不同途径注射质粒微泡对超声...基因在兔骨缺损处转染的影响_李世伟.pdf

基金项目:四川省科技厅重点研发项目(2019YFS0265)作者简介:李世伟，男，1988 05 生，硕士，主治医师，E-mail:lswlsh163 com收稿日期:2022 11 10不同途径注射质粒微泡对超声微泡破碎技术介导 EGFP 基因在兔骨缺损处转染的影响李世伟，杨晓东，唐学阳*(四川大学华西医院小儿外科，成都610041;*通讯作者，E-mail:tangxueyang100163 com)摘要:目的探讨超声微泡破碎技术介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因在兔骨缺损处转染时，不同途径注射质粒微泡混悬液对转染效率及局部组织的影响。方法3 月龄新西兰大白兔 10 只，制备右尺骨骨缺损模型，按照随机数字表法分为静脉组和断端间组(n=5)。静脉组和断端间组造模后第 10 天分别经耳缘静脉或骨缺损断端间向兔体内注射携带 EGFP 基因的质粒微泡混悬液(03 ml/kg)。在超声频率1 MHz，超声强度10 W/cm2，占空比20%条件下，对两组骨缺损部位超声辐照1 min，进行 EGFP 基因转染。在基因转染后1 周时处死兔，于骨缺损处获取标本制作切片，荧光染色观察各组 EGFP 表达情况。采用病理图像分析软件分析计算平均光密度。HE 染色观察断端间软组织病理特点。结果静脉组和断端间组均观察到绿色荧光蛋白表达。断端间组平均光密度高于静脉组，差异有统计学意义(0 034 5 0 002 8 vs 0 000 4 0000 1，P0 05)。表达绿色荧光蛋白的细胞主要为骨骼肌细胞，各组未见细胞坏死征象。结论超声微泡破碎技术介导EGFP 基因在兔骨缺损处转染时，其效率受不同途径注射质粒微泡混悬液的影响，骨缺损断端间直接注射优于静脉注射。关键词:超声微泡破碎技术;增强型绿色荧光蛋白;基因治疗;骨缺损;新西兰大白兔中图分类号:683文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0493 05DOI:1013753/j issn1007 6611202304012Effect of different injection routes of plasmid-microbubble suspension on EGFP gene transfection in bone defect using ultra-sound-mediated microbubble destructionLI Shiwei，YANG Xiaodong，TANG Xueyang*(Department of Pediatric Surgery，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu610041，China;*Corresponding author，E-mail:tangxueyang100163 com)Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of different injection routes of plasmid-microbubble suspension on enhanced greenfluorescence protein(EGFP)gene transfection in tissue between bone defects by ultrasound-mediated microbubble destructionMethodsBone defect models were generated on the right ulnas of ten 3-month-old New Zealand rabbits，and then they were divided intointravenous injection group and local injection group by means of random number table，with five in each group At day 10 after modelgeneration，the suspension of plasmids carrying EGFP gene and microbubbles(0 3 ml/kg)was injected via ear vein in intravenousinjection group and injected at bone defect sites in local injection group(0 3 ml/kg)Ultrasound was performed at bone defect sites ata frequency of 1 MHz，an intensity of 1 W/cm2，and a duty ratio of 20%for one min to mediate the gene transfection All rabbits weresacrificed for sample harvesting at day 7 after gene transfection The EGFP expression was quantified by average optical density undera fluorescence microscope Pathological features of tissue damage were observed under an optical microscopeesultsGreen fluores-cence protein was observed in both two groups The average optical density was significantly higher in local injection group than that inintravenous injection group(0 034 5 0 002 8 vs 0 000 4 0 000 1，P0 05)Green fluorescence protein was mainly expressed inskeletal muscle cells No signs of cell necrosis were found in each groupConclusionThe transfection efficacy is better by injectionof suspension of EGFP plasmids and microbubbles at bone defect site than that of intravenous injectionKey words:ultrasound-mediated microbubble destruction;enhanced green fluorescence protein;gene therapy;bone defect;New Zealand rabbits目前，外伤、感染、肿瘤以及先天性疾病等所导致的骨缺损，仍然是骨科领域里的治疗难题。临床常用修复方法主要是自体或异体骨移植，这些方法存在增加患者损伤以及骨组织来源受限等缺点。此外，异体骨移植还存在潜在的免疫排斥风险以及无骨诱导能力等缺点。生物材料虽然有良好的骨传导性，但其骨诱导能力仍有限1 3。基因治疗已成为骨缺损治疗的思路之一。有动物实验利用病毒载体介导骨形态发生蛋白 2(bonemorphogenetic protein 2，BMP-2)基因治疗骨缺损，取得了一定疗效4，5。由于病毒载体存在潜在毒性及免疫原性等问题，其临床应用受到了限制6 8。超声微泡破碎技术是一种新型的基因转染方法，其基本原理是微泡在超声辐照下产生空化效应和声孔效394山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期应，使靶细胞的细胞膜通透性增加，从而促进目的基因进入靶细胞5 10。超声微泡破碎技术具有安全、高效的特点，目前已应用于肝脏、心脏、肾脏、胰腺等的基础研究5，9，10，但应用于骨缺损相关研究的报道罕见11。超声微泡转基因技术的转染效率和安全性除受到超声参数及辐照时间的影响外，还可能受不同途径注射质粒微泡的影响。本课题组12，13 先前的研究筛选了超声微泡破碎技术介导 EGFP 基因在兔骨缺损处转染时最佳的超声参数及辐照时间。本研究旨在探讨不同途径注射质粒微泡混悬液对超声微泡破碎技术介导 EGFP 基因在兔骨缺损处转染效率及安全性的影响，为该技术应用于骨缺损修复提供实验基础。1材料与方法1 1实验动物及主要试剂、仪器3 月龄 SPF 级雄性新西兰大白兔 10 只，体质量2 5 3 kg，四川大学华西医学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(川)2018 026。pEGFP-C1质粒(北京天漠科技有限公司)、质粒小提试剂盒(Takara 公司，日本)、注射用六氟化硫微泡(BACCO公司，意大利)、Sonic Master ES-2 超声治疗仪(OGGiken 公司，日本)、DP70 光学显微镜(OLYMPUS，日本)、DFC495 正置荧光显微镜(LEICA 公司，德国)等。1 2骨缺损模型的建立新西兰大白兔 10 只，经耳缘静脉注射 3%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)麻醉。麻醉成功后右前肢剃毛，使兔仰卧于手术台，消毒铺巾。切开右前肢中段皮肤皮下，钝性分离肌肉，显露右侧尺骨中断。于右尺骨中段连同骨膜，用线锯切除尺骨段 2 cm，造成骨缺损，缝合切口。麻醉清醒后正常饲养。术前 30 min及术后24，48 h 分别肌注青霉素024 g 预防感染。1 3EGFP 质粒微泡混悬液配制用 pEGFP-C1 质粒转化大肠杆菌 DH5，经过筛选，参照质粒小提试剂盒说明书进行提取、纯化质粒，使 EGFP 质粒终浓度为 1 g/l，20 保存。注射用六氟化硫微泡加入生理盐水震荡均匀，使其浓度为 5 mg/ml，密度为(2 5)108/ml。将制备的EGFP 质粒与微泡按体积比1 2 混匀，制成 EGFP 质粒微泡混悬液，4 保存。1 4EGFP 基因转染造模后第10 天，将制备骨缺损模型的 10 只新西兰大白兔按照随机数字表法均分为静脉组和断端间组，经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠溶液(40 mg/kg)麻醉，起效后固定于手术台，静脉组经耳缘静脉注射EGFP 质粒微泡混悬液(0 3 ml/kg)，断端间组向骨缺损处注射质粒微泡混悬液(0 3 ml/kg)。两组注射后立即用超声治疗仪辐照骨缺损部位进行基因转染。超声参数设置为 1 MHz、1 0 W/cm2、20%占空比，超声辐照时间 1 min。转染后 1 周时，经耳静脉注射过量麻醉药处死两组动物取材进行观测。1 5动物健康状况观察造模后开始直至动物被处死，每日观察各组动物存活情况，记录有无死亡。每日观察进食、饮水及活动情况，记录有无进食量、饮水量减少，有无活动受限。造模后开始直至伤口愈合，每日观察伤口有无渗液、流脓及伤口裂开，记录伤口愈合时间。1 6绿色荧光蛋白表达情况检测取骨缺损处软组织，OTC 包埋剂包埋，20 连续切片，切片厚度 5 m，丙酮固定、晾干，DAPI 染色，荧光显微镜观察切片中有无绿色荧光蛋白表达，比较两组间绿色荧光蛋白表达的强弱，辨别表达绿色荧光蛋白的细胞类型。每只兔选取 3 张绿色荧光蛋白强表达的切片，于 200 倍镜下，每张切片选取 5个荧光蛋白强表达的视野，采图后用 Image-ProPlus6 0 病理图像分析软件进行分析，获得每个视野表达荧光区域的面积及积分光密度，积分光密度除以表达荧光的区域面积获得每个视野的平均光密度值，3 张切片 15 个视野的平均光密度再取均值获得单只兔的平均光密度值。1 7骨缺损断端间软组织病理特点观察取骨缺损处软组织，于 4%多聚甲醛固定 24 h，常规包埋，切片，厚 4 m，常规 HE 染色，光镜观察组织细胞有无水肿、炎症及坏死等表现。1 8统计学分析采用 SPSS22 0 统计分析软件分析，两组平均光密度服从正态分布，数据以均数 标准差(?x s)表示，组间比较采用两个独立样本 t 检验，检验水准=0 05。2结果2 1动物健康状况造模后所有兔均存活至处死前。麻醉清醒后正常进食及饮水，食量及饮水量无下降。造模后 1 周内均有右前肢活动受限。伤口无渗液、流脓及裂开等表现，造模后第 10 天，所有伤口均愈合。2 2绿色荧光蛋白表达情况静脉组和断端间组均有绿色荧光蛋白表达。静494J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4脉组表达的绿色荧光蛋白太弱，荧光显微镜不能清楚辨别出细胞的形态特点，断端间组表达绿色荧光蛋白强(见图 1)。断端间组平均光密度高于静脉组，二者比较差异有统计学意义(0 034 5 0 002 8vs 0 000 4 0 000 1，P 0 05)。断端间组表达绿色荧光蛋白的细胞主要为骨骼肌细胞，此外成纤维细胞、血管内皮细胞、软骨组织及神经纤维等也有表达(见图 2)。2 3骨缺损断端间软组织病理特点两组骨缺损断端间软组织的病理情况相似，可见组织稍水肿，少量中性粒细胞浸润，未见细胞溶解、核碎裂及炎症细胞吞噬等细胞坏死现象(见图 3)。A 静脉组B 断端间组图 1不同注射途径下绿色荧光蛋白的表达(DAPI，200)Figure 1Green fluorescent protein expression by different injection routes(DAPI，200)图 2断端间组表达绿色荧光蛋白的细胞类型(DAPI，200)Figure 2Cell types expressing green fluorescent protein in bone defect injection group(DAPI，200)A 静脉组B 断端间组图 3不同注射途径下骨缺损断端间软组织的病理情况(HE，200)Figure 3Pathological changes of soft tissue by different injection routes(HE，200)594山西医科大学学报，2023 年 4 月，第 54 卷 第 4 期3讨论基因治疗已应用于骨缺损修复的基础研究，其应用于临床需同时具备高效性和安全性。超声微泡作为临床常用的一种造影剂，可用于增强组织回声，改善图像质量，安全性高。同时它还可以作为一种物理的非病毒载体介导基因转染14 16，微泡在超声辐照下被破坏，产生空化作用及声孔效应，扩大毛细血管内皮细胞间隙，增加细胞膜的渗透性，从而安全高效地将目标基因转染至靶细胞6，17，18。目前超声微泡破碎技术应用于骨缺损的研究罕见，本研究将其应用于骨缺损，并进一步探讨了不同途径注射质粒微泡对基因转染效率及安全性的影响。超声微泡破碎技术介导的基因转染，质粒微泡混悬液的注射方式是其转染效率的影响因素之一19，20。在超声微泡破碎技术介导基因转染肝脏、心脏等器官的体内试验中，研究者经静脉途径注射质粒微泡后目的基因得到了安全高效的转染5。Bez 等11 利用超声微泡破碎技术介导骨形态发生蛋白 6 基因(bone morphogenetic protein-6，BMP-6)在猪骨缺损部位进行转染时，经局部注射质粒微泡混悬液后，观察到了 BMP-6 在骨缺损部位短暂的表达和分泌，但他们没有探讨不同途径注射质粒微泡混悬液对转染结局的影响。本实验结果表明，无论是经静脉还是经骨缺损局部注射质粒微泡混悬液，经超声辐照后 EGFP 基因均可在兔骨缺损部位表达。断端间组无论是荧光表达的范围，还是荧光表达的强度均明显强于静脉组。这一结果的原因可能有以下两方面。第一，超声微泡破碎技术介导的基因转染，其转染效率受质粒微泡混悬液浓度的影响。在一定范围内，质粒微泡混悬液的浓度越高，基因转染效率就越高21。静脉注射的质粒微泡经过血液循环，到达骨缺损部位时浓度已大大降低，而局部注射时，质粒微泡集聚于骨缺损局部，浓度较高。第二，静脉注射的质粒微泡需要跨越血管内皮细胞这一屏障才能到达组织细胞膜外5，17，而局部注射的质粒微泡混悬液，直接分布于血管之外的组织细胞之间，无需跨越血管内皮细胞这一屏障，节省了空化效应及声孔效应所产生的能量。综上，同等超声参数条件下，局部注射时，将有更多的目的基因进入靶细胞实现转染与表达。本实验中，超声微泡破碎技术介导了 EGFP 基因在兔骨缺损处的多种细胞转染与表达，但不同类型细胞表达绿色荧光蛋白的强弱程度则相差甚远。这可能与实验所采用的超声微泡无靶向性有关。超声微泡通常由外壳及外壳包裹的气体核心组成。根据微泡表面是否被修饰，超声微泡分为非特异性超声微泡和特异性超声微泡两类。非特异性超声微泡的表面未经修饰，其外壳为蛋白质或脂质外膜，其与病变组织表达的受体可进行非特异性结合。特异性超声微泡表面携带有生物大分子如亲和素分子。生物素化的抗体与靶组织上的特异抗原结合，超声微泡通过亲和素分子与生物素化的抗体结合，从而实现超声微泡特异性地集聚在病变部位21 23。本实验使用的六氟化硫微泡是一种非特异性的超声微泡，这可能是绿色荧光蛋白基因在不同类型细胞表达的原因。虽然本实验未观察到细胞溶解、核碎裂及炎症细胞吞噬等细胞坏死现象，但多种细胞同时被转染的现象可能存在一定的安全隐患，并降低其有效性。超声微泡破碎技术介导目的基因在骨缺损部位转染时，骨缺损断端间直接注射质粒微泡混悬液优于静脉注射。未来需要构建靶向超声微泡进一步提高基因转染效率及安全性，同时需要携带能够促进骨再生的基因进行转染，以便观察这一技术对骨缺损的实际修复效果。参考文献:1Wang J，Yin Q，Gu S，et al Induced membrane technique inthe treatment of infectious bone defect:a clinical analysisJ Orthop Traumatol Surg es，2019，105(3):535 539 2袁宇，徐林 骨髓间充质干细胞联合 3D 生物打印技术治疗骨缺损的研究进展 J 中国医学物理学杂志，2021，38(1):110 126 3Bougioukli S，Saitta B，Sugiyama O，et al Lentiviral gene therapyfor bone repair using human umbilical cord blood-derived mesen-chymal stem cellsJ Hum Gene Ther，2019，30(7):906 917 4Lazard ZW，Heggeness MH，Hipp JA，et al Cell-based genetherapy for repair of critical size 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