毕业论文丹参SmPAP1基因的生物信息学分析.docx

摘 要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，其根和根茎皆可入药，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。近年来随着丹参需求的日益扩大，野生资源的逐渐减少，人工种植品种退化及病虫灾害等一系列问题的产生，导致丹参产量和质量的逐年降低。因此，有效提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参现代化开发利用的必由之路。丹参中主要次生代谢产物分为两大类：一类为水溶性的酚酸类化合物；另一类为脂溶性的丹参酮类物质。基于传统中药多以水煎服的用药方式，水溶性的酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的活性物质。研究报道丹参中主要的酚酸类活性成分生物主要源于酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径，多为咖啡酸的衍生物，并且其合成受到一些MYB和BHLH类转录因子的调控。鉴于此，本论文在已有研究的基础上，选取丹参------基因为研究对象，克隆其启动子序列并进行序列的生物信息学分析，探究其潜在的表达调控模式，为更好地研究丹参------基因的功能及在丹参酚酸类合成中的作用奠定基础。
1.利用PCR的方法从丹参gDNA水平克隆得到了--------基因的启动子序列，该序列全长---------bp。
2.利用启动子在线分析软件进行启动子顺式作用元件分析。分析结果显示，该基因启动子区域上分布有与生物或非生物胁迫相关的顺式作用元件如-----、-----、-----等，以及与激素响应相关的顺式作用元件------、-------等。
关键词：丹参，-----基因,启动子，顺式作用元件。

Abstract

57

第1章 引言
第1章 引言
1.1丹参的研究概况
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），又名赤参、逐乌、郁蝉草、奔马草等，为唇形科鼠尾草属多年生直立草本植物，产河北，山西，陕西，山东，河南，浙江，江苏，安徽，江西及湖南等地，生于海拔120～1300米的山坡、林下草丛或溪谷旁[1]。根和根茎可入药，味苦，微寒。归心，肝经。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功效。在临床上广泛用于用于月经不调，经闭痛经，胸腹刺痛，热痹疼痛，疮疡肿痛，心烦不眠，肝脾肿大，心绞痛等症的治疗[2]。
丹参具有种植条件简单、繁殖周期短、即能杂交授粉又能自交授粉[3]、次生代谢产物丰富，主要化学成分明晰[4,5,6]，基因组相对小[7]、基因操作技术成熟简便[8-10]等优点。是研究药用植物次生代谢产物生物合成及调控的理想材料。因此具有“药用模式植物”之称[11-13]。
丹参为我国十大大宗药材之首，年需求量超万吨，仅原药材生产销售额达数亿元人民币，现已上市的中成药和复方制剂达百余种，总产值超过100亿元[11]。
1.1.1 丹参主要化学成分及其药理作用
对丹参活性成分的研究始于二十世纪三十年代。依据已分离化合物的特特够特征和理化性质，将其分为两类：脂溶性丹参酮类化合物与水溶性酚酸类化合物[4,5,6]。（见图1-1）。自1934开始，现已分离鉴定的丹参脂溶性化合物达40余种，主要包括丹参酮I、IIA、IIB 、V 、VI，异丹参酮I、II 、IIB，隐丹参酮，异隐丹参酮，丹参新醌A、B、C 、D，二氢异丹参酮、丹参酮二酚、丹参环庚三烯酚酮等[14]。其中，丹参酮ⅡA 是丹参治疗冠心病的主要成分之一，具有扩张冠状动脉、、抗血小板凝集、清除氧自由基、改善记忆力障碍等作用，被2010年版《中华人民共和国药典》规定为丹参药材质量控制的指标成分之一；隐丹参酮具有强抗菌性，而且对治疗心肌缺血也有一定的疗效并对治疗心肌缺血也有一定的疗效，是丹参抗菌消炎类制剂的质量控制指标[2,15-17]。对丹参水溶性成分的相关研究始于20世纪70年代，至今已分离鉴定了咖啡酸、迷迭香酸，迷迭香酸甲酯，丹酚酸A、B、C 、D、E、F 、G， 原儿茶醛，原儿茶酸，紫草酸，丹参素，异阿魏酸，紫草酸单甲酯，紫草酸二甲酯， 紫草酸乙酯等20多种水溶性的酚酸类物质[4,18-19]（图1-1）。丹参水溶性酚酸类成分主要表现为抗氧化作用[20]。丹酚酸B 是目前发现的抗氧化作用最强的天然产物之一，也是丹参中含量最高的酚酸类化合物，对心、脑、肝、肾、胃等多个器官具有保护作用，被2010年版《中华人民共和国药典》规定为丹参药材质量控制的水溶性指标性成分之一；迷迭香酸具有抗炎镇痛作用；丹参素和原儿茶醛是治疗冠心病的有效成分[2,20-23]。鉴于传统yij中药以水煎服的用药方式，丹参水溶性化合物受到人们越来越多的关注。
除以上所述化合物，丹参中还含有微量的鼠尾草酚、弥罗松酚、黄芩苷、熊果酸、柳杉酚、琥珀酸和β-谷甾醇-D-葡萄糖苷等化学成分。

图1-1 丹参酚酸类化合物的结构
Figure 1-1 Structures of the phenolic acids of S. miltiorrhiza
1.1.2 丹参资源利用的现状
随着对丹参有效成分及药理作用的深入研究，近年来以丹参为主要原材料的产品不断被推出，丹参的需求量越来越多。伴随着丹参需求量的日益增加，对丹参野生资源的采挖力度加大，同时人工种植面积也在不断增加。但是，丹参作为异交植物，其种内变异非常大，性状也很复杂。因此只注重扩大栽培面积而忽略其优良品种选育导致了丹参品种严重退化，质量不均一，有效成分含量降低等诸多问题，从而影响了丹参作为高品质药用植物大规模进军国际市场[24-25]。另外，人工栽培条件下药田生态环境中生物多样性差、丰富度低，导致丹参病虫害优势种群突出、病虫害频发等问题也严重影响了药材的产量和质量[26,27]。因此为了提高丹参品质，更好的满足其市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良来筛选优异丹参资源细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良，筛选优异丹参资源，提高丹参药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。
1.2丹参酚酸类物质的合成
1. 2.1 丹参酚酸类成分生物合成途径的研究概况
迷迭香酸在多种唇形科植物中均有发现，迷迭香酸生物合成相关酶基因已经
研究的较为清楚。咖啡酸和丹参素等几种单苯环物质可由氨基酸直接氧化脱氨生成，而其余均可视为咖啡酸与丹参素酯化缩合反应得到产物。丹参素源于酪氨酸代谢途径，咖啡酸来自苯丙烷类代谢途径，迷迭香酸是由酪氨酸代谢途径和苯丙烷类代谢途径共同参合成的。酪氨酸代谢途径中的羟基苯丙酮酸还原酶（HPPR）与酪氨酸氨基转移酶（TAT）参与了丹参素的合成；迷迭香酸合酶（RAS）、苯丙烷类代谢途径中的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）以及酪氨酸代谢途径中的TAT和HPPR共同参与了迷迭香酸及丹酚酸B的生物合成过程[28-29]。丹参酚酸类化合物的生物合成途径分为三部分。第一部分：莽草酸途径，由葡萄糖经过多步酶促反应生成莽草酸，进而形成芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸，它们是连接初生代谢和次生代谢的关键。第二部分：酪氨酸代谢和苯丙烷主干代谢两条互相平行的途径，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL）催化作用下生成肉桂酸，肉桂酸在细胞色素P450单加氧酶CYP73 亚家族的肉桂酸- 4- 羟化酶(C4H）和4- 香豆素辅酶A连接酶(4CL)的催化下生成4- 香豆酰CoA ，是植物酚酸、黄酮类和木质素类物质合成的通用途径；酪氨酸经由酪氨酸氨基转移酶（TAT ）和羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）的催化合成丹参素。第三部分：丹参酚酸类物质的特异合成途径，以4- 香豆酰辅酶A 和4- 羟苯基乳酸为前体通过迷迭香酸合酶（RAS ）催化苯丙烷类代谢途径来源的4- 香豆酸CoA 和酪氨酸途径来源的4- 羟苯基乳酸缩合、羟化形成迷迭香酸，迷迭香酸再经多步缩合、还原反应合成丹酚酸B[28-29]。
1.2.2丹参酚酸类物质的调控研究
目前对于丹参酚酸类活性成分生物合成的骨架途径已研究的较为清楚。丹参酚酸类活性成分生物合成主体途径上的多数酶基因已被克隆，这些酶基因的表达及调控与酚酸类化合物的累积密切相关。丹参中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆素辅酶A连接酶（4CL）、酪氨酸氨基转移酶（TAT）、羟苯基丙酮酸还原酶（HPPR）以及迷迭香酸合酶（RAS）共同参与了酚酸类化合物主要成分-丹酚酸B的生物合成过程[30]。

图1-2植物酚酸类物质的合成途径
Figure 1-2synthetic route of plant pheonlic substanve.

1.3 各自基因的介绍
1.3.1 -------基因概述

重点阐述！

1.3.2 -------基因启动子的研究进展
重点阐述！

1.3.2 -------基因的表达调控

重点阐述！

1.4 本研究的目的意义

缩略词表
英文缩写
英文名称
中文名称
---

第3章 丹参SmPAP1基因的生物信息学分析
第2章 丹参-----基因启动子序列的克隆
2.1实验材料、试剂及主要实验仪器
2.1.1 实验所用植物材料
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）种子从购自陕西道地药材有限公司，种于蛭石与营养土(体积比约为3：1)混合的培养土的盛有蛭石的培养盆中于人工气候箱中培养，每隔两天浇一次水。当幼苗长出第二对真叶时栽至含蛭石的营养钵中，每个营养钵种 3 棵幼苗。人工气候箱培养条件：光周期16/8 h（day/night），光照强度2000 lx 216 µmol·m2·s-1，温度 25 ± 2 ℃，湿度60 ~ 80 %。本章实验材料为人工气候箱中培养30 d后的丹参实生苗。将丹参种子种在蛭石与营养土(体积比约为3：1)混合的培养土中，幼苗在第二对真叶长出时移至营养钵中培养，培养条件：温度25 ± 2 °C，湿度60 ~ 80 %，光周期16/ 8 h（day/night），光照强度2000 lx。

2.1.2实验试剂
LA EX Taq® Polymerase、dNTP mix,T4 DNA Ligase,PrimeScript® RT reagent Kit EmeraldAmp® PCR Master Mix, DL 2000 DNA Marker, pMD®19-T Simple Vector（购自TaKaRa公司）；
BD Genome Walker™ Universal Kit（购自Clontech公司）；
DNA胶回收试剂盒（AXYGEN公司）；
氨苄青霉素钠（Ampicillin sodium，Amp）Amresco公司
引物序列合成，克隆片段测序均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成；
其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。
附：实验所用缓冲液和培养基配方，及本章实验中所用到但未列出的各种试剂配制方法参考《分子克隆实验指南》[104]。
（1）实验所用抗生素及植物激素的配制：
Amp储备液（100 mg/mL）：无菌水溶解10.0 g氨苄青霉素钠，定容至100 mL，0.22 μm无菌滤头过滤除菌，1 mL分装置于-20℃ 贮存。以100 μg/mL的使用终浓度添加于LB培养基；
（2） CTAB提取液(1L)
CTAB 10.0g；
PVP 25.0g；
NaCl 40.908g；
EDTA 3.7224g；
Tris: 6.057g；调PH8.0。
（3） TAE缓冲液（50×）（使用的时侯稀释至1×）：
Tris 242.0 g；
EDTA 18.612g；
冰乙酸 57.1 mL；
加H2O定容至1000 mL，室温保存。
（4） LB (Luria-Bertani) 培养基（1 L）：
NaCl 10.0g；
Tryptone 10.0g；
Yeast extract 5.0g，调pH7.0；固体LB培养基再附加15.0g琼脂粉。
2.1.3实验仪器
恒温培养箱 上海智新苗实验设备有限公司
紫外-可见分光光度计 UNICAM UV-300
HH-6B数显恒温水浴锅 国华电器有限公司
摇床 上海智诚实验设备有限公司
电泳仪 北京六一仪器厂DY-8型
超净工作台 AIR TECH 苏州净化设备有限公司
玻璃仪器气流烘干机 郑州长城科工贸有限公司
涡旋器 姜堰市康健医疗器具有限公司 XH-B
PCR仪 美国BIO-RAD公司
NanoDrop 2000核酸仪 美国Thermo Scientific公司
凝胶成像系统 美国Media Cybernetics公司 UVP GDS-8000型
超纯水仪 美国Millipore公司
超低温-80℃冰箱 美国Thermo Fisher Scientific公司
冷冻台式离心机 德国Eppendorf公司Centrifuge 5802R
Eppendorf微量移液器 德国Eppendorf公司
电子天平 德国Sartorius公司
4℃/-20℃冰箱 德国SIEMENS公司
高压灭菌锅 日本SANY公司MLS-3750型
2.2实验方法
2.2.1 丹参基因组DNA的提取
丹参基因组DNA的提取采用CTAB法。
（1）将CTAB在水浴锅中预热至65℃，研钵、研磨棒在液氮中预冷。
（2）取新鲜的丹参叶片于研钵中，加入液氮迅速研磨使其成粉末。
（3）称取0.2～0.3g研磨样于EP管中，每管中分别加入CTAB600μL,和Lβ-巯基乙醇12μ，颠倒混匀数次。
（4）65℃水浴约60min，这一过程中每10 min颠倒混匀一次；
（5）每管加入4μL的RNA酶，37℃水浴约30min；
（6）5,500 rpm离心15 min，取上清；
（7）加入氯仿/异戊醇（24:1）480μL，20μL抽提一次。；
（8）12,000 rpm离心5 min，取上清；
（9）重复步骤7、8两次；
（10）加样品二倍体积的无水乙醇，1/10提及的NaOAC；
（11）-20℃放置1h以上，用枪头将DNA挑至EP管中。；
（12）加750μL的无水乙醇和250μL Elution Buffer，12,000 rpm离心5 min，洗脱两次，去上清，干燥；
（13）加0.1～0.5mL Elution Buffer，65℃水浴，使DNA完全溶解。
------基因启动子片段的PCR扩增
在NCBI查到注册号为GU218694.1的-----基因，根据其序列特征，利用PrimierPrimier5软件设计一对引物，ORF采用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性的引物，引物序列见表2-1分别以丹参cDNA和gDNA为模板，分别扩增SmPAP1基因的ORF和DNA全长，扩增体系（50 μL）如下：
Template DNA 1μL
Primer F (10 μM) 0.5μL
Primer R (10 μM) 0.5μL
2×Taq MasterMix 10μL
dd H2O add to 20μL
扩增条件：
94 ℃，10 min；
（94 ℃，30 s；57 ℃，1min；72 ℃，50 s）33Cycles
72 ℃，10 min
PCR扩增产物经胶回收分别与pMD®19-T Simple Vector连接转化大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α，经菌落PCR检测的阳性克隆送至上海桑尼生物有限公司测序。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化方法（热激转化法）参照《分子克隆实验指南》[104]
PCR产物纯化及克隆的方法与步骤：
（1）PCR产物凝胶回收及纯化采用DNA Gel Extraction KitⅡ (U-gene, Hefei)进行：
①用手术刀片在紫外灯下切含有目的 DNA条带的琼脂糖凝胶块，用滤纸吸干凝胶表面残余液体，切碎。
②加入400μL的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75℃ 水浴加热约7min，至凝胶块完全熔化，其间每3min左右轻轻震荡混匀反应管。
③加200μL Buffer DE-A 并混合。（分离的DNA片段长度<1000bp 时，另外加入100 μL异丙醇。） 混合物颜色变为黄色后，充分混匀保证形成均一颜色。
④吸取上述混合液，移至DNA制备管（置于2 mL ，嵌套在试剂盒附带的2mL离心管中，离心（12,000×g 1 min）。弃滤液。⑤将制备管放回 2 mL 离心管中，加 500μL Buffer W1 ，12,000×g 离心 30 s ，弃滤液。
⑥将制备管置回 2 mL 离心管，加入700 μL Buffer W2 ，12,000×g 离心 30 s ，弃滤液。
⑦重复步骤6一次。
⑧将制备管置回 2 mL 离心管中，12,000×g 离心2 min。
⑨将制备管放于试剂盒所带的 1.5 mL EP管中，在膜中央加28 μL提前已加热至65℃的Eluent。室温静置1 min。12,000×g 离心1 min 洗脱。
⑩重复步骤9一次，其中的室温静置时间延长到3min。
（2）连接体系（10 μL）：
胶回收片段 5 μL
pMD®1 9 -T Simple Vector*1 0.5 μL
Solution1 4.5μL
连接条件： 4℃过夜。
（3）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化
① 感受态细胞的制备（CaCl2法）[104]
加5 mL LB液体培养基于无菌的50 mL离心管中，用灭过菌的牙签从平板上挑取生长良好的DH5α单菌落接种于该离心管中，37℃恒温180 rpm培养过夜。次日取2 mL过夜培养物接种到含100 mL LB液体培养基的锥形瓶中，37℃恒温180 rpm快速培养至OD600为0.3～0.4。
无菌条件下将菌液转移至两只经高压灭菌的50 mL离心管中，立即冰浴30 min。4℃，5,000 rpm离心8 min收集细胞；弃上清，将管倒置使残留培养液流尽；加10 mL预冷的0.1 M CaCl2溶液温和重悬菌体，冰浴20 min；4℃，5,000 rpm离心7 min，弃上清，沉淀用5 mL甘油（75%甘油用0.1 M CaCl2稀释至浓度为15%）悬浮，100 µl分装。液氮速冻，-80℃保存。
② 转化（热激法）
冻存于-80℃的感受态细胞置冰上溶化，将连接产物加入溶化后的感受态细胞中，冰浴 40 min，42℃热激 85 s，不要摇动试管，立即冰浴静置2 min。加入400 µl LB液体培养基，37℃ 100 rpm恢复培养1 h后，将菌液均匀涂布于含有氨苄青霉素（100 mg l-1）的LB固体培养基上。于37℃的恒温培养箱中倒置培养10～14 h。
（4）菌落PCR检测
挑取单克隆至10 mLLB液体培养基（含100 mg/L氨苄青霉素），37℃ 150 rpm
下振荡培养过夜。待菌液浑浊后进行菌落PCR检测。20 μl）
反应体系如下：
菌液 2 μL
Primer F (10 μM) 0.5 μL
Primer R (10 μM) 0.5μL
2×Taq MasterMix 10μL
dd H2O add to 20μL
扩增条件为
94℃，10 min；
（94℃，30 s；57℃，1min；72℃，50 s）33Cycles
72℃，10 min
（5）菌株的保存：
将活化好的菌液于10,000 rpm离心3 min，收集菌体，保存于终浓度为15％的甘油中，-20℃存放。
-
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切去其中>1000bp的片段进行胶回收，纯化产物克隆连接到pMD®19-T Simple Vector，送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。
------基因启动子的5’侧翼序列的序列分析
分析PCR产物序列的结果，我们得到了一条长-----bp的5’侧翼序列，其A+T 含量符合启动子区高A+T含量的特征。利用PlantCARE database分析表明，在------基因转录起始位点的上游总共有38个可能的TATA box。我们认为，------基因最可能的TATA box 位于-65~-57 bases处，其序列为：TCTATATATA。在SmPAP1基因转录起始位点上游共找到11个可能的CAAT box序列，这些序列被认为对转录效率具有非常重要的作用。
分析结果显示，在-----基格式
因的启动子区，分布着多种类型的顺式作用元件，分别是与生物源或非生物源胁迫相关的顺式作用元件(表3-1)

表3-1 预测的启动子区順式作用元件
Tabel 3-1 Cis-acting element analysis of promote sequences
位点名称
Factor of site name
信号序列
Signal sequnce
位置
Location
位点功能
Fuction of site
CIACADIANLELHC
CAANNNNATC
-1172
光响应元件，生理节律相关元件
GT1CONSENSUS
GRWAAW
-708，-679 ，-637，-549，-548 ，-344 -343，-219
光响应元件，SA诱导相关元件
HDZIP2ATATHB2
TAATMATTA
-1023,-677
光响应元件
IBOXCORE
GATAA
-679 ,-219
光诱导响应元件
INRNTPSADB
YTCANTYY
-1113
光响应元件
SORLIP1AT
GCCAC
-286
光响应元件
Box 4
ATTAAT
-1118,-264,-1026,-209,-1029,-913
光响应元件
Box1
TTTCAAA
-573,-527
光响应元件
G-BOX
CACGTA
-1131,-1037
光响应元件
G-box
TACGTG
-158,-231,-157,-230
光响应元件
WBOXNTERF3
TGACY
-667,-400
创伤诱导响应元件
MBS
CAACTG
-581
MYB结合位点，干旱响应元件
ABRELATERD1
ACGTG
-229,-156
ABA、干旱响应元件
ACGTATERD1
ACGT
-1130,-1036,-719 ,-229,-156
脱水相关元件
MYB1AT
WAACCA
-660
ABA、脱水诱导元件
MYB2CONSENSUSAT
YAACKG
-581,-372
脱水相关元件
MYCCONSENSUSAT
CANNTG
-1075,-581,-554 ,-538,-524-502,-472,-439
干旱、ABA诱导响应元件
DPBFCOREDCDC3
ACACNNG
-1076
ABA诱导元件
MYB2CONSENSUSAT
YAACKG
-581,-372
ABA诱导元件
RYREPEATBNNAPA
CATGCA
-1105
ABA诱导元件
ABRE
TACGTG
-230,-157
ABA诱导元件
GAREAT
TAACAAR
-364 ,-334
GA诱导响应元件
MYBGAHV
TAACAAA
-364
GA响应元件
TATCCACHVAL21
TATCCAC
-1002
GA响应元件
WRKY71OS
TGAC
-667 ,-565,-541,-678,-498 ,-400,-380
MYB结合位点，GA、病程相关响应元件
ATGCAAAT motif
ATACAAAT
-505,-615
順式调控元件
Box-W1
TTGACC
-668
真菌诱导响应元件
CAAT-box
CAAT
-685,-641,-629,-612,-524,-502,-439, -377,-361,-271,-43
RNA聚合酶Ⅱ转录的上游元件
CCAAT-box
CAACGG
-372
MYB结合位点
Skn-1_motif
GTCAT
-474
胚乳特异性响应位点
TA-rich region
TATATATATATATATATATATA
-320
转录增强元件
TATA BOX

-57
转录起始核心元件
TC-rich repeats
ATTTTCTTCA
-1049,-192
防御与胁迫相关元件
TGA-element
AACGAC
-238
生长激素响应
Circadian
CAANNNNATC
-1172
生理调控响应元件

第2章 丹参SmPAP1基因的克隆

2.3.实验结果分析
1）：基因组DNA的提取质量检测

2）-----基因启动子序列的扩增

3）-----基因启动子序列的生物信息学分析

图片模版！

图 2-1 丹参SmPAP1 基因PCR电泳图
M：DL2,000 Marker；B：空白对照; 1：以DNA为模板扩增；;2:以cDNA为模板扩增；
Fig. 2-1 The PCR amplification of SmPAP1 gene from S. miltiorrhiza.

M,DL2,000 Marker;B,no template control; 1,PCR amplification from gDNA2, PCR amplification from cDNA

第6章 结果与讨论
讨论
着重写！

攻读硕士学位期间的研究成果
参考文献

1. 基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究
2. 基于单片机的嵌入式Web服务器的研究
3. MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究
4. 基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制
5. 基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究
6. 基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器
7. 单片机控制的二级倒立摆系统的研究
8. 基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现
9. 基于单片机的蓄电池自动监测系统
10. 基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究
11. 基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究
12. 基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发
13. 基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制
14. 基于单片机的自动找平控制系统研究
15. 基于C8051F040单片机的嵌入式系统开发
16. 基于单片机的液压动力系统状态监测仪开发
17. 模糊Smith智能控制方法的研究及其单片机实现
18. 一种基于单片机的轴快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制
19. 基于双单片机冲床数控系统的研究
20. 基于CYGNAL单片机的在线间歇式浊度仪的研制
21. 基于单片机的喷油泵试验台控制器的研制
22. 基于单片机的软起动器的研究和设计
23. 基于单片机控制的高速快走丝电火花线切割机床短循环走丝方式研究
24. 基于单片机的机电产品控制系统开发
25. 基于PIC单片机的智能手机充电器
26. 基于单片机的实时内核设计及其应用研究
27. 基于单片机的远程抄表系统的设计与研究
28. 基于单片机的烟气二氧化硫浓度检测仪的研制
29. 基于微型光谱仪的单片机系统
30. 单片机系统软件构件开发的技术研究
31. 基于单片机的液体点滴速度自动检测仪的研制
32. 基于单片机系统的多功能温度测量仪的研制
33. 基于PIC单片机的电能采集终端的设计和应用
34. 基于单片机的光纤光栅解调仪的研制
35. 气压式线性摩擦焊机单片机控制系统的研制
36. 基于单片机的数字磁通门传感器
37. 基于单片机的旋转变压器-数字转换器的研究
38. 基于单片机的光纤Bragg光栅解调系统的研究
39. 单片机控制的便携式多功能乳腺治疗仪的研制
40. 基于C8051F020单片机的多生理信号检测仪
41. 基于单片机的电机运动控制系统设计
42. Pico专用单片机核的可测性设计研究
43. 基于MCS-51单片机的热量计
44. 基于双单片机的智能遥测微型气象站
45. MCS-51单片机构建机器人的实践研究
46. 基于单片机的轮轨力检测
47. 基于单片机的GPS定位仪的研究与实现
48. 基于单片机的电液伺服控制系统
49. 用于单片机系统的MMC卡文件系统研制
50. 基于单片机的时控和计数系统性能优化的研究
51. 基于单片机和CPLD的粗光栅位移测量系统研究
52. 单片机控制的后备式方波UPS
53. 提升高职学生单片机应用能力的探究
54. 基于单片机控制的自动低频减载装置研究
55. 基于单片机控制的水下焊接电源的研究
56. 基于单片机的多通道数据采集系统
57. 基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制
58. 基于单片机的红外测油仪的研究
59. 96系列单片机仿真器研究与设计
60. 基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造
61. 基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现
62. 基于MSP430单片机的电梯门机控制器的研制
63. 基于单片机的气体测漏仪的研究
64. 基于三菱M16C/6N系列单片机的CAN/USB协议转换器
65. 基于单片机和DSP的变压器油色谱在线监测技术研究
66. 基于单片机的膛壁温度报警系统设计
67. 基于AVR单片机的低压无功补偿控制器的设计
68. 基于单片机船舶电力推进电机监测系统
69. 基于单片机网络的振动信号的采集系统
70. 基于单片机的大容量数据存储技术的应用研究
71. 基于单片机的叠图机研究与教学方法实践
72. 基于单片机嵌入式Web服务器技术的研究及实现
73. 基于AT89S52单片机的通用数据采集系统
74. 基于单片机的多道脉冲幅度分析仪研究
75. 机器人旋转电弧传感角焊缝跟踪单片机控制系统
76. 基于单片机的控制系统在PLC虚拟教学实验中的应用研究
77. 基于单片机系统的网络通信研究与应用
78. 基于PIC16F877单片机的莫尔斯码自动译码系统设计与研究
79. 基于单片机的模糊控制器在工业电阻炉上的应用研究
80. 基于双单片机冲床数控系统的研究与开发
81. 基于Cygnal单片机的μC/OS-Ⅱ的研究
82. 基于单片机的一体化智能差示扫描量热仪系统研究
83. 基于TCP/IP协议的单片机与Internet互联的研究与实现
84. 变频调速液压电梯单片机控制器的研究
85. 基于单片机γ-免疫计数器自动换样功能的研究与实现
86. 基于单片机的倒立摆控制系统设计与实现
87. 单片机嵌入式以太网防盗报警系统
88. 基于51单片机的嵌入式Internet系统的设计与实现
89. 单片机监测系统在挤压机上的应用
90. MSP430单片机在智能水表系统上的研究与应用
91. 基于单片机的嵌入式系统中TCP/IP协议栈的实现与应用
92. 单片机在高楼恒压供水系统中的应用
93. 基于ATmega16单片机的流量控制器的开发
94. 基于MSP430单片机的远程抄表系统及智能网络水表的设计
95. 基于MSP430单片机具有数据存储与回放功能的嵌入式电子血压计的设计
96. 基于单片机的氨分解率检测系统的研究与开发
97. 锅炉的单片机控制系统
98. 基于单片机控制的电磁振动式播种控制系统的设计
99. 基于单片机技术的WDR-01型聚氨酯导热系数测试仪的研制
100. 一种RISC结构8位单片机的设计与实现
101. 基于单片机的公寓用电智能管理系统设计
102. 基于单片机的温度测控系统在温室大棚中的设计与实现
103. 基于MSP430单片机的数字化超声电源的研制
104. 基于ADμC841单片机的防爆软起动综合控制器的研究
105. 基于单片机控制的井下低爆综合保护系统的设计
106. 基于单片机的空调器故障诊断系统的设计研究
107. 单片机实现的寻呼机编码器
108. 单片机实现的鲁棒MRACS及其在液压系统中的应用研究
109. 自适应控制的单片机实现方法及基上隅角瓦斯积聚处理中的应用研究
110. 基于单片机的锅炉智能控制器的设计与研究
111. 超精密机床床身隔振的单片机主动控制
112. PIC单片机在空调中的应用
113. 单片机控制力矩加载控制系统的研究
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