极端红曲霉高粱发酵产物的抗氧化性和抗炎性.pdf

师建全，王凯，肖冬，等.极端红曲霉高粱发酵产物的抗氧化性和抗炎性 J.食品工业科技，2023，44（20）：152161.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023020111SHIJianquan,WANGKai,XIAODong,etal.FermentedProductsofExtremeMonascusandSorghumandItsAntioxidantandAnti-inflammatoryPropertiesJ.ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2023,44(20):152161.(inChinesewithEnglishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023020111 生物工程 极端红曲霉高粱发酵产物的抗氧化性和极端红曲霉高粱发酵产物的抗氧化性和抗炎性抗炎性师建全1，王凯1，肖冬1，郑羽西2,*，阴耕云1，李焞3（1.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明650231；2.茅台学院，贵州仁怀564500；3.上海全丽生物科技有限公司，上海200000）摘要：极端微生物从毛红曲霉 Monascus pilosusYX-1125 分离于白酒酿造环境中，该菌种被发现能够以高粱为底物进行生长，并能够耐受多重极端环境胁迫。基于此，本文开发出一种新型的源自该菌种与高粱的发酵滤液（Mon-ascusandSorghumFermentationFiltrate，MSFF），并研究了其成分、安全性和生物活性。结果表明，MSFF 富含丙酸、丁酸、乙酸等多种短链脂肪酸，以及酚类化合物（大于 7.0mg/mL）和 17 种氨基酸（大于 7.5mg/mL）等生物活性物质，且具有较强的复合抗氧化潜力，80%浓度 MSFF 的二苯代苦味肼基自由基清除率 67.3%、铜螯合率 59.71%，铁螯合率 42.62%，羟自由基清除率 83.31%和超氧自由基清除率 55.8%，且铁离子还原能力相当于1.24mmoLFeSO4/mL。体外实验结果揭示 1%（v/v）的 MSFF 即可通过减少 81.4%细胞凋亡、清除 35.8%胞内活性氧、抑制最高 83.2%的促炎症因子的释放（白介素-6 和-8）和下调最高 42.5%基质金属蛋白酶的表达（金属硫蛋白酶-1 和-9）等多种方式抑制炎症反应及其带来的损伤。安全性测试证实了 MSFF 有很高的细胞相容性。综上所述，MSFF 是一种安全高效的抗氧剂与抗炎症原料，在健康食品与皮肤护理领域拥有巨大的应用潜力。关键词：抗氧化性，极端微生物，红曲霉，抗炎症，发酵产物，短链脂肪酸，酚类物质本文网刊:中图分类号：Q815；TS213文献标识码：A文章编号：10020306（2023）20015210DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023020111FermentedProductsofExtremeMonascusandSorghumandItsAntioxidantandAnti-inflammatoryPropertiesSHIJianquan1，WANGKai1，XIAODong1，ZHENGYuxi2,*，YINGengyun1，LIChun3（1.TechnologyCentreofChinaTobaccoYunnanIndustrialCo.,Ltd.,Kunming650231,China；2.MoutaiInstitute,Renhuai564500,China；3.ShanghaiLiBiologicalTechnologyCo.,Ltd.,Shanghai200000,China）Abstract：ExtremophilestrainMonascuspilosusYX-1125wasisolatedfromthebaijiu-makingenvironment.Itwasfoundthatthisstraincouldusesorghumassubstrateandcouldtoleratemultipleextremeenvironmentalstress.Basedonthis,MonascusandSorghumFermentationFiltrate(MSFF)derivedfromthisstrainwasdeveloped,anditscomposition,safety,and bioactivity were studied.Research findings revealed that MSFF was abundant in various bioactive substances,includingshort-chainfattyacidssuchaspropionicacid,butyricacid,andaceticacid,phenoliccompounds(greaterthan7.0mg/mL)and17aminoacids(greaterthan7.5mg/mL),andhadstrongantioxidantpotentials(80%concentrationof收稿日期：20230213基金项目：国家自然科学基金项目（52160006）；贵州省教育厅重点领域项目（KY（2020）045 号）；云南中烟工业有限责任公司科技计划项目（2021CL04）；茅台学院科学学者研究基金资助。作者简介：师建全（1969），男，本科，研究方向：食品微生物，E-mail：。*通信作者：郑羽西（1987），男，博士，副教授，研究方向：极端微生物及其资源化利用，E-mail：。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTechnologyofFoodIndustryOct.2023MSFFwithDPPHscavenging67.3%,copperchelation59.71%,ironchelation42.62%,hydroxylscavenging83.31%,superoxidescavenging55.8%,andferricionreducingantioxidantpower1.24mmoLeqFeSO4/mL).Theresultsofin vitroexperiments revealed that 1%(v/v)MSFF could inhibit inflammation and reduce its damage by reducing 81.4%cellapoptosis,removing 35.8%intracellular reactive oxygen species,inhibiting the release of proinflammatory cytokines(interleukins-6and-8)upto83.2%anddown-regulatingtheexpressionofmatrixmetalloproteinases(MMP-1andMMP-9)upto42.5%.ThesafetytestconfirmedthatMSFFhadhighcytocompatibility.Inconclusion,MSFFwasasafeandhighlyeffectiveantioxidantandanti-inflammatoryingredient,whichhadgreatpotentialapplicationsinthefieldsofhealthfoodandskincare.Key words：antioxidant；extremophiles；Monascus；anti-inflammatory；fermentation products；short chain fatty acids；phenoliccompounds极端环境下生长的微生物，为了适应生存，经自然选择，通常具有独特的菌体结构、响应机制和代谢系统，以应答因强烈胁迫因子带来的高水平氧化应激（oxidativestress，OS）1。从生物技术的角度来看，这种代谢系统和基因表达的可塑性使得极端微生物应用前景广阔，因为它们能够适应不利的环境，并在特定条件下提供高效、丰富和独特的代谢产物2。极端微生物发酵产物在对抗环境胁迫诱导的 OS 方面的巨大潜力，引起了全球学者的广泛关注，但是目前研究主要集中于环境领域3-4。由于其独特的口感和高品质，酱香白酒（Moutai-flavorBaijiu,MFB）已成为中国最受欢迎的酒类种类，并成为了中国文化和日常生活中不可替代的一部分5。作为 MFB 最著名的产地，中国贵州省茅台镇拥有持续数百年的酿酒历史。MFB 独特的胁迫式发酵工艺长期对本地酿酒微生物进行驯化，促成了以高盐度（酿造环境中由于底物的反复添加而导致盐分的富集）、高酸度和高酒精度为特征的酿酒微生态环境6中富集了多种独特的极端微生物，而这些特殊的菌群也赋予了 MFB 独一无二的酱香风格。除此之外，这些极端微生物的发酵产物也被广泛报道含有大量的生物活性物质，如有机酸、多酚、黄酮、氨基酸、三萜类、维生素等7-8，这些活性物质都被广泛应用于医药、化妆品、保健食品和其它健康产品。通过深入挖掘 MFB 酿造环境的微生物资源，在之前的研究中成功分离并报道了一株编号 YX-1125的极端丝状真菌6。经真菌形态鉴定与 ITS 和 BenA序列分析，确定为丛毛红曲菌（Monascus pilosus）。值得注意的是，通过调节发酵条件至接近 MFB 极端酿造环境，该菌种短链脂肪酸（SCFAs）产量（19.8g/L）实现了目前同类文献报道最高水平6。许多文章证实了微生物来源的 SCFAs 对人体的有益作用，包括缓解炎症和选择性抑制有害微生物生长等9-11。因此，在这篇研究中，基于该菌种与高粱发酵产物滤液（Monascus and Sorghum Fermentation Filtrate,MSFF）开发出了一种全新的抗氧化与抗炎症原料，并利用多项实验评估了该发酵滤液的成分、安全性与生物活性。据所知，这是极端微生物发酵产物作为生物活性成分首次被研究。1材料与方法1.1材料与仪器高粱仁怀市茅台镇产自被称为“红缨子”的有机糯高粱（贵州，中国），这种高粱是茅台镇生产酱香白酒的主要原料，总淀粉含量 83.40%，其中 96.27%为支链淀粉12-13。高粱在使用前一直保存于 4，并被粉碎为目数 100 的粉末待用；菌种 YX-1125获取于贵州省茅台镇 MFB 酿造环境中6，目前保藏于ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCenter（编号CGMCC21938）；菌株 YX-1125马铃薯葡萄糖琼脂上 30 保存 5d 后，放入冰箱 4（短期）或20（长期）保存；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，编号 KN-819）保藏于茅台学院；-淀粉酶（采用地衣芽孢杆菌诱变筛选的高产菌株，10000U/g）山东隆大生物工程有限公司；复合糖化酶（由去除转苷酶的葡萄糖淀粉酶和普鲁兰酶组成的复合型糖化酶组成，其中糖化酶是由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成，普鲁兰酶是由地衣芽孢杆菌菌种经深层发酵提炼而成，100000U/mL）山东隆大生物工程有限公司；人角质细胞（HaCaT 细胞）、小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7，目录号 BNCC342033）中科院细胞库；ELISA 试剂盒美国 Biolegend 公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）美国 Sigma-Aldrich 公司；抗-肌动蛋白、MMP-1 和MMP-9 的一抗美国 Abcam 公司；抗-肌动蛋白、MMP-1 和 MMP-9 的二抗中国 Proteintech 公司；研究中使用的所有其他化学物质均为分析纯，阿拉丁生化科技有限公司。TS-111B 恒温振荡培养箱上海善志仪器设备有限公司；10QS 鼓泡生物反应器上海保兴生物设备工程有限公司；Nicolet6700 傅立叶红外光谱仪美国赛默飞世尔科技公司；Agilent7890N 气相色谱联用配有 DB-WAX 毛细管柱（30mm0.25mm，0.25m），采用安捷伦 MSDChemStation 软件进行数据分析、1290InfinityII 高效液相色谱（HighPer-formanceLiquidChromatography,HPLC）美国安捷伦科技有限公司；HyperlabSMART 多参数生化分析仪荷兰 Biostream 公司；紫外交联仪 CL-1000美国 UVP 公司。第44卷第20期师建全，等：极端红曲霉高粱发酵产物的抗氧化性和抗炎性1531.2实验方法1.2.1菌种悬浮液的制备每个月将菌株 YX-1125（见图 1）的孢子转移到新鲜 PDA 培养基上保持活力。用无菌生理盐水洗 PDA 培养基，得到新鲜的接种孢子悬液。将制备好的孢子悬液加入到无菌种子培养基（葡萄糖 50g/L，酵母浸出粉 2.5%）中，添加无菌生理盐水将孢子浓度调节为 106个孢子/mL。在经过 30 条件下不通气、不搅拌、不摇匀的 8h 种子培养以后，菌种 YX-1125 的种子悬浮液将用于后续发酵的接种。菌种 KN-819 同样筛选于贵州省茅台镇 MFB 酿造环境中，因其具有极强的发酵产有机酸能力，被用于在预发酵为菌种 YX-1125 模拟同MFB 酿造类似的酸性胁迫环境。菌种 KN-819 平时保存于 20%甘油的储存培养基中，使用前转入 MRS培养基。在旋转摇床中维持 30 和 150r/min 进行 12h 的种子培养后，以 14000g 离心 5min，然后以无菌生理盐水洗涤 1 次，得接种悬浮液。10 mm20 m图1菌种 YX-1125 的形态特征Fig.1MorphologicalcharacteristicofstrainYX-1125注：左图标尺 10mm，右图标尺 20m。1.2.2MSFF 的生产如图 2 所示，MSFF 的生产总体来说需要液化、酸化和发酵三个阶段。第一阶段液化分为预糖化步骤和糖化步骤。简单地说，首先将蒸馏水与高粱粉末的混合物，固液比 1:10（w/v）加入摇瓶中，温度控制在 80 水浴。随后，在制备的泥浆中添加浓度为 140U/g 的-淀粉酶，并在旋转摇床中以 100r/min 的速度进行预糖化。经过 2h 的预糖化后，将浆液冷却到 60，在振荡培养箱中以140r/min 的速度用复合糖化酶（40U/g）糖化 8h，充分释放支链淀粉中的可发酵糖。酸化阶段的目的是通过菌种 KN-819 为后续胁迫式发酵营造极端酸性环境。待糖化后泥浆冷却后，加入 10%的 KN-819 接种悬浮液，在 42 的严格静止条件下培养至 pH 降至 3.5 时终止，收集液体部分用于下一步发酵阶段。最后使用发酵生产 MSFF。依据之前的研究并做小幅改动14-15，该阶段在一种改良的 5L 的鼓泡生物反应器中进行。该反应器安装了 60 个矩阵单元形成蜂窝状结构用于丝状真菌 YX-1125 的固定化。在进行 24h 的固定化培养后，种子培养基被替换为收集的酸化液体，并维持在 35，曝气量 0.5vvm和搅拌速率 160r/min 的条件下培养。96h 后，收集发酵液，并通过 1000Da 的纳滤膜过滤去除发酵液中的微生物和大分子杂质，得到 MSFF。1.2.3MSFF 的成分分析1.2.3.1傅里叶变换红外光谱（Fouriertransforminfr-ared spectroscopy，FTIR）MSFF 在 Nicolet 6700光谱仪上进行 FTIR 分析。样品在透射模式下进行分析，光谱记录在 4500400cm1范围内。在 4cm的分辨率和 1cm/s 的扫描速度的条件下扫描被收集。依据 Kadiroglu 等16的研究，在每次测量前收集背景光谱。1.2.3.2气质联用（Gaschromatographymassspectro-metry，GC-MS）采用 GC-MS 分析 MSFF，特别是其中的有机酸构成，依据 Mellinas 等17的研究并有一些改动。以二氯甲烷为溶剂进行液-液萃取，获取有机相。采用 Agilent7890N 气相色谱联用 5977B四极质谱（MS），在电子冲击（EI）电离模式（70eV）下进行 MSFF 中活性物质的鉴定。通过与美国国家标准与技术研究院（NationalInstituteofStandardsand菌种KN-819L.plantarumpH3.580%细胞存活）。因此，使用这三种浓度的 MSFF 进行进一步实验。为研究 MSFF 对细胞活力的影响，用 MSFF 预处理RWA264.7 细胞，再引起细胞的炎症反应。如图 5B所示，与未产生炎症的细胞相比，炎症反应显著降低细胞的活力至 55.4%。用 0.5%的 MSFF 预处理细胞，可使炎症细胞活力提高至 81.4%。此外，细胞活力的提升呈浓度依赖性。因此，结果数据表明，MSFF 在 1.0%浓度下无细胞毒性且可以有效地减少炎症引起的细胞凋亡。2.3.2MSFF 对炎症产生的活性氧清除效果炎症可诱导活性氧过度产生，进而激发光老化进程。因此，通过监测细胞内活性氧生成来研究 MSFF 对炎症诱导的 RAW264.7 细胞氧化应激的影响。采用DCF-DA 荧光探针检测细胞内活性氧的生成。如图 5C 所示，炎症细胞的活性氧荧光强度（171.5%）明显高于非紫外线照射细胞（100%）。然而，MSFF 处理细胞后，炎症细胞内活性氧均减少到 130%以下，且呈浓度依耐性。相比炎症细胞，1.0%的 MSFF 处理细胞下降了 35.8%（171.5%vs.110.1%）。这些结果表明，MSFF 具有减少细胞中活性氧生成的能力。该实验结果也与 2.2 体外实验中 MSFF 具有较强的抗氧化活性的结果一致。2.3.3MSFF 减少促炎症细胞因子的效果长期炎症会增加促炎症介质的产生，如白细胞介素-1（IL-1）、IL-1、IL-6、IL-8、前列腺素 E2 和一氧化氮38。为了分析 MSFF 是否能够抑制促炎症介质的产生，研究了 LPS 刺激下 IL-6、IL-8 等促炎症细胞因子的表达水平。总的来说，LPS 刺激上调了诱导炎症和光老化的促炎症细胞因子的表达，如图 6A 和图 6B 所示。与阴性对照相比，在RAW264.7 细胞中加入MSFF可以显著抑制 LPS 刺激引发的 IL-6 表达，且呈剂量依赖的方式，其中 1.0%的 MSFF 对 IL-6 的抑制效果达到了 83.2%。此外，MSFF 在 0.1%、0.5%和 1.0%的浓度下对 LPS 引发的 IL-8 的抑制作用也逐渐加强，呈现剂量依赖的现象。这些结果表明 MSFF 可通过降低促炎症细胞因子含量有效抑制炎症的生成。2.3.4MSFF 减少炎症引起的金属硫蛋白酶（Matrixmetalloproteinases，MMPs）效果实验评估了 0.1%、0.5%和 1.0%的 MSFF 是否能够减弱 UV 引起的MMP-1 和 MMP-9 的表达来测试其对炎症引发的皱纹与皮肤结构破坏的缓解效果，并与视黄酸（Retinoicacid,RA）在 10mol/L 剂量下进行对比。除了对照组，其余各组均用剂量为 5J/cm2的 UV 照射处理。图 6C 和图 6D 显示了 MMPs 的表达结果，MMP-1表达水平在 UV 照射后显著提高至 267.2%，但在对照0.1%00.5%1.0%MSFF处理100500白介素-8生成(%)#*100500对照0.1%00.5%1.0%MSFF处理白介素-6生成(%)#*对照0.1%00.5%1.0%RAMSFF处理#*3002001000金属硫蛋白酶-1表达(%)对照0.1%00.5%1.0%RAMSFF处理#*2001000金属硫蛋白酶-9表达(%)图6MSFF 体外抗炎评价Fig.6In vitroassessmentoftheanti-inflammatoryofMSFF注：A 表示 0.1%、0.5%和 1%MSFF 对炎症诱导细胞中 IL-6 产生的影响；B 表示 0.1%、0.5%和 1%MSFF 对炎症诱导细胞中 IL-8 产生的影响；图 C 表示 0.1%、0.5%和 1%MSFF和 10mol/L 视黄酸对诱导炎症的细胞 MMP-1 表达的影响；D 表示 0.1%、0.5%和 1%MSFF 和 10M 视黄酸对诱导炎症的细胞 MMP-9 表达的影响；-actin 作为内部对照；*表示相比无添加 MSFF 组具有显著性，P0.05；#表示相比对照组具有显著性，P0.05。158食品工业科技2023 年10月MSFF 和 RA 处理后 UV 引起的 MMP-1 的表达均有显著的下调（P0.05），这表明 MSFF 在这两种细胞中具有较高的细胞相容性。3讨论与结论缓解炎症和氧自由基对身体损害一直是人们积极追求的目标。微生物发酵产物一直以来因其温和、安全和高功效而备受关注，并被广泛用于食品、药品或护肤品领域39-40。本文中，一种新型的极端微生物 YX-1125 与高粱的发酵产物滤液（MSFF），因其具有抗氧化和抗炎症潜力而被研究。实验结果显示MSFF 因其高抗氧化活性，可以减少细胞凋亡、氧化还原失衡、促炎症细胞因子的产生和 MMPs 的表达。该研究首次证实了极端微生物发酵产物能够应用于健康领域，用于抵御氧自由基和炎症对机体的损害。炎症诱导可通过触发不同的细胞信号通路激活MAPKs 和 NF-B，从而触发 MMPs 的表达。MMP负责降解细胞外基质（ECM）蛋白，如胶原蛋白、纤维连接蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖，导致皮肤的老化与结果破坏41。MMPs是一种内肽酶，在炎症过程中起着关键作，其中 MMP-1（胶原酶）和 MMP-9（明胶酶）分解了大部分 ECM，其过量表达是老化、皱纹与疾病形成的主要原因42-43。本研究结果显示 MMP-1和 MMP-9 的表达在紫外照射以后的 HaCaT 细胞中都提高了，但是在 MSFF 与视黄酸（RA）处理以后均有显著性的下调（P0.05）。这些结果表明 MSFF 通过下调 MMPs 的表达，来防止炎症导致的疾病和损害。类似的，许多以前的研究也致力于研究如何抑制 MMPs 的表达。Lin 等44利用 Pholiota nameko多糖（PNPs）降低了人真皮细胞中的 MMP-1、MMP-3和 MMP-9 的蛋白表达，显著减弱炎症诱导的细胞衰老，证明了其抗光老化潜力。Karapetsas 等45研究了希腊蜂蜜提取物对 UVB 处理的 HaCaT 细胞的影响，结果表明蜂蜜提取物能够显著提高 MMPs 的表达，实现抗老化的目的，该结果也在重组皮肤模型中得到印证。细胞凋亡是炎症的公认标志。炎症诱导的氧化应激过程中，细胞内氧化还原平衡的丧失导致细胞损伤，最终导致细胞凋亡。大量证据表明，炎症诱导皮肤细胞凋亡是由线粒体（内在）和死亡受体（外在）通路46共同作用的。Wang 等47测试了 PrinsepiaeNux提取物对细胞炎症的影响，结果表明炎症诱导的核因子相关因子 2（Nrf2）和血红素氧合酶 1（HO-1）缺失、活性氧过量产生以及促炎症介质基因上调均有不同程度的逆转，有效保护了细胞免受炎症的损伤。在本研究中，MSFF 同样被证明能够有效减少炎症诱导的细胞凋亡，降低 IL-6、IL-8 等促炎症细胞因子的表达水平，且呈剂量依赖。1.0%的 MSFF 可下调高达 80%以上的 UVB 引发的促炎症细胞因子，远远高于以上提到的所有文献，显示出 MSFF 十分优秀的抗炎症潜力，这可能和 MSFF含有丰富的SCFAs 和酚类物质等活性物质有关。参考文献1 KRGER A,SCHFERS C,SCHRDER C,ANTRANI-KIANG.Towardsasustainablebiobasedindustry-HighlightingtheimpactofextremophilesJ.NewBiotechnology，2018，40：144153.2CHENGQ,JIANGXR.Nextgenerationindustrialbiotech-nologybasedonextremophilicbacteriaJ.CurrentOpinioninBio-technology，2018，50：94100.3WENTZELLCP,INFORSATOFJ,MONTOYAQV,etal.Fungifromadmiraltybay(kinggeorgeisland,antarctica)soilsandmarinesedimentsJ.MicrobialEcology，2019，77（1）：1224.4HUANGJL,WANGHH,etal.Granulationofhalophilicsludge inoculated with estuarine sediments for saline wastewatertreatmentJ.Science of the Total Environment，2019，682（10）：532540.5DAIY,TIANZ,MENGW,LIZ.Microbialdiversityandphysicochemicalcharacteristics of the Maotai-flavored liquor fer-mentationprocessJ.JournalofNanoscienceandNanotechnology，2020，20：40974109.6ZHENGYX,ZHANGTY,LUY,etal.Monascus pilosusYX-1125:An efficient digester for directly treating ultra-high-strengthliquorwastewaterandproducingshort-chainfattyacidsun-der multiple-stress conditionsJ.Bioresource Technology，2021，331：125050.7PENGL,KONGX,WANGZ,etal.Baijiuvinasseasanewsourceofbioactivepeptideswithantioxidantandanti-inflammatoryactivityJ.FoodChemical，2021，339（1）：128159.8WANGY,LIUH,ZHANGD,etal.BaijiuvinasseextractscavengesglyoxalandinhibitstheformationofN-carboxymethy-llysineindairyfoodJ.Molecules，2019，24（8）：1526.9LIOYD-PRICEJ,ARZEC,ANANTHAKRISHNANAN,etal.Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatoryboweldiseasesJ.Nature，2019，569（7758）：655662.10MULLERPA,SCHNEEBERGERM,MATHEISF,etal.Microbiotamodulatesympatheticneuronsviaagut-braincircuitJ.Nature，2020，583：441446.第44卷第20期师建全，等：极端红曲霉高粱发酵产物的抗氧化性和抗炎性15911SHAHABRL,BRETHAUERS,DAVEYMP,etal.Ahet-erogeneousmicrobialconsortiumproducingshort-chainfattyacidsfromlignocelluloseJ.Science，2020，369（6507）：1073.12SHENS,HUANGR,LIC,etal.PhenoliccompositionsandantioxidantactivitiesdiffersignificantlyamongsorghumgrainswithdifferentapplicationsJ.Molecules，2018，23（5）：1203.13ZHOUL,WANGC,GAOX,etal.Genome-widevariationsanalysisofsorghumcultivarHongyingziforbrewingMoutailiquorJ.Hereditas，2020，157：19.14ZHENGYX,WANGYL,PANJ,etal.Semi-continuousproduction of high-activity pectinases by immobilized Rhizopusoryzaeusingtobaccowastewaterassubstrateandtheirutilizationinthehydrolysisofpectin-containinglignocellulosicbiomassathighsolidcontentJ.BioresourceTechnology，2017，241：11381144.15ZHENGYX,WANGYL,ZHANGJR.etal.Usingtobac-cowasteextractinpre-culturemediumtoimprovexyloseutilizationfor L-lactic acid production from cellulosic waste by RhizopusoryzaeJ.BioresourceTechnology，2016，218：344350.16KADIROLUP.FTIRspectroscopyforpredictionofquali-typarametersandantimicrobialactivityofcommercialvinegarswithchemometricsJ.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture，2018，98：41214127.17MELLINASC,SOLABERRIETAI,PELEGRNCJ,etal.Valorizationofagro-industrialwastesbyultrasound-assistedextrac-tionasasourceofproteins,antioxidantsandcutin:Acascadeap-proachJ.Antioxidants(Basel),2022,11(9):1739.18DIAVP,WANGZ,WESTM,etal.Processingmethodandcorncultivaraffectedanthocyaninconcentrationfromdrieddistill-ersgrainswithsolublesJ.JournalofAgriculturalandFoodChem-istry，2015，63：32053218.19DIAVP,PANGLOLIP,JONESL,etal.Phytochemicalconcentrationsand biological activities of Sorghum bicolor alco-holicextractsJ.FoodFunction，2016，7：34103420.20HERALDTJ,GADGILP,PERUMALR,etal.High-throug-hputmicro-plateHCl-vanillinassayforscreeningtannincontentinsorghumgrainJ.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture，2014，94：21332136.21GULLONB,GULLONP,L-CHAUTA,etal.Optimiza-tionofsolventextractionofantioxidantsfromEucalyptusglobulusleavesbyresponsesurfacemethodology:Characterizationandas-sessmentoftheirbioactivepropertiesJ.IndustrialCropsandProd-ucts，2017，108：649659.22 ORELLANA E A,KASINSKI A L.Sulforhodamine B(SRB)assayincellculturetoinvestigatecellproliferationJ.Bio-protocol，2016，6（21）：e1984.23HEY,HUY,JIANGX,etal.Cyanidin-3-O-glucosidein-hibitstheUVB-inducedROS/COX-2pathwayinHaCaTcellsJ.JournalofPhotochemistryandPhotobiologyB，2017，177：2431.24FERNANDOPMDJ,PIAOMJ,KANGKA,etal.Ros-marinicacidattenuatescelldamageagainstUVBradiation-inducedoxidativestressviaenhancingantioxidanteffectsinhumanHaCaTcellsJ.BiomoleculesandTherapeutics，2016，24（1）：7584.25HONGS,PANGLOLIP,PERUMALR,etal.Acompara-tivestudyonphenoliccontent,antioxidantactivityandanti-inflam-matory capacity of aqueous and ethanolic extracts of sorghum inlipopolysaccharide-inducedRAW264.7macrophagesJ.Antioxi-dants，2020，9（12）：1297.26CHOWK,KIMH,KIMS,SEOHH,etal.Anti-agingef-fects of Leontopodium alpinum(Edelweiss)callus culture extractthroughtranscriptomeprofilingJ.Genes，2020，11（2）：230.27DAMASCENOGAB,BARRETOSMAG,REGINAL-DOFPS,etal.Prosopis julifloraasanewcosmeticingredient:De-velopmentandclinicalevaluationofabioactivemoisturizingandanti-aging innovative solid coreJ.Carbohydrate Polymer，2020，233：115854.28DOMNGUEZMARTNEZI,MEZA-MRQUEZOG,OS-ORIO-REVILLAG,etal.Determinationofcapsaicin,ascorbicacid,totalphenoliccompoundsandantioxidantactivityofCapsicum an-nuumL.var.serranobymidinfraredspectroscopy(Mid-FTIR)andchemometricanalysisJ.JournaloftheKoreanSocietyforAppliedBiologicalChemistry，2014，57（1）：133142.29ROS-REINAR,CALLEJNRM,OLIVER-POZOC