基因组文文库（genomic library，G-文文库）是指是指含有某种生物全部基因随机片段的重含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克克隆群。隆群。58用逆用逆转录法得到的目的基因法得到的目的基因进行克隆，可行克隆，可获得得较完整的完整的连续编码序列序列，易在宿主，易在宿主细胞中表达胞中表达及及筛选。选用富含目的基因用富含目的基因mRNA的的细胞作胞作为实验材料，材料，有利于分离到目的基因。有利于分离到目的基因。如胰如胰岛素基因的素基因的mRNA主主要存在于胰腺要存在于胰腺组织，血，血红蛋白基因的蛋白基因的mRNA占网占网质红细胞胞总mRNA的的50%90%。2）逆转录合成）逆转录合成cDNA59根据已知基因的核苷酸序列或基因根据已知基因的核苷酸序列或基因产物的氨基物的氨基酸序列，可推酸序列，可推导出出为该多多肽编码的核苷酸短序的核苷酸短序列，再用列，再用DNA合成合成仪人工合成目的基因。人工合成目的基因。适用于合成适用于合成分子量分子量较小小的目的基因的目的基因（100bp以以内）。内）。如：人生如：人生长激素激素释放因子、血管加放因子、血管加压素、干素、干扰素、胸腺素及胰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。素原的基因等。3）人工合成）人工合成DNA片段片段60根据染色体根据染色体DNA的限制性内切的限制性内切酶图谱，用适当的限制，用适当的限制性内切性内切酶切割染色体切割染色体DNA、分离目的基因。、分离目的基因。适用于制适用于制备原核生物原核生物目的基因，因目的基因，因为：真核真核细胞染色体胞染色体DNA有丰富的内含子，它有丰富的内含子，它们在原核在原核细胞中胞中转录后不能被剪接。后不能被剪接。真核真核细胞的基因多数胞的基因多数为单拷拷贝，难以分离到足以分离到足够量的量的目的基因。目的基因。4）直接从染色体）直接从染色体DNA中分离目的基因中分离目的基因61根据外源根据外源DNA的特性和受体的特性和受体细胞的特性胞的特性选择合合适的适的载体。体。2、载体的选择载体的选择621)1)粘性末端粘性末端连接接3、目的基因和载体的连接、目的基因和载体的连接本法适用于在质粒和目的本法适用于在质粒和目的基因上有基因上有相同相同单或双单或双酶切酶切位点。位点。63粘性末端粘性末端DNA重组体的构建重组体的构建 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 3 HO-G CTTAA-p 5 5 p-AATTC G-OH 3 质粒质粒 目的基因目的基因 目的基因目的基因和载体连接和载体连接 EcoR EcoR 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 3 HO-G CTTAA-OH 5 5 HO-AATTC G-OH 3 退火退火 DNA连接酶连接酶 3 HO-G CTTAA G CTTAA-p 5 5 p AATTC G AATTC G-OH 3 642)2)平末端连接平末端连接质粒和目的基因上没有相同的酶切位点质粒和目的基因上没有相同的酶切位点质粒质粒产生产生平末端平末端的的内切酶内切酶DNA连接酶连接酶目的基因目的基因目的基因目的基因产生产生粘性末粘性末端端的的内切酶内切酶产生产生粘性末粘性末端端的的内切酶内切酶核酸酶核酸酶S1核酸酶核酸酶S165人工接人工接头本法适用于在本法适用于在质粒和目的基质粒和目的基因上因上没有相同没有相同的酶切位点。的酶切位点。66本法适用于在本法适用于在质粒和目的基质粒和目的基因上因上没有相同没有相同的酶切位点。的酶切位点。通过同聚尾连接通过同聚尾连接67质粒质粒 目的基因目的基因 3 3 3 ACGTC G 5 5 G CTGCA 3 3 GnGGGACGTC G 5 5 G CTGCAGGGGn 3 3 CnCCC 5 5 CCCCn 3 末端转移酶末端转移酶 dGTP 末端转移酶末端转移酶 dCTP 混合，退火混合，退火 1）转化细菌）转化细菌2）体内修复）体内修复同聚尾连接法构建同聚尾连接法构建 DNA重组体重组体G CCCC GGGGACGTC CTGCAGGGG CCCC G Pst 核酸外切酶核酸外切酶 目的基因和目的基因和载体连接载体连接GACGT C CTGCA GG ACGTC C TGCAG CCC GGG GGG CCC Pst Pst 684、重组、重组DNA导入受体细胞导入受体细胞常用的受体常用的受体细胞是胞是大大肠杆菌杆菌。转化化（transformation）：是指）：是指以以质粒粒DNA或或以它以它为载体构建的重体构建的重组子子导入入细菌的菌的过程。程。感受感受态细胞胞(competent cell)：细胞膜胞膜结构改构改变、通透性增加并具有通透性增加并具有摄取外源取外源DNA能力的能力的细胞。胞。69制备感受态细胞的基本方法制备感受态细胞的基本方法CaCl2处理，增加大理，增加大肠杆菌杆菌细胞膜通透性。胞膜通透性。电击法，高法，高压脉冲使脉冲使细胞膜形成胞膜形成暂时性微孔。性微孔。701 1）重重组体的体的筛选根据根据载体的抗体的抗药性性标志志筛选 大多数大多数质粒粒载体体带有有抗生素抗性基因抗生素抗性基因（如（如Ampr、Tetr等），等），当当带有完整抗性基因的有完整抗性基因的载体体转化无抗性化无抗性细菌后，菌后，被被转化的阳性菌化的阳性菌获得抗得抗生素抗性基因而存活并形成菌落，生素抗性基因而存活并形成菌落，未未转化菌不化菌不能存活，但能存活，但应排除未重排除未重组的空的空载体。体。5、重组体的筛选和鉴定、重组体的筛选和鉴定71根据载体抗药性标志插入失活选择根据载体抗药性标志插入失活选择某些某些质粒粒载体如体如 pBR322质粒中有粒中有Ampr和和Tetr 抗性基抗性基因，在因，在这两个基因中装有几个常用的两个基因中装有几个常用的MCS，如将外源，如将外源DNA片段插入片段插入BamH识别序列序列时，则此此质粒由粒由Tetr变为对四四环素敏感（素敏感（Tets）。）。这种重种重组子子导入宿主菌后，宿主菌在含四入宿主菌后，宿主菌在含四环素素琼脂糖平脂糖平皿上不能生皿上不能生长而在含氨而在含氨苄青霉素的平皿上能青霉素的平皿上能够生生长。在。在含四含四环素和氨素和氨苄青霉素的平皿上都能青霉素的平皿上都能够生生长的的细菌只含菌只含有空有空载体，此体，此筛选方法称方法称为双抗生素双抗生素筛选法法。72双抗生素筛选法双抗生素筛选法73-半乳糖苷酶基因失活筛选（半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选法蓝白斑筛选法）某些某些质粒粒载体体带有大有大肠杆菌乳糖操杆菌乳糖操纵子的子的lacZ 基因，基因，该基因含一段基因含一段编码-半乳糖苷半乳糖苷酶氨基末端氨基末端145个氨基酸个氨基酸-肽的的DNA片段，片段，IPTG可可诱导此片段合成，此片段能此片段合成，此片段能与宿主与宿主细胞所胞所编码的缺陷型的缺陷型-半乳糖苷半乳糖苷酶实现基因内基因内-互互补，形成完整的，形成完整的-半乳糖苷半乳糖苷酶，催化指示，催化指示剂底物底物X-gal 形成形成蓝色色产物，物，结果重果重组克隆呈克隆呈蓝色菌落。色菌落。当外源基因插入当外源基因插入lacZ 基因中基因中MCS，lac -肽基因基因阅读框架被破坏，框架被破坏，细菌内将无菌内将无-半乳糖苷半乳糖苷酶活性，活性，结果重果重组克隆呈白色菌落，克隆呈白色菌落，这是常用的是常用的蓝白斑白斑筛选法法。7475根据插入的外源性基因的性状进行筛选根据插入的外源性基因的性状进行筛选当当细胞生物合成途径中某个胞生物合成途径中某个酶的的编码基因失活基因失活后，后，该细胞成胞成为营养缺陷型养缺陷型，如，如导入入细胞的重胞的重组DNA能弥能弥补缺陷的基因，那么培养基中就不缺陷的基因，那么培养基中就不需需补充有关的充有关的营养成分，由此可挑养成分，由此可挑选出含重出含重组DNA的阳性的阳性细菌。菌。76核酸杂交技术筛选核酸杂交技术筛选 将将转化化细菌平板菌平板转移至硝酸移至硝酸纤维素薄膜上，素薄膜上，应用用特异性的核酸探特异性的核酸探针对其其进行原位行原位杂交，可交，可筛选出阳性克隆。出阳性克隆。对于噬菌体于噬菌体载体的克隆，此法也可通体的克隆，此法也可通过噬菌斑噬菌斑的原位的原位杂交交筛选阳性克隆。阳性克隆。通通过斑点斑点杂交和交和Southern blot杂交技交技术筛选。772）重组体的鉴定）重组体的鉴定根据重根据重组子大小子大小鉴定定 重重组子装有外源子装有外源DNA，分子量，分子量较原原载体大得体大得多，从挑多，从挑选的菌落中分的菌落中分别提取重提取重组DNA和原和原载体体DNA，直接，直接进行行电泳，泳，原原载体体DNA分子分子量量较小、小、电泳迁移率泳迁移率较大；大；而而重重组DNA因分因分子量子量较大而迁移率大而迁移率较小小。78酶切鉴定酶切鉴定分分别提取重提取重组载体体DNA和原和原载体体DNA，根据已，根据已知外源基因两端的知外源基因两端的酶切位点，分切位点，分别用相用相应的内的内切切酶进行切割，行切割，经琼脂糖凝胶脂糖凝胶电泳后，只出泳后，只出现一条区一条区带的是原的是原载体本身，而体本身，而重重组载体体还多一多一条条外源外源DNA片段的区片段的区带，可根据，可根据DNA mark来来分析插入分析插入DNA片段的分子量。片段的分子量。79PCR鉴定鉴定提取重提取重组子子DNA，利用插入外源基因两端互，利用插入外源基因两端互补的特异引物，的特异引物，对重重组子子DNA进行行PCR扩增。此增。此法不法不仅可分离可分离扩增目的基因，增目的基因，还可可对目的基因目的基因进行行测序。序。80DNA序列分析鉴定序列分析鉴定DNA序列分析是确定分离的序列分析是确定分离的DNA是否是特异的是否是特异的外源性插入外源性插入DNA的唯一方法（的唯一方法（金金标准准），也是），也是最确定的方法。最确定的方法。自自动化，快速、化，快速、简便和便和实用。用。818 核酸分子杂交核酸分子杂交8.1 核酸核酸杂交基本原理交基本原理8.2 核酸探核酸探针技技术8.3 核酸分子核酸分子杂交技交技术8.4 基因芯片基因芯片82核酸定性或定量核酸定性或定量检测基因克隆、突基因克隆、突变及其表达研究及其表达研究疾病的疾病的临床床诊断断主要用途主要用途838.1 核酸杂交基本原理核酸杂交基本原理核酸核酸变性性核酸复性核酸复性核酸分子核酸分子杂交交848.1.1 核酸变性核酸变性变性性（denaturation）：在某些理化因素的作：在某些理化因素的作用下，用下，维系系DNA分子二分子二级结构的构的氢键和碱基堆和碱基堆积力受到破坏，力受到破坏，DNA由双螺旋由双螺旋变成成单链过程。程。化学化学键变化：化：维持双螺旋持双螺旋稳定的定的氢键和疏水和疏水键发生断裂，生断裂，断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆断裂可以是部分的或全部的，可以是可逆的或是非可逆的。的。化学化学结构构变化：化：DNA变性改性改变了其空了其空间结构，不涉及到构，不涉及到其一其一级结构的改构的改变。8586DNA的变性因素的变性因素凡能破坏双螺旋凡能破坏双螺旋稳定性的因素都可以成定性的因素都可以成为变性性的条件。的条件。加加热极端的极端的pH有机有机试剂（甲醇、乙醇、尿素、甲（甲醇、乙醇、尿素、甲酰胺等）胺等）87变性变性DNA的理化性质的理化性质溶液黏度降低：溶液黏度降低：DNA双螺旋是双螺旋是紧密的密的“刚性性”结构，构，变性后代之以性后代之以“柔柔软”无无规则单股股线性性结构，构，DNA黏度明黏度明显下降。下降。溶液旋光性溶液旋光性发生改生改变：变性后性后DNA分子的分子的对称性及称性及局部构型改局部构型改变。紫外吸收增加紫外吸收增加：DNA变性后，性后，DNA 溶液的紫外吸收溶液的紫外吸收增增强。双双链DNA单链DNA单核苷酸核苷酸88增色效应增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260增高的现象。增高的现象。89解链曲线解链曲线q通常利用通常利用DNA变性后在波性后在波长260nm处吸光度（吸光度（A260）的增加来的增加来监测DNA变性的性的过程。如果以温度程。如果以温度对A260的的关系作关系作图，所得的曲，所得的曲线称称为解解链曲曲线。典型。典型DNA变性曲性曲线呈呈S型。型。90融解温度融解温度融解温度融解温度（melting temperature，Tm）：在）：在热变性性过程中，紫外吸收增加达到最大程中，紫外吸收增加达到最大值的的50%时的温度称的温度称为DNA的解的解链温度或融解温度。温度或融解温度。爆爆发式式：热变性是在性是在变性温度范性温度范围内突内突发的的跃变过程，很像程，很像结晶达到熔点晶达到熔点时的融化的融化现象，故象，故名融解温度。名融解温度。狭窄性狭窄性：变性温度范性温度范围很小。很小。91Tm的影响因素的影响因素1.DNA分子大小和碱基的分子大小和碱基的组成成2.溶液的离子溶液的离子强度度3.pH值4.变性性剂921、DNA分子大小和碱基的组成分子大小和碱基的组成qDNA的均一性的均一性碱基碱基组成的均一性成的均一性样品品组成的均一性成的均一性qDNA的（的（G+C）含量）含量93DNA的（的（G+C）含量）含量在溶在溶剂固定的前提下，固定的前提下，Tm值的高低取决于的高低取决于DNA分子分子中的（中的（G+C）的含量。）的含量。（G+C）含量越高，）含量越高，G-C 碱基碱基对越多，越多，Tm值越高。越高。核苷酸核苷酸20bp：Tm=4（G+C）+2（A+T）94952、溶液的离子强度、溶液的离子强度溶液中离子与溶液中离子与DNADNA分子中磷酸基分子中磷酸基团形成离子形成离子键，需要，需要较高温度才能使高温度才能使DNADNA变性。性。离子离子强度度较