棘胸蛙胚胎发育观察与相关抗氧化酶活性变化研究.pdf

D O I:1 0.1 6 3 7 8/j.c n k i.1 0 0 3-1 1 1 1.2 1 2 0 9第4 2卷第6期2 0 2 3年1 1月水产科学F I S HE R I E S S C I E N C EV o l.4 2N o.6N o v.2 0 2 3棘胸蛙胚胎发育观察与相关抗氧化酶活性变化研究谢永广1,汪小冬1,2,吴亚峰3,黄福江4,魏秀英1,魏朝宇1,陈敦学1(1.贵州大学 动物科学学院,贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室,贵州 贵阳5 5 0 0 2 5;2.湖南农业大学 动物科学学院,湖南 长沙4 1 0 1 2 8;3.贵州省社会主义学院,贵州 贵阳5 5 0 0 0 5;4.贵州省农科院 水产研究所,贵州 贵阳5 5 0 0 2 5)摘 要:为解析棘胸蛙胚胎发育过程中酶活性变化特征及其对胚胎发育的影响,以全人工养殖的棘胸蛙作为繁殖亲本,采用仿生态繁殖方式获得受精卵,系统观察胚胎发育时序和特征,同时分析4个主要发育阶段抗氧化酶活性变化。试验结果表明,棘胸蛙胚胎发育过程与其他蛙类总体相似,但是也存在种特异性。其受精卵为沉黏性卵,卵径为(4.3 10.6 9)mm,分为动物极和植物极,其中动物极朝上,植物极朝下。在水温(2 4.50.5)条件下,由受精卵至出膜历时2 2 2.9 4h,总积温5 4 6 2.0 3h,至卵黄吸尽期历时2 8 8.4 4h,总积温7 0 6 6.7 8h。按照发育时序可将整个胚胎发育过程分为7个阶段2 4个时期。酶活性分析发现,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷丙转氨酶以及丙二醛的变化趋势基本一致,均在原肠中期酶活性降低,而谷草转氨酶却在原肠中期酶活性达到最高点,然后持续下降。此外,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶4种酶活性均在卵黄吸尽期达最低,而丙二醛含量达到最低点为原肠中期。本试验可为棘胸蛙的繁殖生物学和高效制种技术提供基础资料。关键词:棘胸蛙;胚胎发育时序;形态特征;抗氧化酶中图分类号:S 9 6 6.3文献标识码:A文章编号:1 0 0 3-1 1 1 1(2 0 2 3)0 6-1 0 5 4-0 9收稿日期:2 0 2 1-1 0-2 2;修回日期:2 0 2 2-0 4-0 6.基金项目:贵州省科技计划项目(黔科合支撑2 0 1 92 3 4 4号,黔科合支撑2 0 2 01 Y 0 9 9号).作者简介:谢永广(1 9 9 5),男,硕士研究生;研究方向:水产养殖.E-m a i l:x i e y o n g u a n g q q.c o m.通信作者:陈敦学(1 9 8 6),男,副教授,博士;研究方向:水产健康养殖.E-m a i l:c h e n d u n x u e 1 2 6.c o m.棘胸蛙(Q u a s i p a as p i n o s a)又名石蛙、石鸡等,属两栖纲叉舌蛙科棘胸蛙属,是我国特有的大型食用蛙类,主要分布在南方海拔1 5 01 5 0 0m密林峡谷间的溪流中1,是一种重要的经济养殖动物2。研究棘胸蛙胚胎发育特征与发育时序,对提高其繁殖效率,实现养殖的提质增效具有重要意义3。近年来,关于养殖动物胚胎发育的研究较多,如在鱼类中,马口鱼(O p s a r i i c h t h y sb i d e n s)4、淡水石 首 鱼(A p l o d i n o t u sg r u n n i e n s)5、北 方 须 鳅(B a r b a t u l ab a r b a t u l an u d a)6等胚胎发育时序特征均得到研究。在两栖类中,王玉柱等7分析了不同水温对黑斑蛙(P e l o p h y l a xn i g r o m a c u l a t u s)胚胎发育的影响,认为黑斑蛙受精卵的最适孵化水温为2 42 7;徐骁骁等8发现,东北林蛙(R a n ad y b o w s k i i)在水温1 2 时,胚胎发育时间最长,在2 4时发育时间最短。此外,在虎纹蛙(R.t i g r i-n a)9-1 0、无 斑 雨 蛙(R.t i g r i n a)1 1、中 华 大 蟾 蜍(B u f og a r g a r i z a n s)1 2等中均有相关研究。而对棘胸蛙胚胎发育研究较少,仅见陈雯等1 3分析了温度对棘胸蛙胚胎发育表征影响及虞鹏程等1 4对棘胸蛙胚胎发育时间及形态特征进行了初步研究。胚胎发育过程是多种理化因子共同作用的结果,其中,体内抗氧化酶系统通过不断清除多余的自由基,维持机体稳态,研究胚胎发育过程中抗氧化酶活性变化,对提高胚胎成活率具有重要意义。因此,笔者以人工养殖的棘胸蛙为亲本,通过仿生态繁殖方式获得棘胸蛙的受精卵,对其胚胎发育时序和形态特征进行详细描述,同时分析胚胎发育过程中的抗氧化酶活性变化,旨在丰富棘胸蛙胚胎发育的基础资料,为棘胸蛙的高效制种提供技术参考。1 材料与方法1.1 试验材料试验选用广东省清远市英德市盈信农业有限公司全人工养殖的棘胸蛙作为繁殖亲本(2 0 0g/只),按雌雄比11进行养殖,采用仿生态繁殖方式获得受精卵。选取同一批次的受精卵3 0 0粒置于6 0c m4 0c m2 0c m水泥池中进行微流水孵化,池水溶解氧质量浓度6.5m g/L,水温(2 4.50.5),p H7.57.9。及时清除未受精的卵或者死卵。所用酶活性测定试剂盒均购于南京建成生物科技有限公司,采用紫外可见光分光光度计法(7 5 2型,上海菁华仪器有限公司)进行酶活性测定。1.2 胚胎发育观察按照熊荣川等1 5对凹耳臭蛙(O d o r r a n at o r-m o t a)胚胎发育时序的鉴别方法,观察记录棘胸蛙不同发育阶段形态特征及积温需求。通过P h e n i xX T L-1 6 5-VT体视显微镜对胚胎发育过程进行活体拍照观察,并记录各时期典型特征和胚胎发育时序。受精后至囊胚期前,每隔1 0m i n观察拍摄记录1次,往后每隔3 0m i n观察拍摄记录1次。每次随机取3 0粒卵,观察至出膜,拍照采样后,剩余的卵继续放回原池孵化。以6 0%以上样本进入该阶段确定胚胎发育阶段。胚胎发育积温(K,h)按下式计算:K=tT式中,t为各发育阶段持续时间(h),T为该发育阶段平均水温()。为保 障 拍 照 清 晰,用 镊 子 对 胚 胎 进 行 去 膜处理。1.3 胚胎酶采样与活性测定分别取3 2细胞期、原肠中期、心跳期、卵黄吸尽期4个发育阶段的胚胎各1 0粒,去膜处理后置于2m L离心管中,保存于-2 0冰箱,用于后续谷丙转氨酶、超氧化物歧化酶、谷草转氨酶、过氧化氢酶活性测定及丙二醛含量测定。其中每个样品设3个生物学平行,每个平行测定3次,取平均值,并计算标准差。1.4 数据处理和分析采用S P S S1 8.0进行数据统计和整理,用D P S7.0 5软件进行单因素方差分析,应用邓肯检验方法进行均值间的多重比较,用S i g m a p l o t1 0.0进行作图,A d o b eP h o t o s h o pC C2 0 1 9进行图片的编辑处理。数据用平均值标准差表示。2 结果与分析2.1 胚胎发育棘胸蛙胚胎在水温(2 4.50.5)下,由受精卵至出膜需2 2 2.9 4h,总积温5 4 6 2.0 3h。由受精卵至卵黄吸尽期耗时2 8 8.4 4h,总积温7 0 6 6.7 8h。整个胚胎发育过程可以分为7个阶段2 4个时期,即受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、器官分化期及孵出期。2 4个时期分别为受精卵期、2细胞期、4细胞期、8细胞期、1 6细胞期、3 2细胞期、6 4细胞期、多细胞期、囊胚早期、囊胚晚期、原肠早期、原肠中期、原肠晚期、神经板期、神经褶期、神经管形成期、肌肉效应期、心跳期、外鳃形成期、晶体形成期、眼球色素期、体色素出现期、出膜期以及卵黄吸尽期。胚胎发育各个时期特征描述见表1和图1。2.1.1 受精卵棘胸蛙受精卵为沉黏性卵,卵径(4.3 10.6 9)mm。卵的动 物极具有黑 色色素冠,占 整个 卵 的1/3,植物极为白色,卵外包有3层胶膜,吸水膨胀后,动物极朝上,植物极朝下。本阶段历时1 2h,积温2 9 4h(图1 a)。2.1.2 卵裂期受精1 2h后,胚胎进入2细胞期,受精卵开始第1次卵裂,将动物极分裂成2个大小相等的分裂球,外胶膜继续吸水膨大(图1 b)。受精1 3.6 7h后,胚胎进入4细胞期,开始第2次分裂,形成的分裂沟与第1次的垂直,将动物极分裂成4个大小相等的分裂球(图1 c)。受精1 4.8 7h后,胚胎进入8细胞期,开始第3次分裂,形成的分裂沟平行于第1次而垂直于第2次,将动物极分裂成8个大小相等的分裂球(图1 d),前3次分裂均为经裂。受精1 5.7 8h后,胚胎进入1 6细胞期,开始第4次分裂,为纬裂,形成的分裂沟偏向于动物极(图1 e)。受精1 6.8 3h、1 7.6h后,胚胎进入3 2、6 4细胞期,分别进行了第5次和第6次分裂(图1 f、g),卵裂有经裂也有纬裂,其外围仍为分裂不完整的细胞,分裂线仍未进入无色素区,胶膜仍在增厚。受精1 8.3 0h后,胚胎进入多细胞期,卵裂仍在动物性半球色素区内进行,分裂球从中央至边周,中央的体积小,边缘的体积大,胶膜仍在增厚(图1 h)。完成卵裂期的有效发育积温达到4 4 8.3 5h。2.1.3 囊胚期受精2 0.4 0h后,胚盘隆起厚度达到最高,胚胎进入囊胚早期,此期无色素区也出现了分裂沟,分裂球表面不平,排列不规则,各分裂球之间界线清楚,外观呈染葚状。此时偏动物极端已可透视到小分裂腔,到此期后,胶膜不再吸水膨胀。此时,内层胶膜直径(6.2 10.4 0)mm,中层胶膜直径(8.90.2 7)mm,外 层 胶 膜 直 径(1 2.8 61.4 6)mm(图1 i)。受精2 6.3 7h后,胚胎进入囊胚晚期,分裂球更小,动物极细胞界线不清,表面光滑,植物极呈灰白色,其间稀疏布有小黑点,囊胚腔扩大,但仍位于动物性半球中部(图1 j)。2.1.4 原肠胚受精3 3.3 9h后,在赤道线下,色素冠边缘处,5501第6期谢永广等:棘胸蛙胚胎发育观察与相关抗氧化酶活性变化研究部分细胞内陷及卷入,形成色素较深的新月形凹陷胚孔,胚胎进入原肠早期(图1 k)。受精3 6.8 6h后,胚胎进入原肠中期。其背唇沿色素边缘继续向两侧延伸,形成马蹄形的侧唇,且背唇加厚加宽,无色素细胞随卵裂个体继续变小,并不断被小细胞包入(图1 l)。此期,原肠腔明显,位于囊胚腔背方。受精4 4.0 3h后,胚胎进入原肠晚期。到此时,含色素的小细胞继续下包到全卵的4/5,原口背唇区加厚,侧唇和腹唇形成,原口明显,卵黄栓明显(图1 m)。2.1.5 神经胚期受精5 3.5 5h后,胚胎进入神经板期,卵黄栓进一步缩小,在原口背唇前方,神经物质在未来胚胎背部集中,稍呈平板状,形成盾状的神经板(图1 n)。受精5 6.5 2h后,胚胎进入神经褶期,神经板前端和两侧之边缘隆起成褶,中央凹陷成神经沟,两侧神经褶分化出明显的感觉板,并在其两侧起棱褶(图1 o)。受精6 5.0 9h后,胚胎进入神经管形成期,神经褶完全愈合成神经管,头部和躯体之间两侧有显著收缩,出现感觉板和鳃板。此时,体节已有81 0对,尾芽原基出现(图1 p)。2.1.6 器官分化期受精6 9.4 6h后,胚胎进入肌肉效应期,此时尾芽形成,胚体在水中受到刺激后能作左右扭曲收缩,嗅窝出现,在光照下显微观察可见胚休表面有晶莹的感觉芽(图1 q)。受精8 5.8 1h后,胚胎进入心跳期,神经管前部已分化成前、中、后3个脑泡,尾的雏形形成,在头的腹面形成口凹,视囊原基出现,鰓芽形成,在头部腹方出现心脏,心脏跳动,开始较慢,以后加快(图1 r)。受精9 3.6 4h后,胚胎进入外鳃形成期,鳃芽伸长形成外鳃,视囊明显,外鳃表1 棘胸蛙胚胎发育分期和主要特征 T a b.1 E m b r y o n i cd e v e l o p m e n t a l s t a g e s a n dm a i nc h a r a c t e r i s t i c s o f g i a n t s p i n yf r o gQ.s p i n o s a发育时期D e v e l o p m e n t a l s t a g e耗时/hT i m ed u r a t i o n积温/hA c c u m u l a t i v e t e m p e r a t u r e图序P l a t e受精卵F e r t i l i z e de g g00.0 0a2细胞期2-c e l l s t a g e1 2.0 02 9 4.0 0b4细胞期4-c e l l s t a g e1 3.6 73 3 4.9 2c8细胞期8-c e l l s t a g e1 4.8 73 6 4.3 2d1 6细胞期1 6-c e l l s t a g e1 5.7 83 8 6.6 1e3 2细胞期3 2-c e l l s t a g e1 6.8 34 1 2.3 4f6 4细胞期6 4-c e l l s t a g e1 7.6 04 3 1.2 0g多细胞期M u l t i-c e l l s t a g e1 8.3 04 4 8.3 5h囊胚早期E a r l yb l a s t u l as t a g e2 0.4 04 9 9.8 0i囊胚晚期L a t eb a l a s t u l as t a g e2 6.3 76 4 6.0 7j原肠早期E a r l yg a s t r u l as t a g e3 3.3 98 1 8.0 6k原肠中期M i d-g a s t r u l as t a g e3 6.8 69 0 3.0 7l原肠晚期L a t eg a s t r u l as t a g e4 4.0 31 0 7 8.7 4m神经板期N e u r a l p l a t es t a g e5 3.5 51 3 1 1.9 8n神经褶期N e u r a l f o l ds t a g e5 6.5 21 3 8 4.7 4o神经管形成期N e u r a l t u b es t a g e6 5.0 91 5 9 4.7 1p肌肉效应期M u s c u l a r r e s p o n s es t a g e6 9.4 61 7 0 1.7 7q心跳期H e a r tb e a t i n gs t a g e8 5.8 12 1 0 2.3 5r外鳃形成期G i l l c i r c u l a t i o ns t a g e9 3.6 42 2 9 4.1 8s晶体形成期C o r n e a t r a n s p a r e n t s t a g e1 2 5.5 03 0 7 4.7 5t眼球色素期E y e b a l l p i g m e n t a t i o ns t a g e1 5 0.1 03 6 7 7.4 5u体色素出现期B o d yp i g m e n t e m e r g e n c es t a g e1 6 9.4 24 1 5 0.7 9v出膜期H a t c h i n gs t a g e2 2 2.9 45 4 6 2.0 3w卵黄吸尽期Y o l ke x h a u s t e ds t a g e2 8 8.4 47 0 6 6.7 8x 1,x 26501水 产 科 学第4 2卷图1 棘胸蛙胚胎发育分期F i g.1 S t a g e s o f e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t o f g i a n t s p i n yf r o gQ.s p i n o s aa.受精卵;b.2细胞期;c.4细胞期;d.8细胞期;e.1 6细胞期;f.3 2细胞期;g.6 4细胞期;h.多细胞期;i.囊胚早期;j.囊胚晚期;k.原肠早期;l.原肠中期;m.原肠晚期;n.神经板期;o.神经褶期;p.神经管形成期;q.肌肉效应期;r.心跳期;s.外鳃形成期;t.晶体形成期;u.眼球色素期;v.体色素出现期;w.出膜期;x 1.卵黄吸尽期(背面图);x 2.卵黄吸尽期(腹面图).a.F e r t i l i z e de g g;b.2-c e l ls t a g e;c.4-c e l ls t a g e;d.8-c e l ls t a g e;e.1 6-c e l ls t a g e;f.3 2-c e l ls t a g e;g.6 4-c e l ls t a g e;h.m u l t i-c e l l s t a g e;i.e a r l yb l a s t u l a;j.l a t eb l a s t u l as t a g e;k.e a r l yg a s t r u l as t a g e;l.m i d-g a s t r u l as t a g e;m.l a t eg a s t r u l as t a g e;n.n e u r a l p l a t es t a g e;o.n e u r a l f o l ds t a g e;p.n e u r a l t u b e s t a g e;q.m u s c u l a r r e s p o n s e s t a g e;r.h e a r t b e a t i n gs t a g e;s.g i l l c i r c u l a t i o ns t a g e;t.c o r n e a t r a n s p a r e n t s t a g e;u.e y e b a l l p i g m e n t a t i o ns t a g e;v.b o d yp i g m e n t e m e r g e n c es t a g e;w.h a t c h i n gs t a g e;x 1.y o l ke x h a u s t e ds t a g e(t h ed o r s a l v i e w);x 2.y o l ke x h a u s t e ds t a g e(t h ev e n t r a l v i e w).7501第6期谢永广等:棘胸蛙胚胎发育观察与相关抗氧化酶活性变化研究鳃丝末端可见血球缓慢流动。后期时,嗅窝形成,视囊发展成视杯,口开通成V形,肛凹出现,听囊形成(图1 s)。受精1 2 5.5 0h后,胚胎进入晶体形成期,口的上、下颚正在分化,外鳃丝已形成2对,尾部鳍膜变厚,边缘呈波浪形,镜检血球在尾鳍血管中流动(图1 t)。受精1 5 0.1 0h后,胚胎进入眼球色素期。此时,眼球出现黑色素,尾鳍膜宽度增加,外鳃分化完成(图1 u)。受精1 6 9.4 2h后,胚胎进入体色素出 现 期,胚 胎 先 从 体 背 部 中 间 出 现 黑 色素,外鳃鳃丝已长足长度,鳃丝透明,鳃盖开始形成(图1 v)。2.1.7 孵出期受精2 2 2.9 4h后,胚胎进入出膜期,卵黄进一步被吸收,口唇部长出角质齿,肛门尚未开通(图1 w)。此时,多数胚胎的右鳃盖已闭合,并开始孵化出膜。随后,左鳃盖闭合,外鳃完全消失,仅在鳃腔后侧留有一圆形出水孔。2.1.8 卵黄吸尽期受精2 8 8.4 4h后,胚胎进入卵黄吸尽期。此时胚胎尾长(8.9 30.4 9)mm,全长(1 3.9 10.6 8)mm,体宽(3.2 10.2 2)mm。卵黄完全被吸入,卵黄细胞区的细胞形成中肠,它在腹部盘绕1.52.0圈,肛门开通(图1 x 1、x 2)。2.2 棘胸蛙胚胎发育过程中酶活性变化棘胸蛙胚胎发育过程中3 2细胞期、原肠中期、心跳期、卵黄吸尽期4个发育阶段过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶的活性以及丙二醛含量的变化见图2。其中,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶及谷丙转氨酶活性变化趋势基本一致,均是“下降-上升-下降”的趋势,且均是在原肠中期酶活降低。而谷草转氨酶却在原肠中期酶活性出现最高点,然后持续下降。丙二醛含量在原肠中期有一个显著降低的过程(P 0.0 5),而后在心跳期显著上升。然而在卵黄吸尽期丙二醛含量却降至最低,显著低于其他各个时期。图2 棘胸蛙胚胎发育过程中主要抗氧化酶活性与免疫指标变化F i g.2 C h a n g e s i na n t i o x i d a n t e n z y m ea c t i v i t i e s a n d i mm u n o l o g i c a l i n d i c a t o r sd u r i n ge m b r y o n i cd e v e l o p m e n t o f g i a n t s p i n yf r o gQ.s p i n o s a图中横坐标的1、2、3、4分别代表3 2细胞期、原肠中期、心跳期、卵黄吸尽期;图上标有不同小写字母表示差异显著(P0.0 5).1.3 2-c e l l s t a g e;2.m i d-g a s t r u l a s t a g e;3.h e a r t b e a t i n gs t a g e;4.y o l ke x h a u s t e ds t a g e;m e a n sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r s a r e s i g n i f i c a n t d i f f e r-e n c e s(P0.0 5).8501水 产 科 学第4 2卷 此外,过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶4种酶的活性均在卵黄吸尽期达到最低,而丙二醛含量达到最低点为原肠中期。各个酶在最低点时的活性依次为谷丙转氨酶超氧化物歧化 酶谷 草 转 氨 酶过 氧 化 氢 酶,分 别 为(4 1.4 87.2 3)U/g、(1 0 1.8 42 9.8 2)U/g、(1 2 0.9 14 2.1 8)U/g和(5 5 5.9 53 7.4 0)U/g。各种酶活性达到最高点的阶段不同,如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷丙转氨酶在心跳期活性达到最高,丙二醛含量在3 2细胞期达到最高,谷草转氨酶在原肠中期活性达到最高。3 讨 论3.1 棘胸蛙胚胎发育特征胚胎受精卵大小对其早期发育时间和成活率具有重要影响,一般认为,温度相同条件下,相近物种卵径越大,内源性营养物质越充足,能够维持胚胎发育 的 时 间 就 越 长,其 发 育 速 率 则 会 相 应 减慢1 6。本试验 中,棘胸 蛙 受 精 卵 直 径 为(4.3 10.6 9)mm,在水温(2 4.50.5)条件下,胚胎从受精卵至出膜期用时2 2 2.9 4h。与虞鹏程等1 4对棘胸蛙胚胎观察结果基本一致。棘胸蛙受精卵发育至卵黄吸尽 期,共耗时2 8 8.4 4h;黑 斑 蛙 卵 径 为(1.7 50.0 5)mm,远小于棘胸蛙,同样温度条件下,胚胎发育所需时间仅需1 2 0h7;虎纹蛙受精卵卵径为(1.60.1)mm,水温为(2 51)时,完成胚胎发育仅需要9 2.5h9-1 0;饰纹姬蛙(M i c r o h y l ao r n a t a)卵径为(0.9 90.0 3)mm,在(2 40.5)下完成胚胎发育仅需6 1.8 6h1 7。此外,在鱼类中也有类似的现象,如白条双锯鱼(Am p h i p r i o nf r e-n a t u s)1 8、毕 加 索 双 锯 鱼(A.p e r c u l aA.o c e l-l a r i s)1 9、眼斑双锯鱼(A.o c e l l a r i s)2 0、棘颊雀鲷(P r e m n a s b i a c u l e a t u s)2 1受精卵卵径依次减小,完成胚胎发育所需时间也依次缩短。同属于石首鱼科的 大 黄 鱼(L a r i m i c h t h y sc r o c e a)2 2、黄 姑 鱼(N i b e aa l b i f l o r a)2 3、淡 水 石 首 鱼(A p l o d i n o t u sg r u n n i e n s)5等,在温度相近(2 3.50.5)情况下,胚胎发育完成时间也按照其卵径大小依次减少:淡水石首鱼(1.4 80.0 9)mm2 7h、大黄鱼(1.2 60.0 8)mm2 5.5h、黄姑鱼(0.8 30.0 2)mm2 3h。此外,蛙类的发育具有种属特异性,如棘胸蛙胚胎在8细胞期时,第3次卵裂为经裂且只在动物极进行,这与虎纹蛙一致9,而与黑斑蛙7、饰纹姬蛙1 7、中国林蛙(R.c h e n s i n e n s i s)2 4等纬裂不同,而凹耳臭蛙胚胎在8细胞期多数是经裂,极少数是纬裂1 5。同时,不同种类蛙的胚胎出膜顺序也有差异,如中国林蛙在鳃血循环期后开始出膜2 4,虎纹蛙在心跳期开始出膜9,饰纹姬蛙则更早,在胚胎转动期即出膜1 7,其后才开始鳃盖闭合。3.2 温度对棘胸蛙胚胎发育的影响水温是影响胚胎发育速率和成活率的重要因素之一2 5。在胚胎发育过程中,主要由卵黄供应营养,随着温度的 升高,卵黄 蛋 白 降 解 酶 的 活 性 增强,为胚胎发育提供更多的营养,进而加快胚胎发育速度2 4。因此,在适宜的温度范围内,胚胎的发育速率与水温正相关。但温度过高或过低均会对胚胎发育造成影响,如提高畸形率或者导致发育停滞2 6。因此选择适宜的胚胎发育温度对提高胚胎成活率具有重要作用。王玉柱等7研究发现,在水温1 8时,黑斑蛙完成胚胎发育需要2 0 4h,而当温度升高到3 3时,则仅需要6 0h,且随着温度由1 8升至3 3,黑斑蛙胚胎成活率呈现先升后降的趋势,并 认 为 黑 斑 蛙 胚 胎 发 育 的 适 宜 水 温 为2 42 7。此外东北林蛙胚胎发育速率与环境温度正相关,水温由1 2 升至2 4 的过程中,胚胎发育所需 时 间 也 由3 2 8.3h缩 短 至1 5 7.2h(伊春种群)8,虎纹蛙受精卵孵化的适宜水温为2 43 49-1 0。在本试验中,水温(2 4.50.5),棘胸蛙从受 精 卵 至 出 膜 期 历 时2 2 2.9 4h,总 积 温5 4 6 2.0 3h。从 受 精 卵 至 卵 黄 吸 尽 期 历 时2 8 8.4 4h,总积温7 0 6 6.7 8h,明显高于棘胸蛙受精卵孵化的适宜水温2 02 3 1 3,但与虞鹏程等1 4对棘胸蛙受精卵发育所需水温研究基本一致,这种情况有可能是由于不同地理种群对温度需求差异引起的8。此外,鱼类受精卵孵化所需时间也与温度正相关,如马口鱼孵化水温由1 9 升至2 5时,孵化时间由6 2h缩短至5 0h4。同样,北方须鳅孵化水温由31 5升至82 4时,孵化时间由4 8 0h缩短至9 8h6。3.3 棘胸蛙胚胎发育过程中相关免疫酶活性变化胚胎发育过程中,由于机体代谢作用,会产生大量的活性氧自由基,高浓度的活性氧自由基会迟滞胚胎细胞的分裂分化,因此,体内抗氧化酶系统需要不断地清除多余的活性氧自由基,维持机体稳态2 7-2 8。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶通过将过量的活性氧自由基转化为水而维持机体平衡2 9。用镉处理中华大蟾蜍,发现其清除活性氧自由基的能力降低,推测镉的致畸作用可能与清除活性氧能力的降低有关3 0-3 1。而用邻二甲苯和原油水溶物处9501第6期谢永广等:棘胸蛙胚胎发育观察与相关抗氧化酶活性变化研究理湖蛙(R.r i d i b u n d a)后,其体内丙二醛含量均升高,而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性均降低3 2。在本试验中,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性变化呈现“下降-上升-下降”的趋势,且在原肠中期均有一个显著下降的过程,同时在卵黄吸尽期达到最低。类似的现象在两栖类也有发现,如在研究南美蟾蜍(B.a r e n a r u m)胚胎发育过程中,发现超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性在未受精的卵中较高,而超氧化物歧化酶活性在鳃完全活跃和盖襞开始形成时显著增加3 3。抗氧化酶可能存在诱导、失活的双重反应,主要受氧化应激水平对P O S靶标的影响3 4。在原肠中期和卵黄吸尽期耗时较长,胚胎分裂速度减缓,代谢率降低导致超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性也相对降低。同时可能也与超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的母性遗传有关3 5,在原肠中期随着胚胎中母性遗传蛋白的逐渐消耗,而自身酶合成系统尚未形成,导致超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性下降。随后,胚胎的抗氧化系统随之建立,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性也逐渐上升,类似的结果在斑马鱼(D a n i or e r i o)3 6中也得到验证。丙二醛是细胞发生脂质过氧化反应中最具代表性的产物,其含量水平可以指示脂质过氧化反应及细胞受损伤程度3 7,当机体活性氧自由基过多引起脂质过氧化反应后,丙二醛含量增加,使机体细胞损伤加大3 8。在原肠中期和卵黄吸尽期,由于胚胎分裂速度减缓,代谢降低,活性氧自由基减少,因此丙二醛含量也将在原肠中期和卵黄吸尽期出现降低的现象,类似的结果在对两栖类进行毒性试验处理的实践中得到广泛验证3 0-3 3。4 结 论试验观察了棘胸蛙胚胎发育时序与特征,棘胸蛙产沉黏性卵,卵径(4.3 10.6 9)mm,分为动物极和植物极。在水温(2 4.50.5)条件下,受精卵至出膜历时2 2 2.9 4h,至卵黄吸尽期历时2 8 8.4 4h,总积温7 0 6 6.7 8h,整个胚胎发育过程可分为7个阶段2 4个时期。酶活性分析发现,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶在原肠中期和卵黄吸尽期活性降低,可能与该阶段胚胎分裂速度减慢以及自身酶合成系统形成时间有关。试验研究结果将为棘胸蛙的繁殖生物学和高效制种技术提供基础资料。参考文献:1HU WF,D ONGBJ,KON GSS,e t a l.P a t h o g e nr e-s i s t a n c ea n dg e n ef r e q u e n c ys t a b i l i t yo fm a j o rh i s t o-c o m p a t i b i l i t yc o m p l e xc l a s sI I B a l l e l e si nt h eg i a n ts p i n yf r o gQ u a s i p a as p i n o s aJ.A q u a c u l t u r e,2 0 1 7,4 6 8:4 1 0-4 1 6.2 舒妙安.棘胸蛙肌肉营养成分的分析()一般营养成分的含量及脂肪酸的组成J.浙 江大 学学 报(理 学版),2 0 0 0,2 7(4):4 3 3-4 3 7.3 魏朝宇,汪小冬,魏秀英,等.5个棘胸蛙养殖群体微卫星遗传多样性分析J.广西师范大学学报(自然科学版),2 0 2 2,4 0(6):2 0 6-2 1 4.4 骆小年,段友健,郭童,等.北方须鳅人工繁殖与胚胎发育研究J.大连海洋大学学报,2 0 2 1,3 6(2):1 8 7-1 9 4.5 张亮,闻海波,郑冰清,等.淡水石首鱼人工催产与胚胎发育观察J.中国水产科学,2 0 2 1,2 8(5):5 6 9-5 7 8.6 骆小年,段友健,张晓静,等.北方马口鱼全人工繁殖、胚胎与仔鱼发育研究J.大连海洋大学学报,2 0 2 2,3 7(4):5 5 0-5 5 7.7 王玉柱,刘文舒,李思明,等.不同水温对黑斑蛙胚胎发育的影响J.水产科学,2 0 2 0,3 9(6):9 4 1-9 4 6.8 徐骁骁,赵文阁,刘鹏.环境温度对东北林蛙不同地理种群繁殖期 体 温 和 胚 胎 发 育 的 影 响 J.生 态 学 报,2 0 1 8,3 8(8):2 9 6 5-2 9 7 3.9 刘楚吾,徐贺伦,冯超源,等.环境因素对虎纹蛙胚胎发育的影响J.湛江海洋大学学报,2 0 0 1,2 1(2):7-1 2.1 0刘丽,刘楚吾,罗隆胜.泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究J.广东海洋大学学报,2 0 0 8,2 8(1):1 9-2 4.1 1向孙军,张芳宇,向柄权.无斑雨蛙早期胚胎发育研究J.怀化学院学报,2 0 0 9,2 8(8):3 6-3 9.1 2朱艳芳,高波,张爱民,等.温度和光照时间对中华大蟾蜍胚胎发育的影响J.安徽农业科学,2 0 1 2,4 0(3 0):1 4 7 4 8-1 4 7 4 9.1 3陈雯,俞宝根,郑荣泉,等.温度对棘胸蛙胚胎发育及蝌蚪表型特征的影响J.贵州农业科学,2 0 1 0,3 8(1):1 0 8-1 1 0.1 4虞鹏程,林光华.棘胸蛙早期胚胎发育的初步观察J.水生生物学报,1 9 9 5,1 9(3):2 1 6-2 2 2.1 5熊荣川,江建平,费梁,等.凹耳臭蛙胚胎发育及其分类学意义J.动物学研究,2 0 1 0,3 1(5):4 9 0-4 9 8.1 6B O B EJ,L A B B C.E g ga n ds p e r mq u a l i t y i n f i s hJ.G e n e r a la n d C o m p a r a t i v e E n d o c r i n o l o g y,2 0 1 0,1 6 5(3):5 3 5-5 4 8.1 7耿宝荣,温青,张秋金.饰纹姬蛙的早期胚胎发育J.动物学杂志,1 9 9 6,3 1(5):1 7-2 1.1 8鲍鹰,张鹏,祝承勇,等.红小丑人工繁殖和育苗的初步研究J.海洋科学,2 0 0 9,3 3(2):5-1 0.1 9何丽斌,朱志煌,马敏宁,等.毕加索小丑鱼胚胎发育的形态 学 观 察 J.应 用 海 洋 学 学 报,2 0 1 7,3 6(4):5 4 5-5 4 9.2 0鞠晨曦,李云,刘红,等.眼斑双锯鱼胚胎发育的形态学观察J.海洋渔业,2 0 1 4,3 6(1):8-1 5.2 1单乐州,邵鑫斌,闫茂仓,等.透红小丑鱼的繁殖习性、0601水 产 科 学第4 2卷胚胎发育和胚后发育J.水产科技情报,2 0 1 5,4 2(1):2 5-2 9.2 2程顺,杜晨,竺俊全,等.岱衢洋大黄鱼(P s e u d o s c i a e n ac r o c e a)胚胎与仔稚幼鱼发育J.海洋科学进展,2 0 1 4,3 2(4):5 5 1-5 5 9.2 3耿 智,徐 冬 冬,史 会 来,等.黄 姑 鱼(N i b e aa l b i f l o r aR i c h a r d s o n)早 期生 长发 育 研究 J.海 洋 科 学 进 展,2 0 1 2,3 0(1):7 7-8 6.2 4陈伟庭,李东风.中国林蛙早期胚胎发育观察J.华南师范大学学报(自然科学版),2 0 0 5,3 7(3):3 6-4 1.2 5P U V A N E N D R A N V,F A L K-P E T E R S E NIB,L Y S N EH,e t a l.E f f e c t so fd i f f e r e n t s t e p-w i s e t e m p e r a t u r e i n-c r e m e n t r e g i m e sd u r i n ge g g i n c u b a t i o no fA t l a n t i cc o d(G a d u s m o r h u aL.)o n e g g v i a b i l i t y a n d n e w l yh a t c h e dl a r v a l q u a l i t yJ.A q u a c u l t u r eR e s e a r c h,2 0 1 5,4 6(1):2 2 6-2 3 5.2 6柴学军,