激酶筛选在药物研发中检测手段及应用.pdf

195临床研究 2023 年 11 月第 31 卷第 11 期作者简介：赵亚，本科。研究方向：新药研发早期筛选。Med,2001,16(9):606-613.50PLUMMER F,MANEA L,TREPEL D,et al.Screening for anxiety disorders with the GAD-7 and GAD-2:a systematic review and diagnostic metaanalysisJ.Gen Hosp Psychiatry,2016,39:24-31.51YANG Y A,DING R J,HU D Y,et al.Reliability and validity of a Chinese version of the HADS for screening depression and anxiety in psycho-cardiological outpatientsJ.Compr Psychiatry,2014,55(1):215-220.52MORISKY D E,ANG A,KROUSEL-WOOD M,et al.Predictive validity of a medication adherence measure in an outpatient settingJ.J Clin Hypertens,2008,10(5):348-354.53司在霞,郭灵霞,周敏,等.修订版Morisky服药依从性量表用于抗凝治疗患者的信效度检测J.护理学杂志,2012,27(22):23-26.临床荟萃激酶筛选在药物研发中检测手段及应用赵亚男，王晶(北京爱思益普生物科技股份有限公司，北京 100023)摘要：由激酶和磷酸酶介导的可逆蛋白磷酸化在调节细胞增殖、凋亡、亚细胞易位、炎症和代谢等细胞功能方面起着关键作用。人类激酶组由 518 种蛋白激酶组成，由于蛋白结构域序列相似性，主要分成酪氨酸激酶(TK)、酪氨酸激酶样(TKL)、STE 组激酶家族(STE)、CMGC 组蛋白激酶(CMGC)、蛋白激酶 A，G，C(AGC)、非典型蛋白激酶组(PIKK)、脂质激酶(PI3K)和其他激酶组等 8 个家族，人类蛋白激酶约占总基因的 1.7%，并介导真核细胞中大多数的信号传导，通过将三磷酸腺苷(ATP)的-磷酸转移到底物蛋白上的保守丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基来调节细胞的生理过程，因此蛋白激酶成为药物筛选和药物干预的重要靶标。关键词：激酶；激酶谱；筛选方法中图分类号：R914.1文献标志码：B DOI：10.12385/j.issn.2096-1278(2023)11-0195-04Detection and Application of Kinase Screening in Drug DevelopmentZHAO Yanan,WANG Jing(Beijing Aisipu Biotechnology Co.,Ltd.,Beijing 100023,China)Abstract:Reversible protein phosphorylation mediated by kinases and phosphatases plays a key role in regulating cellular functions such as proliferation,apoptosis,subcellular translocation,inflammation,and metabolism.The human kinome is composed of 518 protein kinases,which are mainly divided into eight families due to the sequence similarity of protein structural domains:tyrosine kinase(TK),tyrosine kinase-like(TKL),STE kinase family(STE),CMGC protein kinase(CMGC),protein kinase A,G,C(AGC),atypical protein kinase group(PIKK),lipid kinase(PI3K)and other kinase groups.Human protein kinases account for about 1.7%of the total genes and mediate most of the signal transduction in eukaryotic cells.They regulate cellular physiological processes by transferring the-phosphate of adenosine triphosphate(ATP)to the conserved serine,threonine or tyrosine residues of substrate proteins.Therefore,protein kinases have become important targets for drug screening and drug intervention.Key Words:kinase;kinome;screening method1激酶筛选方法介绍由于蛋白激酶家族规模较大，从而许多针对野生激酶及突变体的高通量筛选技术已经被广泛开发。激酶作为多数细胞通路的关键调节因子，作为疾病的致病因子或治疗干预点，然而如何选择分析方式、分析平台以及分析技术也就成为了一项挑战。我们在分析过程中需要考虑成本、效率、试验方法的便捷性、低概率的假阳性和假阴性结果1。蛋白激酶代表了人类基因中最大的药物靶点。蛋白激酶的过度表达或失调导致许多疾病2。根据小分子激酶抑制剂临床试验信息3显示，目前正在探索大约 110 种新激酶作为靶点，加上大约 45 种已批准的激酶抑制剂靶点，仅占人类激酶组约 30%，这表明仍有大量可开发的激酶药物靶点。目前市面上激酶筛选根据检测方式的不同分为基于生物功能分析(Functionassay)和化合物结合竞争分析(Bindingassay)两类。激酶功能测定是基于激酶活性的测定，直接或者间接定量催化产物的生成，例如磷酸化底物、二磷酸腺苷(ADP)或者-磷酸。激酶结合试验是定量的测定小分子和激酶蛋白的结合，而不是测定磷酸化的产物，在测定目标分子结合亲和力方面是很有价值的。1.1结合的检测方法介绍及优缺点目前市面上测结合的方法有：KinomeScanTM激酶测试和 LanthaScreenTMEu 结合测试。1.1.1 Kinome ScanTM激酶测试化合物结合激酶活性位点直接或间接的阻止激酶和固定化配体结合，这将减少在固定化配体上的激酶数量4。相反不结合激酶的测试分子对在固定化载体上捕获的激酶数量没有影响。筛选结合的方式是通过使用定量的检测 DNA 标签的 qPCR 的方法。这种方法不需要三磷酸腺苷(ATP)，提供真正的热力学亲和数据，而不是 IC50(半抑制浓度)，可检测多种抑制剂类型，如型、型和变构抑制剂，有较大的检测动态范围，用于精确的亲和测量，可以测定激活状态196Clinical Research,Nov.2023,Vol.31 No.11特异性，提供抑制剂结合模式信息，数据准确并可重复。目前已经覆盖了 80%以上的人类蛋白激酶组，包括蛋白激酶 A、G、C(AGC)、钙离子(Ca2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CAMK)、CMGC组蛋白激酶(CMGC)、酪蛋白激酶 1(CK1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)、酪氨酸激酶(TK)、酪氨酸激酶样(TKL)、脂质和非典型激酶家族、病原体激酶、和重要的疾病相关突变形式。1.1.2 Lantha ScreenTMEu 结合测试LanthaScreenTMEu 结合测试是“示踪剂”和抗体与激酶的结合导致高度的荧光共振能力转移(FRET)值，使用激酶抑制因子代替“示踪剂”则可以造成低值。同其他激酶活性实验相比，此实验是简单的“混合与读取”检测，不需要展开步骤。Invitrogen 公司的激酶示踪剂是适用检测任何结合到ATP 位点或者结合到能改变 ATP 构象的异构位点化合物。结合到 ATP 位点的抑制因子包括仅结合在 ATP 位点上的型激酶抑制因子和既结合 ATP 位点也结合暴露在DFG-out(非活性构象)疏水位点的型抑制因子。与活性实验不同，激酶结合实验在激酶处于活性状态或非活性状态下都能进行，很适于检测型抑制因子。在某些情况下，除了型抑制因子，也能观察到型和型抑制因子选择性结合到特异性活性位点。可实现激酶抑制因子的灵敏检测，检测活性和非活性激酶，实时跟踪慢速结合的抑制因子，比较抑制因子开关，无底物特异性，但无法检测结合非激酶结构域的抑制剂。1.2Function 方法的介绍及优缺点功能分析平台的检测方式包括辐射、荧光、发光和迁移转移分析。具体测试方法有：Z-LYTEassay、迁 移 率 分 析(MobilityShiftassay)、均 相 时 间 分 辨 荧光(HTRF)、ADP 含 量 测 试(ADP-Gloassay)、同 位 素分析法(33PanQinaseassay)和热点分析(HotSpotassay)1.2.1Z-LYTEAssayZ-LYTEassay 基于荧光共振能量转移(FRET)的方法，不需要昂贵的放射性或抗体试剂。在多肽底物的两端分别标记了发射的供体荧光分子(香豆素)和受体荧光分子(荧光素)。在多肽底物上加上磷酸基团，特异性蛋白酶识别并切割非磷酸化的多肽底物，导致荧光共轭能量转移不再发生。而未切割的磷酸化多肽维持荧光共轭转移。使用比率法计算用于定量反应进程。比率法减少了孔间 FRET 肽浓度和信号强度的变化，使得读值稳定。Z-LYTEassay 需要合成荧光基团标记的多肽底物，可以实现化合物的快速检测开发，得到的检测结果稳定并可重复。此方法通过小型化试验来节省试剂和资金，若化合物本身有蛋白水解酶的抑制作用，可能会导致假阳性4。1.2.2MobilityShiftAssay迁移率偏移测定通过测量激酶反应中的非磷酸化和磷酸化底物直接监测磷酸化。根据选择的靶激酶评估化合物的效力和选择性。激酶反应后，部分底物被激酶加上磷酸基团成为产物，带有荧光标记的多肽底物和反应产物之间相差 3 个电荷，当进入毛细管电泳后，由于两者所携带的电荷不同而达到分离。当运行基于芯片的高通量筛选(HTS)方法分离荧光标记的多肽底物和反应产物，必须考虑为后续分析设置不同的抑制截止点，以避免失去太多潜在的靶点。同样，在命中识别和确认方面存在 30%的差异，这对使用该方法进行分析工作构成了很大的挑战，特别是对于具有溶解度问题的化合物2。1.2.3HTRFAssay在多肽底物上标记的生物素能够与 XL665 标记的链合亲和素特异性结合。镧系元素标记的特异性磷酸化抗体能识别磷酸化多肽底物并结合。就能够形成一个XL665 标记的链合亲和素，磷酸化的多肽底物以及镧系元素 Eu 标记的磷酸化抗体三者结合的复合物。由于两者的距离较短，能够形成荧光共轭能量转移。镧系元素 Eu的荧光半衰期较长，可以应用于时间分辨荧光的检测5。供体铕以隐态形式而不是螯合形式存在，其包含一个笼在三联吡啶结构中的铕离子，并避免潜在的与其他生物反应器试剂(如 Mn2+)竞争的螯合活性，并提高试剂在酸性条件下的稳定性。通过使用针对任一磷酸化底物的抗体，可以形成供体和受体。HTRF 分析具有低酶消耗和与大范围 ATP 浓度(高达 1mM)的兼容性等优点。体系稳定：一天内可随时检测，信号基本不变；无需包被，免洗 ELISA，省时省力；比值处理时可有效去除背景荧光，出现假阳性和假阴性概率降低，可去除由于天然产物自发荧光引起的背景值，但易受 ATP 酶的干扰，且不能测定细胞内激酶活性6。1.2.4ADP-GloAssay7在激酶反应后，加入 ADP-GloTM试剂消耗完剩余的ATP，再将 ADP 转化成 ATP 的同时，还使用偶联的萤光素酶/萤光素反应来检测新合成的 ATP。ADP-GloTM激酶检测试剂盒具有较宽的动态范围，即使当 ATP 的转化率很低也能产生较强信号值；非常适合于低活性激酶，比如受体酪氨酸激酶8。该试剂盒产生的假阳性率最低，Z 值大于0.8。ADP-Glo方法是一种通用的生化分析方法，可用于任何激酶和底物的组合，而不管底物的性质，如肽、蛋白质、糖和脂质。在存在荧光素酶抑制剂的情况下，反应不会产生光，这很容易被识别。1.2.5 33PanQinaseassay 和 HotSpotassay两种测定均基于33P 标记的磷酸盐从 ATP 转移到激酶底物。这些方法在磷酸化底物的保留和检测方面有所不同。HotSpotTM测定的蛋白质和肽通过在滤膜上点样反应混合物来捕获。33PanQinaseTM测定使用闪烁平板微量滴定板进行，该板涂有闪烁剂进行检测。该方法的主要优点是它是一种通用的激酶测定方法，可以不受限制地用于所有蛋白激酶。这种方法不需要任何特殊的底物标记或修饰，并且检测不受荧光化合物和未反应的放射性同位素的干扰。然而，放射性同位素的使用和过滤器洗涤和分离步骤是将该技术应用于大规模高温超导的主要限制1，HotSpot 技术是一种小型化的激酶分析平台，可以减少放射性同位素材料、激酶靶标、底物和化合物的消耗。2药物研发中激酶筛选的策略和必要性一些低选择性的抑制剂已被证明通过解除多种激酶依赖途径能有效抑制癌细胞生长，但具有优越性能的高选择性药物也被越来越多的新药研发者关注。在寻找高选择性抑制剂的过程中，针对激酶谱筛选成为一个重要197临床研究 2023 年 11 月第 31 卷第 11 期的鉴定方法，激酶谱筛选是激酶抑制剂选择性评价的重要标准9。在选择激酶谱分析筛选时，其他重要的考虑因素是分析的模式和反应进行时的 ATP 浓度。当测试少量化合物时，我们建议 IC50模式应该是首选，因为这种方法可产生更有用和更可靠的数据。相比之下，如果要测试大量化合物，研究人员可能更喜欢使用单剂量(重复)模式，以便管理分析成本。许多药物的发现项目致力于寻找激酶抑制剂。通常，这些工作包括筛选不同的小分子化合物文库，以发现抑制目的激酶的化合物。筛选和靶点验证后，需要对获得的化合物进行先导化合物优化。在此阶段，需要优化化合物的效力和选择性，以提高疗效并避免脱靶效应。由于大量的激酶在其催化域内具有序列相似性，确定激酶的选择性较困难，由此产生的脱靶抑制可能是一个重要的药物毒性或者副作用的源头。为了在效价和选择性之间找到平衡，先导化合物需要在各种筛选模型中进一步评价，激酶谱筛选就是其中重要的指标。进行广泛的激酶谱分析可以揭示其对非靶标激酶的活性，深入了解其潜在毒性和作用模式。2.1激酶筛选的必要性目前激酶药物的发现面临的最大的挑战是优化人类激酶组成员的抑制剂效价和选择性10。大多数激酶抑制剂与高度保守的 ATP 结合口袋结合，从而导致较低的选择性，这样很容易产生副作用，因此了解激酶抑制剂和激酶的结合谱是药物发现工作的首要条件11激酶谱分析旨在确定一种化合物对大量激酶的特异选择性。因此激酶谱在检测方式上适用于各种激酶，并且不受检测方式和化合物的干扰。在药物研发过程中最主要的问题就是“脱靶效应”，激酶抑制剂除了靶向激酶以外，还会同时抑制其他一些非靶向激酶从而引起的细胞毒性，因此在化合物改造过程中会增加激酶谱检测12。2.2激酶谱中激酶靶点选择的策略抑制剂药物的激酶谱结果对于解释不良反应和使药物重新利用也是非常重要的，发现具有合理选择性和多药理学特征的有效抑制剂已成为一个非常重要的但具有挑战性的研究课题13。基于激酶谱检测的需求，我司推出激酶谱检测服务。激酶谱中每一个激酶都经过酶浓度、ATP 的米氏常数(Km)、底物浓度、和其特异性选择抑制剂的 IC50检测等确定最佳反应条件，已经有明确的特异性激酶抑制剂的激酶选用其特异性激酶抑制剂建立实验模型，控制 IC50 差异与文献报道值在 5 倍以内。近些年来，传统的生化激酶分析是一个成熟的市场，在价格和服务方面竞争较大，很多公司相继推出较大的激酶谱，并在筛选和排序方面进行改进14。有研究15表明通过定义激酶的命中指数(KHI)，并根据命中激酶数量可量化激酶的选择性。随着激酶数量的增加，所得数据的平均误差会有所减小，但可以通过选择特定的激酶组合减小这种误差。使用 20 个特定激酶的激酶谱获得的误差和在随机选择 50 100 个激酶之间的激酶谱相差不大，与随机选择 20 个激酶的激酶谱相比，后者平均误差提高了 45.1%。通过这种方式建立可靠的激酶谱大小的最佳范围，不仅可以降低平均误差，并与全激酶谱结果具有较好的相关性。使用这种聚焦的激酶谱，可以可靠评估化合物的选择性。这样在药物研发的前期，评估一种化合物的选择性不需要一整个完整的激酶谱，由于野生靶点和突变之间可能存在不同的选择性，因此建议在药物研发后期使用完整的激酶谱来评估化合物的效价和选择性。当激酶谱中激酶数量是 80 时，平均误差为 6.5%，200 时，为 3.3%；300 时为 2.0%；当激酶数量为 414 时，平均误差几乎为 0.0%15。以下为在项目中检测了高选择的 FGFR4 抑制剂 BLU-554 在 0.1M 的激酶谱选择性分析和非激酶类抑制剂 BI-3406 在 1M 的激酶谱选择性分析数据。见图 1，图 2。图 1BLU-554 激酶谱树图实例图 2BI-3406 激酶谱树图实例198Clinical Research,Nov.2023,Vol.31 No.113激酶谱在新药研发中的应用激酶谱筛选目前具有广阔的应用空间，主要体现在如下几个方面：(1)激酶类抑制剂的选择性分析，这是目前应用最多一种，激酶类抑制剂在早期体外研究是需要对化合物的选择性进行检测来确定化合物的作用路径及机理，确定是高选择性抑制剂还是多靶点抑制剂，在新药申报时也需要选择性分析的数据，对于科研客户发表相关文献激酶谱数据也是非常重要的一项指标；(2)非激酶类抑制剂激酶靶点脱靶效应的分析安全性分析，对于一些药物安全性筛选是一个非常快捷考核数据；(3)对于一些在表型筛选上，例如细胞水平有着优异表现的化合物，反向找其可能的靶点。参考文献1WANG Y R,MA H.Protein kinase profiling assays:a technology reviewJ.Drug Discov Today,2015,18:1-8.2MA H,DEACON S,HORIUCHI K.The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimizationJ.Expert Opin Drug Discov,2008,3(6):607-621.3ATTWOOD M M,FABBRO D,SOKOLOV A V,et al.Trends in kinase drug discovery:targets,indications and inhibitor designJ.Nat Rev Drug Discov,2021,20(11):839-861.4潘芸芸.三种非同位素均相的激酶活性检测方法比较D.上海:上海交通大学,2017.5李洪林,徐玉芳,王婉琪,等.选择性JAK2抑制剂及其应用:CN110372664AP.2019-10-25.6邓春平,陈航,谢建华,等.均相时间分辨荧光法测定阿达木单抗结合活性J.中国医药生物技术,2022,17(2):132-137.7毛伟峰.激酶活性的分子生物学方法比较以及索拉菲尼分子机理的研究D.上海:华东师范大学,2012.8李艳霞.DY3002对肺癌EGFR T790M耐药的干预作用及机制D.沈阳:中国医科大学,2017.9王淑雨.新型微管蛋白聚合、ERK通路双重抑制剂673的抗胃癌机制研究D.郑州:郑州大学,2021.10JACOBY E,TRESADERN G,BEMBENEK S,et al.Extending kinome coverage by analysis of kinase inhibitor broad profiling dataJ.Drug Discov Today,2015,20(6):652-658.11MERGET B,TURK S,EID S,et al.Profiling prediction of kinase inhibitors:toward the virtual assayJ.J Med Chem,2017,60(1):474-485.12李玥,李会娟,高芳,等.蛋白激酶的生化活性检测方法研究进展J.生命的化学,2014,34(5):636-648.13LI X T,LI Z J,WU X L,et al.Deep learning enhancing kinome-wide polypharmacology profiling:model construction and experiment validationJ.J Med Chem,2020,63(16):8723-8737.14COMLEY J.Outsourced kinase profiling services-Adding value to in-house kinase programmesJ.Drug Discovery World,2013,14(4):26-45.15BEMBENEK S D,HIRST G,MIRZADEGAN T.Determination of a focused mini kinase panel for early identification of selective kinase inhibitorsJ.J Chem Inf Model,2018,58(7):1434-1440.本研究结果显示，出科时，观察组对激发学习兴趣、提升思维能力、提升自学能力、提升归纳总结能力、提升表达能力、提升协作能力的满意度均高于对照组，差异有统计学意义(P 0.05)。该结果说明案例教学法联合情景模拟教学对骨科实习生相较于传统教学模式能明显提高对课程的满意度，增加实习生对激发学习兴趣方面满意度，提升对思维能力、自学能力、归纳总结能力、表达能力及协作能力方面满意度。分析原因在于案例教学法联合情景模拟教学，二者结合不仅是对理论知识的重点突出与补充，还增加实习生的参与和互动，提高教学趣味性，增加实习生对课程的兴趣，且教师引导实习生自身对病例进行思考分析，锻炼自学能力，同时情景模拟教学还补充对实际操作的训练，实习生通过组内合作解决实际问题，并进行临床病例采集等的场景再现，提高实习生实践能力，通过幻灯片的完成与展示，锻炼表达能力，并培养较好的人际沟通能力与团队协作能力，最后通过组内和组间多轮讨论与总结归纳，提高实习生的归纳总结能力，综合增加实习生对课程的满意度11。综上所述，案例教学法联合情景模拟教学对骨科实习生不仅能提高病例分析能力，且改善临床综合实践能力，提高其对课程的满意度。参考文献1赵伟,陈天天,张勋,等.骨科教学中临床病例讨论优势研究J.重庆医学,2020,49(S01):185-1872陈光华,黄贵芝,谭小艳,等.3D打印技术联合混合现实技术在基层医院老年髋部骨折规范治疗教学中的应用效果J.中国老年学杂志,2022,42(23):5867-5870.3吴荷玉,杨英,马琼,等.基于ORTCC模型的手术室骨科亚专科护士培训体系的建立与应用J.中国实用护理杂志,2023,39(8):567-572.4MURDOCK H M,PENNER J C,LE S,et al.Virtual Morning Report during COVID-19:a novel model for case-based teaching conferencesJ.Med Educ,2020,54(9):851-852.5杨帆,周轩,焦河,等.基于案例教学的模拟情景演练在影像技术外周介入规培中的应用J.实用放射学杂志,2021,37(8):1381-1384.6万昌丽,李晓林,丁小萍,等.3D打印技术结合PBL与CBL教学法在骨科低年资护士专科能力培养中的应用J.护士进修杂志,2019,34(8):756-759.7徐薇,王升儒,杜悠,等.MDT联合CBL教学模式在手术室护士骨科专科护理能力培养中的应用J.护理研究,2022,36(20):3758-3760.8闫铭,李苇航,丁子毅,等.以问题为基础的学习联合以案例为基础的学习在脊柱外科实习生临床带教中的应用J.骨科,2022,13(5):433-436.9王方,王佐林.基于循证医学PICOS模式的案例教学法在口腔种植学教学中的应用J.重庆医学,2020,49(10):1718-1720.10解琳,张寅,王佳玉,等.烧伤科低年资护士护理大面积烧伤患者休克期液体复苏的情景模拟教学前瞻性自身前后对照研究J.中华烧伤杂志,2021,37(8):781-787.11李琴,谈学灵,陈彬.基础护理实验教学中的情景模拟教学对护生自主学习能力提升作用评临床实用护理技术操作规范J.中国实验方剂学杂志,2021,27(4):15.(上接第 191 页)