几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展.pdf

综述与专论2023,39(10):29-40生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN收稿日期：20230602基金项目：2022 年度甘肃省重点研发计划项目（22YF7NA118），国家重点研发计划（2022YFD1602204），甘肃省科技厅民生科技专项（21CX6NA124），西北师范大学重大科研项目培育计划项目（NWNULKZD202202），甘肃省农业科学院科技成果转化项目（2022GAASCGZH11）作者简介：马赛买，女，硕士研究生，研究方向：微生物技术；Email:通讯作者：孔维宝，男，博士，教授，研究方向：微生物资源与技术；Email:随着农作物种植结构和模式的不断变化，其受到病虫害威胁的情况也愈发严重。病虫害对农作物的品质、产量和安全造成了严重影响，进而直接影响着我国的农业可持续发展和人民的生活物资保障及食品安全。一方面，一些作物害虫如麦种蝇、草地贪夜蛾等，植物病害如土传病害、根腐病害等已经严重危害农作物的生产1-4。例如，由烟粉虱通过传播病毒引起番茄卷曲病及致病疫霉菌几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展马赛买1 李同源1 马燕军1 韩富军2 彭海2 孔维宝1（1.西北师范大学生命科学学院，兰州 730070;2.甘肃省农业科学院林果花卉研究所，兰州 730070）摘 要：病虫害严重影响农作物的品质、产量和安全。生物防治作为一种绿色、安全、有效防控病虫害的技术方法越来越受到人们关注。几丁质酶（EC 3.2.1.14）是一类广泛存在于微生物和植物中的糖苷水解酶，可有效降解病原真菌细胞壁、昆虫及线虫体壁中的几丁质，抑制病原真菌孢子萌发和菌丝生长，以及昆虫和线虫的发育，在农作物病虫害生物防治中具有重要作用和广泛的应用前景。本文综述了几丁质酶的种类和来源、生防机理，以及基于几丁质酶的转基因技术在作物病虫害防治中的应用等方面的进展，以期为几丁质酶的进一步研究和应用提供信息参考。关键词：农作物；植物病虫害；生物防治；几丁质酶DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230520Research Progress in Chitinase Involving in the Biocontrol of Crop Diseases and PestsMA Saimai1 LI Tongyuan1 MA Yanjun1 HAN Fujun2 PENG Hai2 KONG Weibao1（1.College of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070;2.Institute of Forestry,Fruit and Flower,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070）Abstract:Pests and diseases seriously affect the quality,yield and safety of crops.As a green,safe and effective method to control pests and diseases,biological control has attracted more and more attention.Chitinase（EC 3.2.1.14）is a kind of glycosylated hydrolase widely existing in microorganisms and plants.It can effectively degrade the chitin in cell walls of pathogenic fungi,insects and nematodes causing diseases and insect pests,and inhibit the spore germination and mycelium growth of pathogenic fungi,and the development of insects and nematodes,which has an important role and application prospect in the biological control of crop diseases and insect pests.This paper reviewed the types and sources of chitinases,the biological control mechanism and control strategy of chitinase,and the application of transgenic technology based on chitinase in crop pest control，aiming to provide information for further investigation and application of chitinase in the fields of crop production,pests and diseases control.Keywords:crops;plant diseases and insect pests;biological control;chitinase生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1030（Phytophthora infestans）引起的番茄晚疫病导致番茄的产量下降了 20%-100%5-6；植物寄生线虫已对全球农业造成严重危害，其通过破坏种类繁多的农作物、水果和蔬菜来影响农业生产7-8；根结线虫每年会导致韩国番茄产量有 30%-40%的损失，已成为该国番茄生产的主要问题9。由镰刀菌属（Fusarium）和丝囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆土传病害根腐病，导致豌豆的生产面积下降10；干腐病是马铃薯贮藏期间最严重的病害，尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和燕麦镰刀菌（F.avenaceum）是引起干腐病的主要病原菌，其造成的马铃薯减产严重时可达 60%11；镰孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum）引起的红腐病是影响甘蔗生产的一种严重秸秆病害12；土传真菌 Stromatinia cepivora 引起的白腐病对洋葱和大蒜作物生产造成严重危害13。另一方面，化学农药一般被认为是抑制病虫害的可靠选择，但是过量使用化学农药会导致土壤和水体的污染，也会直接或间接地危害人体健康14。研究显示人体长期暴露于亚致死量的化学杀虫剂下，会导致一些慢性病的发生，如癌症，生殖、肾脏和呼吸系统疾 病等15。生物防治是一种直接利用有益微生物或微生物代谢产物来防治有害生物的方法，因其对人畜安全、不污染环境且防治病虫害效果显著、持久等优点而受到广泛关注16-18。生物防治可以利用天敌控制病虫害，包括以虫治虫即利用天敌昆虫来防治害虫，如肉食性瓢虫捕食蚜虫；也包括以菌治虫即利用真菌（如金龟子绿僵菌 Metarhizium anisopliae）、细菌（如苏云金杆菌 Bacillus thuringiensis）和病毒（如核型多角体病毒 NPV、颗粒体病毒 GV、细小病毒 CPV）及其代谢产物防治害虫；同时还可以以菌（拮抗菌）治病，如利用枯草芽孢杆菌（B.subtilis）产生的枯草菌素防治灰霉病。由于对环境友好型产品的需求日益增长，生物源杀虫剂、杀菌剂以及植物保护剂等已被广泛应用，以减少对化学农药的使用，减轻对环境和人畜的直接和潜在危害19-23。几丁质（chitin）是一种仅次于纤维素的第二大多糖，广泛分布于真菌细胞壁、节肢动物角质层、围食膜以及软体动物壳中24。几丁质酶（chitinase）是一种广泛分布于古菌、细菌、真菌、高等植物及动物中的糖苷水解酶，对含有几丁质的真菌、昆虫及其幼虫等病原体的生长和发育具有抑制作用14，同时也能够水解天然高聚物，如几丁质、壳聚糖、脂质寡糖、肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖和含有 N 乙酰葡糖胺的糖蛋白25。几丁质在多种植物病原体细胞中的广泛分布提示我们几丁质酶在病虫害综合防控中有可能作为有潜力的生物杀虫和杀菌剂，而且目前的研究也发现几丁质酶可同时防治有害昆虫、真菌和线虫26-28。本文总结了几丁质酶的分类、来源及其应用于农作物病虫害防治的生防机理和策略等，以期为几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究和应用开发提供有价值的信息参考。1 几丁质酶的分类根 据 作 用 方 式 不 同，几 丁 质 酶 可 分 为 内切 酶（endochiyinases，E.C 3.2.1.14）和 外 切 酶（exochitinases，EC 3.2.1.52），其中几丁质外切酶可以分为几丁质水解酶（E.C 3.2.1.29）和-1,4 葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.30）。几丁质内切酶随机裂解几丁质链内部，生成具有可溶性且分子量低的 N 乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）多聚体，如几丁四糖、几丁三糖、几丁二糖；几丁质外切酶催化几丁质链的非还原端，可连续去除 GlcNAc 单体29。根据催化结构域的类型，几丁质酶可分为两大类糖基水解酶（glycosyl hydrolases，GH）家族，即GH18 和 GH19 家族。GH18 家族的几丁质酶具有典型的（/）8磷酸丙糖异构酶桶状折叠结构，其催化结构域具有 DN G LIVMFDNLIVMFDNxE、YDN和 SxGG 等高度保守区域。前两个区域参与底物辅助催化机制，第 3 个区域参与底物结合30-31。GH19 家族的几丁质酶富含-螺旋结构，采用单置换催化机制，并以保守区域FHYGRGAPxQIL ST FHYW HN FYNY 和 L（x）9LV（x）12WFYW 为表征，形成底物结合区32。根据几丁质酶在基因序列、氨基酸组成和保守基序分布的差异，可将其分为五类。I 类、II 类和IV 类几丁质酶含有 GH19 结构域作为催化结构域，GH18 结构域存在于 III 类和 V 类几丁质酶中33-34。I 类和 IV 类几丁质酶在 N 端几丁质结合结构域和催2023,39(10)31马赛买等：几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展化结构域的存在下结构相似，但 IV 类几丁质酶由于缺失这两个结构域而导致长度较短。I 类和 II 类几丁质酶具有序列同源性，但 II 类几丁质酶缺乏 N 端几丁质结合结构域，III 类和 V 类几丁质酶中也不存在几丁质结合结构域。III 类几丁质酶具有溶菌酶活性，其特征是存在 C 端延伸35。III 类和 V 类几丁质酶广泛分布于真菌、病毒和高等植物中，I 类、II类和 IV 类几丁质酶大多来自细菌，有少数也存在于高等植物中25。2 几丁质酶的来源几丁质酶来源广泛，主要包括细菌、真菌、病毒和植物，另外，基于特殊环境的宏基因组来源的几丁质酶也受到广泛关注。附表 1 总结了几丁质酶的来源、催化特性、生化特征及生防信息。2.1 细菌几丁质酶大多数细菌几丁质酶属于 GH18 家族，但放线菌（Actinomycetes）和紫细菌（purple bacteria）中一些几丁质酶属于 GH19 家族，隶属于上述两个家族的酶在序列、三维结构和催化机制方面有一定的差异29,31。细菌几丁质酶的 GH18 家族根据其催化域的结构相似性进一步分为 A、B、C 三个亚族31。B亚族和 C 亚族仅在少数细菌中被发现，但 A 亚族的成员在自然界中分布广泛36-37。后者的特征是存在几丁质插入结构域，它是一个存在于磷酸丙糖异构酶桶中的小+结构域，有助于结合长链底物及提高酶的加工能力31,38。迄今为止，大多数细菌几丁质酶都来自于水生和陆生生境中可培养的几丁质降解微生物，这些微生物从含有几丁质底物（胶体几丁质）的固体培养基中分离出来39，然后在同源宿主菌中对酶基因进行克隆、表达、纯化后再做表征40，一般优选大肠杆菌（Escherichia coli）作为宿主41。在革兰氏阴性菌中，黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens）被认为是降解几丁质的有效菌之一，并被用作研究几丁质酶作用机理的模式菌株38。S.marcescens 的几丁质酶降解机制包括属于 GH18 家族的几丁质酶ChiA、ChiB、ChiC 和 ChiD（图 1）38，以及属于GH20 家族的裂解多糖单加氧酶 CBP21 和-己糖胺 酶38,42。在一些细菌中，如豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae），其几丁质酶产生的复杂性更大，因为不同的几丁质酶可以通过不同的转录模式从同一基因产生43。杨绍青团队克隆了来自 Paenibacillus xylanexedens Z24 的几丁质酶基因 PxChi52，并在 E.coli 中进行了表达，该 PxChi52 酶对灰霉菌（Botrytis cinerea）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）及苹果腐烂病菌（Valsa mali）有很强的抗菌活性，可抑制立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）和六出花链格孢（Alternaria alstroemeriae）的菌丝生长44。2.2 真菌几丁质酶真菌几丁质酶大多属于 GH18 家族，但来自家蚕微孢子虫的几丁质酶 NbChiA 属于 GH19 家族。NbchiA 总共包含 9 个 螺旋（图 2A），在其分子表面有一个深的裂隙，可能在底物结合中起作用45（图2B）。GH18家族的真菌几丁质酶根据其序列相似性、底物结合裂缝结构和酶活性分为 A、B 和 C 亚族46。但真菌 GH18 家族几丁质酶的亚群与细菌 GH18 家族几丁质酶的亚族并非对应关系。与细菌一样，真菌几丁质酶也可能具有多种结构域30。几丁质酶在调节真菌细胞分裂、生长和形态发生过程中发挥着主要作用。所有真菌中都具有几种不同的几丁质酶活性，其中包括丝状真菌，而酵母细胞壁中的几丁质含量通常低于丝状真菌，因此，酵母基因组编码的几丁质酶的数量较少46。丝状真菌，如木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、脉孢菌（Neurospora）、毛霉（Mucor）、曲霉（Aspergillus）、耳霉属（Conidiobolus）以及白僵菌属（Beauveria）菌株可以分泌不同的几丁质酶，其中大多数酶是真菌寄生所必需的。作为寄生病原真菌的哈茨木霉（T.harzianum）和绿色木霉（T.viride）中的几丁质酶分解机制是由多个细胞外 GH18 几丁质酶类协同作用47，来自 T.viride 中的一种混合物被发现含有 4 种不同的几丁质酶，能够破坏家蚕的围食膜26。值得注意的是，真菌保护自身免受内源性几丁质酶的降解作用机理还有待深入研究。研究发现在 Trichoderma 中，几丁质酶参与真菌寄生、外源几丁质原纤维的分解以及自溶和细胞壁的再循环；在健康的菌丝中，几丁质受到细胞壁中蛋白质的保护，而这种保护功能在真菌寄生攻击、菌丝老化和自溶生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1032过程中会部分丧失48。尽管真菌几丁质酶在真菌生命周期和生物相互作用中具有重要作用，但根据 BRENDA 酶数据库中的信息，沉积的真菌几丁质酶序列数量约多于细菌几丁质酶的 10%，这表明真菌几丁质酶的分子研究可能远落后于对细菌几丁质酶的认识。A：NbchiA 模型的整体折叠（橙色）和 NbchiA 与 S.coelicor 几丁质酶单体（紫色）的叠加；B：NbchiA 模型的分子表面，所有与催化和结合相关的残基都位于一个口袋中A:Cartoon representation of the overall fold of NbchiA model（orange）and superimposition of NbchiA and S.coelicolor chitinase（purple）monomers.B:Molecular surface of the NbchiA model,all of the residues related to catalysis and binding are located in a pocket图 2 NbchiA 的三维模型Fig.2 Three-dimensional model of NbchiA2.3 病毒几丁质酶目前已知的几种病毒几丁质酶均属于 GH18家族，它们的功能是通过削弱宿主屏障结构，促进病毒感染或从受感染细胞中释放新生病毒。已 知 的 病 毒 几 丁 质 酶 来 源 为 Epinotia aporema granulovirus49、菜青虫颗粒体病毒（Pieris rapae granulosisvirus，PrGV）50、Autographa californica nucleopolyhedrovirus、Cydia pomonella granulovirus51以及思茅松毛虫的核型多角体病毒52，其中来自于思茅松毛虫的几丁质酶被证明具有很强的杀虫活性。在转基因烟草中提取纯化出的一种核型多角体病毒几丁质酶（rChiA），可增强幼虫围食膜的渗透性，且能抑制链格孢菌（A.alternata）的孢子萌发和生长，因此 rChiA 可作为生态友好的抑制剂应用于农业生产中53。2.4 植物几丁质酶植物几丁质酶为内切几丁质酶类，属于 GH19家族，分子量在 25-36 kD 之间，它们根据来源有碱性与酸性之分。植物几丁质酶主要存在于单子叶和双子叶植物中，如水稻、马铃薯、胡萝卜、草莓、番茄等54。当有病原体攻击时，植物几丁质酶作为自卫酶释放病原响应蛋白，部分蛋白在盐浓度增加、寒冷和干旱胁迫条件下才会表达。植物容易受到病原真菌和有害昆虫的侵害，但许多植物因含有几丁质酶而能够拮抗病原真菌和有害昆虫。许多几丁质酶已从不同的植物中分离纯化出来，对植物病原真菌表现出了较强的抗菌活性55。从大麦中提取的 35 kD 重组几丁质酶对植物病原真菌番茄早疫病菌（A.solani）、镰刀菌（Fusarium）、立枯丝核菌（R.solani）和黄萎病菌（Verticillium）有显著的抑制作用56。大麦几丁质酶基因可用于甘蔗抗真菌植株的培育，转基因甘蔗 SCT15 和 SCT20 在体外生物测定中对接种的镰形刺盘孢菌（C.falcatum）表现出较强的抗性，与对照组相比，转基因植株依旧可以健康生长和保持绿色，而对照组在感染 C.falcatum 后第 3 周明显变黄并最终导致植株死亡57。蛾豆来源的几丁质酶可拮抗病原真菌，从尖葫芦中分离提取的几丁质酶对黑曲霉（A.niger）和 Trichoderma 均有抑菌作用58-59。图中显示了 ChiA、ChiB 的晶体结构和 ChiC 的催化结构域，以及 ChiC 中FnIII 和 CBM5/12 结构域同系物的 NMR 结构；螺旋为深蓝色，股为青色；催化酸（Glu）的侧链显示为黄色The picture shows the crystal structures of ChiA,ChiB and the catalytic domain of ChiC,and the NMR structures of homologues of the Fn and the CBM5/12 domain in ChiC.Helices are colored dark blue,-strands are colored cyan.The side chain of the catalytic acid（a Glu）is shown in yellow图 1 黏质沙雷氏菌 18 家族几丁质酶的结构概述Fig.1 Structural overview of the family 18 chitinases of S.marcescens2023,39(10)33马赛买等：几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展2.5 宏基因组几丁质酶21 世纪以来，研究者从 GH18 或 GH19 家族催化结构域的保守区域设计简并引物，开始对不同生境的微生物几丁质酶降解群落进行了基于序列的多样性分析，揭示了陆地和生态系统中几丁质酶编码基因的群落结构以及未开发几丁质酶的多样性36。几丁质降解细菌的群落结构分布及其相对丰度对于环境的变化（如营养或 pH 值）均具有一定响 应37,60。在富含几丁质的土壤中，几丁质酶基因的丰度随着几丁质的添加而升高，几丁质降解细菌的活性也显著增强61。抑制性和富集性土壤被第一次用于寻找几丁质酶的宏基因组研究，因此无需培养微生物即可获得整个群落的环境 DNA62-63。2014 年研究人员从瑞典乌普萨拉农业大学试验田的抑制卷心菜植物病原体的土壤中分离获得第一个宏基因组来源的几丁质酶27-28，该几丁质酶Chi18H8 属于 GH18 家族，对植物病原体禾谷镰刀菌（F.graminearum）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）和胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）具有抗菌活性。Dai 等64使用胶体几丁质作为底物，从青藏高原微生物宏基因组中发现了一种新的几丁质酶（P1724），并在大肠杆菌中进行了表达。P1724 在系统发育上与其他用于研究的几丁质酶差异较大，包含两个GH18 家族的催化结构域。Li 等65从福建漳州市红树林土壤的宏基因组中克隆出一种几丁质酶基因（ChiT7），该基因编码一种含有 381 个氨基酸的蛋白质，不仅与 GH18 家族几丁质酶有一定的序列相似性，且还表现出广泛的 pH 和温度稳定性。通过系统发育分析和氨基酸序列比对发现，ChiT7 酶属于 GH18 家族。在极端环境中生存的大多数微生物，无法在实验室条件下进行培养，这就降低了发现新型几丁质酶的概率，但是基于宏基因组的方法无需经过微生物的纯培养便可在基因库中进行功能筛选。因此，宏基因组方法在未来生物技术应用上有较大潜力。3 几丁质酶对农作物病原真菌和昆虫的生防机理及防治策略3.1 病原真菌的生防机理及防治策略大多数农作物病害由真菌引起，而几丁质是真菌细胞壁的重要组成部分，因此产几丁质酶菌株能够通过降解病原真菌的细胞壁进而抑制其繁殖与生长，几丁质酶抗病原真菌的潜力取决于真菌细胞壁的结构（图 3）66。现有研究主要集中于产酶微生物对植物病原真菌的抑制作用，试图用生物杀菌剂替代化学制剂从而减少化学农药对环境的危害67。Yan 等68从毕赤酵母（Pichia pastoris）中纯化出重组表达的水稻几丁质酶，该酶能有效抑制匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和 B.cinerea 的生长，但对 A.niger 和 瓜 果 腐 霉（Pythium aphanidermatum）无明显抑制作用。水稻几丁质酶之所以表现出不同的抗真菌活性，是由于真菌的微结构表面和细胞壁中几丁质的比例不同。当以鳞片状结构的排列方式允许几丁质纤维束暴露在真菌细胞壁表面时，几丁质酶更有可能与真菌细胞壁中的几丁质相互作用。Berini 等27通过对土壤抑菌宏基因组生成的 fosmid文库进行功能筛选时发现了一种新型抗真菌几丁质 酶 Chi18H8，该 酶 对 F.graminearum 和 茄 丝 核菌（Thanatephorus）具有抗菌活性，且具有耐溶剂性和在酸性环境中能够长期稳定存在等特点。Moka等69从洋葱种植区分离出一株 Trichoderma，对该分离株进行几丁质酶活性筛选，发现它能有效抑制洋葱作物中由 F.oxysporum 引起的枯萎病。Asif 等70从巴基斯坦当地渔港收集的样本中分离出 7 种可产几丁质酶的细菌，通过菌丝抑制法发现可有效抑制真菌细胞壁的生长。Akram 等71从存放鱼类的土壤中分离、鉴定出一种新的能够合成高活性几丁质酶的细菌菌株（Acinetobacter indicus CCS12），纯化后的酶对一些植物病原菌具有明显的抗真菌活性。Sarker 等72从不同农业生态区种植的番茄根际土壤中共分离到 160 株天然荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），并从中筛选出两株产酶活性较高的菌株 FPK22 和 FPK4，田间实验结果表明，这两株菌对番茄和辣椒的防治效果分别为 69.2%和 62%。上述研究表明，不同来源的几丁质酶产生菌主要通过降解植物病原真菌细胞中的几丁质来抑制病原菌的生长，从而起到一定的靶向防控作用。而且，具有高产几丁质酶的拮抗菌对不同植物病原真菌表现出一定的广谱拮抗性。生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1034图 3 真菌细胞壁的一般结构Fig.3 General structure of the fungal cell wall3.2 虫害的生防机理及防治策略对于昆虫来说，围食膜和外骨骼（图 4）66起着理化屏障的作用以防止环境危害和天敌捕食。围食膜和外骨骼由几丁质、蛋白质、脂类、儿茶酚胺代谢产物和微量矿物质组成。昆虫由于脱皮液中几丁质酶的作用，可周期性地脱去旧的外骨骼和围食膜并重新合成新的外骨骼，脱皮液积累在旧角质层与表皮的中间及肠道组织中，含有 GlcNAc 的水解产物最终会被回收用于合成新的角质层73。Tu 等74从工蜂肠道中分离出产几丁质酶的 S.marcescens，并对其防治西方蜜蜂的寄生螨进行实验室效果评价，研究表明细菌培养上清液和硫酸铵沉淀收集的蛋白质对雌螨有较强的杀灭作用（5 d 内的死亡率为 100%），其中几丁质酶可能直接通过外骨骼起到杀虫作用。Zhong 等75从土壤中分离出Pseudomonas sp.TXG61，并纯化出 52 kD 的几丁质酶（PsChiC），仅用 PsChiC 对斜纹夜蛾没有明显的杀虫作用，但在斜纹夜蛾核型多角体病毒存在下，PsChiC 对斜纹夜蛾的杀虫作用明显增强。Suganthi等76从 P.fluorescens 中纯化并制备出一种几丁质酶，将酶喷洒在受控环境中的新鲜茶树嫩枝上，然后让昆虫在嫩枝上取食，观察到 96 h 内茶蚊的死亡率 为 100%。Berini 等26研究发现 T.viride 几丁质酶混合物对家蚕围食膜有显著影响，降解几丁质的细菌可降解昆虫体内的几丁质结构，表明它们在害虫防控方面具有潜在的应用前景77。S.marcescens SEN 的培养液中至少含有两种在碱性条件下具有活性的几丁质酶，将其添加到斜纹夜蛾幼虫的饲料中，幼虫的死亡率很高78，从 B.subtilis 中纯化出的几丁质酶也可使斜纹夜蛾幼虫的发育变缓79。S.marcescens WW4 中的 3 种几丁质酶（ChiA、ChiB 和 ChiC）对天幕毛虫和棉铃虫幼虫也具有杀虫活性80。将来自于木豆野生品种的 CpCHI4 基因通过在烟草中进行异源表达，证实烟草具有杀棉铃虫活性是因为整合了 CpCHI4 基因81。通过扫描电镜观察几丁质酶HaCHT4 对棉铃虫幼虫生长发育过程中几丁质含量及围食膜结构的影响，在 4-6 龄的幼虫早期，观察到围食膜表面结构多呈小孔结构，后期孔隙变多且较大。在 4 龄幼虫的后期，经过 RNA 干扰引起基因HaCHT4 的低表达又导致围食膜中几丁质含量增加，表面结构呈多层结构并且孔径变小。该研究认为几丁质酶 HaCHT4 对棉铃虫的几丁质含量及围食膜结构有显著的调节作用82。综上所述，依据害虫体内存在几丁质重要成分的事实，通过直接喷施几丁质酶液或在农作物中异源表达几丁质酶基因降解害虫体壁和围食膜中的几丁质进行害虫防治，是一种靶向、绿色、有效的生防策略。图 4 昆虫体内存在几丁质层（角质层和肠道）Fig.4 Presence of chitin layers（cuticle and gut）in case of insects3.3 植物寄生线虫的生防机理及防治策略植物寄生线虫是一种微小的圆形蠕虫，会对农业生产造成巨大的经济损失83。线虫的生命周期主要包括 3 个不同阶段，即卵期、幼虫期和成虫期84。线虫卵壳的角质层在预防感染方面起着重要作用，其主要成分是胶原蛋白，在线虫感染期间可被微生物降解84。卵壳复杂的结构可提高被包裹的卵、胚胎或幼虫的存活率。卵壳是线虫卵中最坚硬的部分，其主要成分是几丁质。目前，主要用化学杀虫剂控制线虫病害，但细菌和真菌因能产生具有杀线虫作2023,39(10)35马赛买等：几丁质酶在农作物病虫害生物防治中的研究进展用的代谢物和水解酶而受到越来越多的关注85。PjChi1 是从青霉菌中分离出的一种几丁质酶，通过使用转基因番茄对根结线虫进行了测试。与从对照植物中收集的卵相比，在转基因番茄中发现的卵壳几丁质含量较低，转基因植物中 PjCHI1 的过表达有效减少了线虫繁殖并抑制了胚胎发育86。几丁质酶在降解铁载体和其他次生代谢物控制线虫方面也有优势87。据报道，几丁质酶主要干扰寄生线虫的卵孵化，Lee 和 Kim 报道了来自于短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）L1 的蛋白酶和几丁质酶对沙蚕卵孵化和幼体死亡率的抑制作用显著增强88。几丁质酶和明胶酶在抑制番茄隐孢子虫感染中也发挥着重要作用89。因此，利用几丁质酶来防治农作物的线虫危害是一种非常有潜力的生防策略。但是目前这方面的研究报道相对较少，后期还需更深入地研究。4 基于几丁质酶的转基因技术在作物害虫防治中的应用利用生物技术对具有先天和后天抗生物胁迫能力的农作物进行基因工程育种，在很大程度上可以减少对农药的使用，并能保障持续的作物产量。几丁质酶是一种单基因编码的蛋白质，具有低分子量和存在信号肽的特点，在转基因作物中具有广阔的应用前景。植物几丁质酶在植物发育和非特异性胁迫反应中发挥着重要作用，来自植物的几丁质酶基因已成功地在小麦、西红柿、土豆等作物中进行过表达以对抗真菌病原体90。通过农杆菌介导将山嵛菜防御素基因和来自灰色链霉菌（Streptomyces griseus HUT6037）的几丁质酶基因转化到烟草中，所得转基因烟草可通过抑制病原菌菌丝体生长来抗烟草枯萎病菌91。使用来自深绿木霉（T.atroviride）的工程化基因 Chit42 和 S.marcescens 的 C 端几丁质结合域可培育抗菌核茎腐病的转基因甘蓝型油菜92。利用橄榄链霉菌（S.olivaceus）GH19 家族的几丁质酶基因可培育抗真菌的转基因大豆93。Ahmad Mir 等94通过从印度芥菜中克隆几丁质酶 IV 基因，选育了具有高转录水平几丁质酶 IV 基因的独立芥菜转基因株系，可用于抗甘蓝型油菜病菌的感染。病理学研究表明，与非转基因植物相比，芥菜几丁质酶转基因株系的甘蓝型油菜病斑发育速率和大小显著降低。Wang 等95通过 RNA 测序分析发现，同源四倍体苹果中 Md Chi1 基因的表达水平显著上调，由此从该苹果中克隆出 Chi1 基因，并通过农杆菌介导的转基因方法获得 4 个 Md Chi1 OE 品种，转基因植株对炭疽杆菌（B.anthracis）和链格孢菌（A.alternata）引起的真菌病害具有较强的抗性。Zhang 等96报道了从 B.subtilis 中克隆出几丁质酶基因 chi113 并将其通过载体导入到越南伯克霍尔德菌（Burkholderia vietnamiensis P418）中形成重组体P41837，检测到重组体 P41837 有稳定的几丁质酶活性，并对小麦纹枯病、棉花枯萎病和番茄灰霉病的植物病害产生抑制作用。从 S.marcescens 中克隆几丁质内切酶基因 SmchiC，将其通过转化载体导入转基因烟草中，转基因烟草对 B.cinerea 及草地贪夜蛾的抗性明显高于野生型植株97。转基因技术不仅促进了不同来源几丁质酶基因的功能验证，而且还推动了它们在作物改良中的成功应用81。通过转基因技术将几丁质酶基因转化到相应的农作物中，可获得具有高抗病虫害性能的作物新品种，可在很大程度上减少对化学农药的使用。5 总结与展望植物病虫害问题已严重制约农作物的生产、品质及安全。使用化学农药进行病虫害防治会对种植土壤、农作物品质及其安全性造成不利影响。而且，随着长期、过量使用化学农药，病原体会对其产生抗性，对农业生态系统的可持续性产生更加严重的危害。随着绿色、可持续发展理念的不断深入，以虫治虫、以菌治虫、以菌治菌、以微生物（或植物）代谢物治虫治菌的生物防治与绿色防控技术越来越受到农科科技人员和农户的重视和认可。几丁质酶作为一种有效的生防制剂，主要是基于它能够特异性降解存在于植物病原真菌细胞壁、线虫和有害昆虫体细胞内的几丁质，在农作物病虫害的生物防治生产实践中具有广阔的应用前景。目前，有关几丁质酶在农作物病虫害生物防治领域的研究和开发应用工作已较为广泛和深入。但是，结合当前农业生物技术研究开发领域的新进展生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.1036以及生防酶制剂的实际应用形式，建议今后在以下几个方面作进一步的探索和努力：（1）鉴于实验室可培养微生物种类和数量的有限性，可采用宏基因组学技术进一步挖掘不同生境、不同生物体中几丁质酶基因的多样性和特异性，以发现更多更具开发应用潜力的生防几丁质酶；（2）应采用生物信息学技术全面系统地比较分析不同物种来源的几丁质酶基因和蛋白质序列、氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、结构功能域以及高级结构，为深入理解几丁质酶的催化机理、理性设计与定向进化、催化活性和稳定性的提高、化学模拟酶的制备提供理论依据；（3）通过开发创建基于几丁质酶的转基因和基因编辑耦合技术体系，可获得兼具抗病性、抗逆性、特性品质、产量潜力和生长发育等多个优良性状的改良农作物新品系；（4）基于绿色环保、多酶联产、节能省时、混菌多底物的几丁质酶的固态、半固态新型发酵生产技术亟需创新探索；（5）几丁质酶作为有效、有潜力的绿色生防制剂，目前的研究大多集中于实验室层面的防治效果评价，但是田间试验报道还相对较少。因此，基于高活性、高稳定性、高效性为特征，以生产实践可应用为目标的几丁质酶生防新型制剂的生产技术体系和实际应用效果评估工作亟需攻关，以期开发出能在农作物病虫害生物防治生产实践中可应用推广的几丁质酶生防产品，为绿色健康、可持续现代农业的发展做出积极贡献。文章所有附表数据请到本刊官网下载（http:/ 考 文 献1Fernandez MR,Abdellatif L,Lokuruge P,et al.Root disease and fungal populations in organic crops under different tillagecropping systemsJ.Crop Sci,2022,62（3）:12881304.2Leybourne DJ,Storer KE,Berry P,et al.Development of a pest threshold decision support system for minimising damage to winter wheat from wheat bulb fly,Delia coarctataJ.Ann Appl Biol,2022,180（1）:118131.3Rahman M,Islam T,Jett L,et al.Biocontrol agent,biofumigation,and grafting with resistant rootstock suppress soilborne disease and improve yield of tomato in West VirginiaJ.Crop Prot,2021,145:105630.4Withers AJ,Rice A,de Boer J,et al.The distribution of covert microbial natural e