DEHP联合铅慢性染毒对小...能力及APP酶解通路的影响_李奇翰.pdf

54|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期DEHP联合铅慢性染毒对小鼠学习记忆能力及 DEHP联合铅慢性染毒对小鼠学习记忆能力及 APP酶解通路的影响APP酶解通路的影响李奇翰，付朝旭，许妍姬延边大学医学院预防医学教研部，吉林延吉133000摘要：目的 探讨邻苯二甲酸二（2-乙基）乙酯（DEHP）与铅（Pb）慢性联合染毒对小鼠学习记忆能力的影响。方法 将80只2个月龄健康雄性昆明种小鼠作为研究对象，将小鼠随机分为正常对照组（CT）组、b组、DEHP染毒组（低、中、高剂量）和DEHP+Pb联合染毒组（低、中、高剂量）共8组，每组5只。分别在小鼠饲料中染毒DEHP，在饮用水中添加乙酸铅染毒12周和24周。在染毒结束后，进行Morris水迷宫实验检测小鼠行为学改变情况，采取ELISA法测定小鼠脑组织中、-分泌酶活性及sAPP与A1-40含量，并对两种物质的联合作用方式进行评价。结果 Morris水迷宫实验结果显示，与CT组比较，12周与24周的DEHP染毒组随着剂量增加小鼠空间学习能力受到的损害更加严重，可导致空间记忆能力障碍，目标象限路程占总路程百分比降低，目标象限游泳时间缩短，潜伏期增加。生化指标表明，与CT组比较，DEHP组和DEHP联合染毒组随剂量增加，-分泌酶活性、sAPP含量降低，-分泌酶活性、A1-40明显增高，24周小鼠表现比12周小鼠更为明显，高剂量组DEHP与Pb联合染毒表现具有一定的拮抗作用。结论 邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯与铅慢性染毒均会对小鼠学习记忆产生损害，对小鼠引起学习记忆能力障碍，DEHP与铅联合染毒具有一定拮抗作用。关键词：邻苯二甲酸双(2-乙基己基)酯；铅；联合染毒；神经毒性DOI:10.19335/ki.2096-1219.2023.05.013 Effect of DEHP Combined with Chronic Lead Exposure on Learning and Memory Abilities and APP Enzymatic Pathway of MiceLI Qihan,FU Zhaoxu,XU Yanji Preventive Medicine Department,Yanbian University Medicine School,Yanji,Jilin 133000 ABSTRACT：Objective To investigate effect of chronic combined exposure of bis(2-ethyl)phthalate(DEHP)and lead(Pb)on learning and memory abilities of mice.Methods The paper chose 80 2-month-old healthy male Kunming mice as research subjects,and divided them into 8 groups randomly:normal control group(CT),Pb group,DEHP exposure group(low,medium,and high dose),and DEHP+Pb combined exposure group(low,medium,and high dose),with 5 mice in each group.Mice were exposed to DEHP in feed and lead acetate in drinking water for 12 and 24 weeks.After exposure,Morris water maze experiment was conducted to detect behavioral changes of mice,and determine contents of,-secretory enzyme activity and sAPP And A 1-40 contents with ELISA method,combined action mode between two substances was evaluated.Results Morris water maze experiment showed,spatial learning ability of DEHP exposure group at 12 and 24 weeks was more severely impaired as dose increased than CT group,which could lead to spatial memory impairment,decrease in percentage of target quadrant distance in total distance,decrease in target quadrant swimming time,and increase in latency.Biochemical indicators showed that,-secretory enzyme activity,sAPP contents of DEHP group and DEHP combined exposure group lower with dose increase,-secretory enzyme activity,A 1-40 increased more significantly than CT group,performance of mice at 24 weeks was more significant than those at 12 weeks.DEHP and Pb combined exposure of high-dose group had some certain antagonistic effect.Conclusion Both chronic exposure to bis(2-ethylhexyl)phthalate and lead can damage learning and memory of mice,cause impairment of learning and memory abilities.Combined exposure of DEHP 基金项目：本文系吉林省中医药科技项目（项目编号：2018-135）；吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目基金（项目编号：JJKH20200532KJ）|55智慧医疗基础研究and lead has some certain antagonistic effect.KEYWORDS：Bis(2-ethylhexyl)phthalate;Lead;Joint exposure;Neurotoxicity0引言邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）属于邻苯二甲酸酯类（PAEs），常作为增塑剂在塑料制品加工行业中广泛使用。近年来，DEHP被视为一种环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors,EEDs）而受到关注，因其与塑料分子之间并非以共价化学键形式牢固结合，故极易通过蒸发、洗涤及燃烧等方式从塑料制品中逸出而污染室内空气、食品及饮水等其他物质1-2。人体可以通过呼吸接触、食品摄入、饮水等途径接触DEHP，其中食品摄入为主要暴露原因。有研究提示DEHP可能会影响人体神经、生殖、内分泌、免疫以及肝脏功能并造成损伤3-5。铅（Pb）作为一种易获得、加工简单且价格低廉的热稳定剂，广泛应用于各类塑料制品行业中。随着生活用品需求日益剧增，含铅废物排放日益激增，造成严重的环境污染，并且危害人体健康6，同时，铅暴露可能会造成人体认知能力损伤或影响神经行为改变，长期低水平铅暴露会对人类健康造成极大的伤害7。阿尔茨海默病（alzheimers disease,AD）是以认知行为恶化和记忆力减退为临床表现的神经退行性疾病，早期症状为近事易忘，多疑及睡眠昼夜节律改变；病情发展症状为远、近期记忆受损伴随计算力、定向力及判断力障碍，或并发其他精神症状。由于其病因机制的复杂性和多样性，目前尚无有效干预手段，因此,预防及治疗AD的研究一直受到世界各国的重视。近年来，PAE类物质中的神经毒性引起科学界的注意，而国内关于PAEs的神经毒性作用的信息却十分有限的，缺少涉及PAE类物质的研究。环境化学污染物是流行病和环境毒理学研究重点，DEHP与Pb可能是具有神经毒性的环境污染物8-9，两者都可能是提高AD发病率的潜在因素之一，同时由于增塑剂DEHP与热稳定剂Pb两者在塑料制品生产过程中难以替换，两者已成为环境中普遍存在的持久性污染物，人体往往通过多种途径同时接触两种物质，而目前针对DEHP和Pb联合暴露诱导的神经毒性潜在机制仍不清楚，国内缺少DEHP与Pb联合暴露对神经系统影响的研究，且关于DEHP的研究多为急性毒性实验，因此研究两者慢性低剂量联合染毒毒性作用具有重要意义。故此次实验对染毒DEHP和Pb的小鼠学习记忆能力进行观察，并研究DEHP与Pb慢性低剂量染毒对APP-酶解通路的影响，为老年痴呆症的发病机制和进展提供重要的科学依据。1材料与方法1.1实验试剂与仪器（1）实验试剂：邻苯二甲酸二乙基己酯纯度99.0%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司乙酸铅、（纯度99.0%,天津市化学试剂三厂）、吐温80（纯度99.0%，天津市科密欧化学试剂有限公司）、小鼠-secretase ELISA kit、小鼠-secretase ELISA kit、小鼠可溶性淀粉酶前体蛋白（sAPP）ELISA kit、小鼠A1-40ELISA kit购于上海酶联生物科技。（2）实验仪器：数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器，HH-6）、酶标仪（南京华东电子）、超声波细胞破碎机（上海乔跃电子）、微量振荡器（无锡县金城仪器厂，型号WZS-2A）、SMA RTV3.0行为学视频追踪系统（美国Hayward公司）、Morris水迷宫（上海欣软）、干式恒温器（江苏海门市其林贝尔仪器制造，GL-150B）。1.2实验动物选适龄昆明种雄性小鼠80只2个月龄左右，56|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期初始体重为（202）g，由延边大学动物实验中心提供。实验前7d进行小鼠环境适应，饲养环境为小鼠饮食饮水均自由，光/暗交替12h周期的无病原体环境（温度为2025，湿度为50%70%）。1.3实验方法1.3.1染毒处理对低、中、高剂量DEHP组和低、中、高剂量DEHP+Pb联合染毒组小鼠饲料进行染毒，以11比例将DEHP与吐温80混合后，按低剂量1.6510-5mLg-1、中剂量3.310-5mLg-1、高剂量6.610-5mLg-1由延边大学动物实验中心对饲料进行染毒加工，对DEHP联合染毒组和Pb组用乙酸铅和双蒸水配制成0.25gL-1于小鼠饮用水染毒。1.3.2实验分组处理将80只小鼠随机分为12周实验组和24周实验组，每组40只。实验组分为正常对照组（CT），Pb组，低剂量（1.6510-5mL/g）DEHP组、中剂量（3.310-5mL/g）DEHP组、高剂量（6.610-5mL/g）DEHP组、低剂量（1.6510-5mL/g）DEHP+Pb组、中剂量（3.310-5mL/g）DEHP+Pb组、高剂量（6.610-5mL/g）DEHP+Pb组，共8组，每组5只。12周/24周染毒组实验分组见表1。1.3.3行为学实验形态观察：染毒期间所有组小鼠均自由进食饮水，每日定期更换染毒饮用水及饲料并观察小鼠的呼吸、状态、毛色、精神状态及体重。Morris水迷宫实验：小鼠连续染毒12周和24周期结束后开始Morris水迷宫训练，为期5d。水迷宫为半径0.6m的圆形水池，水池中安置9cm平台，顶部置有摄像头进行录像拍摄，通过视频分析系统统计分析实验结果。设定水池划分为4个象限，第一、二、三象限池壁设置固定投放点，平台位于第四象限。水池水位高于平台1cm，实验过程保持水温在（231）。定位导航实验：从一、二、三象限的固定投放点位置将小鼠头朝上面向水池壁，投入水中，并同时启动摄像机录像功能，定时60s。记录小鼠从不同象限游上平台的时间为逃避潜伏期。如果60s内小鼠未能成功游上平台，则通过引导棒引导小鼠上第四象限平台，让小鼠停留在平台10s，增强学习记忆力。实验每隔24h训练一次，连续训练4d，测定小鼠空间学习能力。空间探索实验：每间隔24h连续训练4d后，第5d撤去平台，将小鼠从平台所在象限的对角象限第二象限固定点位置投放水中，同时启动摄像机录像系统记录数据。记录小鼠的游泳路线，统计穿台次数和目标象限停留时间，测定小鼠空间记忆能力10。1.3.4生物学指标测定组织匀浆制备：Morris水迷宫实验周期第7天，采用脱颈法处死小鼠,收集小鼠脑组织，置于冰上。用电子天平称量脑组织重量，按10mL/g比例添加PBS（PH为7.5）,采用玻璃匀浆器匀浆，制成脑组织匀浆液，然后在4，12000r/min的条件下离心5min，收集上清液置于-20环境中冷冻保存，待测。表 1实验分组组别染毒方案组名CTDDW空白对照组DEHP11.6510-5 mLg-1DEHP+DDW低剂量 DEHP 组DEHP23.310-5mLg-1DEHP+DDW中剂量 DEHP 组DEHP36.610-5mLg-1DEHP+DDW高剂量 DEHP 组DEHP1+Pb1.6510-5mLg-1DEHP+0.25gL-1Pb+DDW低剂量联合染毒组DEHP2+Pb3.310-5mLg-1DEHP+0.25gL-1Pb+DDW中剂量联合染毒组DEHP3+Pb6.610-5mLg-1DEHP+0.25gL-1Pb+DDW高剂量联合染毒组Pb0.25gL-1Pb+DDW铅染毒组|57智慧医疗基础研究1.3.5ELISA法测定测定、-分泌酶活性及sAPP、A1-40含量，严格按照酶联免疫分析说明书操作。1.4统计学分析以平均值标准误表示实验结果，采用SPSS 20.0统计分析软件对实验数据进行分析,应用单因素方差分析，两两比较之后采用LSD检验。组间差异以LSD-t检验统计方法，检验水准=0.05，P0.05）。结果表明，小鼠间无个体差异，染毒处理对小鼠体能无明显影响。染毒12周各组小鼠Morris水迷宫实验结果显示，随学习时间的增加，小鼠逐渐提高对平台的记忆。训练第一天各组小鼠逃避潜伏期无差异性（P0.05），各染毒组小鼠逃避潜伏期随着DEHP浓度增高，学习时间逐渐延长（P0.05）；8组中，CT组小鼠逃避潜伏期时间最短，学习能力最好，逃避潜伏期更长（P0.05）。如表2所示。染毒24周各组小鼠Morris水迷宫实验结果显示，随学习时间的增加，小鼠对于平台记忆逐渐提高。8组中，CT组小鼠逃避潜伏期时间最短。学习能力最好。与CT组相比，各染毒组小鼠的逃避潜伏期随着DEHP浓度增高，学习时间逐渐延长；DEHP2组、DEHP3组与同剂量DEHP联合染毒组DEHP2+Pb、DEHP3+Pb组比较，逃避潜伏表 2染毒 12 周 Morris 水迷宫实验各组小鼠逃避潜伏期组别实验时间1234CT58.813.1842.906.2137.235.6229.264.02DEHP158.744.4649.066.7142.716.3239.673.49abDEHP258.953.8252.338.6547.585.15ab42.532.84abDEHP359.342.1654.864.4851.584.79ab48.484.68abDEHP1+Pb59.093.5747.689.2447.604.08ac38.363.87abDEHP2+Pb59.681.5848.517.5944.925.50a38.591.80abcDEHP3+Pb59.353.7554.015.67a49.655.99ab43.322.83abcPb59.313.4448.596.7844.266.23a36.082.87a注：a 与 CT 组比较 P0.05，b 与 Pb 组比较 P0.05，c 与同剂量组比较 P0.05。表 3染毒 24 周 Morris 水迷宫实验各组小鼠逃避潜伏期组别实验时间1234CT43.015.4533.665.6727.443.4823.353.51DEHP150.105.64a43.496.36a35.084.56a28.966.32aDEHP251.746.34a46.476.48ab41.775.11ab36.603.91abDEHP355.405.83ab50.934.96ab46.945.04ab40.853.74abDEHP1+Pb48.395.17a40.832.69a35.675.85a28.533.96aDEHP2+Pb52.364.97a47.345.31ab39.295.69ab32.202.36abcDEHP3+Pb53.294.84a48.995.04ab41.223.18abc34.185.31abcPb49.785.89a40.476.46a33.275.13a27.293.21a注：a 与 CT 组比较 P0.05，b 与 Pb 组比较 P0.05，c 与同剂量组比较 P0.05。58|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期期更长（P0.05）。如表3所示。Morris水迷宫平台寻找实验结果显示，随着DEHP浓度的增高，各组小鼠目标象限停留时间逐渐降低。12周染毒组中CT组小鼠学习能力较好，在目标象限停留时间最长，目标象限的游泳距离占总游泳距离的比例最高，DEHP3组目标象限停留时间降低、目标象限距离占总路程百分比降低（P0.05）。如表4所示。表 4染毒 12 周组小鼠平台寻找实验结果组别目标象限停留时间（s）占总距离百分比（%）CT31.872.0937.043.50DEHP122.182.10a28.054.27aDEHP217.862.49ab24.224.19abDEHP313.081.69ab19.623.35abDEHP1+Pb24.504.43a33.375.80DEHP2+Pb20.473.47a26.944.79abDEHP3+Pb16.582.42abc24.601.61abcPb23.221.49a31.964.31注：a 与 CT 组比较，P0.05，b 与 Pb 组比较，P0.05，c 与同剂量组比较，P0.05。染毒12周，从小鼠在平台寻找实验中的游泳轨迹来看，CT组小鼠在水迷宫中有很强的目的性，经过训练，游泳轨迹多集中于目标象限，但随着DEHP浓度的增高，DEHP染毒组及联合暴露染毒组小鼠的游泳轨迹逐渐变得不规则。DEHP3组及DEHP3+Pb组表现为无目的性探索，游泳轨迹并不集中于目标象限，散乱且无规律。如图1。图 1小鼠平台寻找实验的游泳轨迹Morris水迷宫平台寻找实验结果显示，CT组的小鼠在目标象限停留时间最长，占总距离的百分比最高，目标象限停留时间减少，占总距离百分比减少，差异具有统计学意义（P0.05）。如表5所示。表 5染毒 24 周组小鼠平台寻找实验结果组别目标象限停留时间（s）占总距离的百分比（%）CT24.624.4936.243.03DEHP119.797.27ab25.884.80aDEHP217.863.47a22.624.56aDEHP39.933.18a15.702.91abDEHP1+Pb19.294.09ab29.804.48aDEHP2+Pb18.474.86a23.876.39aDEHP3+Pb13.582.65ab21.681.64abcPb14.249.6a29.061.55a注：a 与 CT 组比较，P0.05，b 与 Pb 组比较，P0.05，c 与同剂量组比较，P0.05。染毒24周，从小鼠平台寻找实验中的游泳轨迹来看，CT组小鼠记忆能力较强，在水迷宫中有很强的目的性，游泳轨迹多集中于目标象限；而随着DEHP浓度的增高染毒处理小鼠的游泳轨迹逐渐变得不规则，游泳轨迹不集中于目标象限且无寻找平台的迹象，如图2。图 2小鼠平台寻找实验的游泳轨迹2.3生物学指标测定与CT组相比，随DEHP剂量的增加各染毒组小鼠脑组织中-分泌酶活性、sAPP含量逐渐降低，-分泌酶活性、A1-40含量逐渐增高（P0.05）。DEHP+Pb组-分泌酶活性更高（P0.05），按效应相加模型对联合作用方式进行评价，实测值小于理论值，联合作用表现为拮抗作用（P0.05）。如表6，7所示。3讨论以邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）为主要对象之一的环境化学污染物是流行病学和环境毒理学实验室的研究重点，环境污染物种类繁多并能够威胁人体健康，常有长期性、低水平性、缓慢性等特点。在环境污染物低剂|59智慧医疗基础研究量和低强度接触下，对人体特别是神经系统的影响呈现潜隐性和迟发性，随年龄增加而显现出来，如退行性疾病阿尔茨海默病（AD）。而环境污染物DEHP可能是提高AD发病率及发生发展的重要危险因素之一11。国内外很多DEHP研究表明，低剂量DEHP暴露能影响行为运动和记忆能力，提示很多机制的可能，如氧化及炎症、神经元损伤、神经递质相关分子机制等，如白金12等研究提示DEHP可致小鼠大脑皮质氧化损伤、上调凋亡相关蛋白表达水平、张朋艳13等结果显示DEHP可导致Tau蛋白增多。而当DEHP与其他环境污染物联合染毒时，其神经毒性表现并非为简单的相加作用，如陆林浩等研究表明DEHP联合甲醛神经毒性表现为协同作用。而Pb作为典型的神经毒物，能够影响神经系统并造成神经损伤，严重影响人体健康，是AD潜在病因之一15，因此有必要对两者联合染毒作出评价14。在本次实验中，DEHP和Pb染毒对小鼠体重、每日摄食量和每日饮水量影响不明显，用Morris水迷宫实验检测DEHP与Pb联合染毒对小鼠学习记忆能力的影响，定位导航实验和空间探索实验结果显示,DEHP组学习能力较差，游泳轨迹呈无目的性和无规律性，随DEHP剂量的增加，小鼠对平台位置的记忆越模糊，游动轨迹越杂乱无章，小鼠记忆学习能力越差。与对照组比较，DEHP组目标象限停留时间、穿台次数减少，差异有统计学意义（P0.05），而高剂量DEHP染毒组与高剂量DEHP+Pb组相比，对小鼠的空间学习能力损害更明显（P0.05）。用效应相加模型进行评价，表现为拮抗作用。行为学实验证实DEHP与Pb均能影响小鼠学习记忆能力，其影响程度呈剂量浓度效应关系，即DEHP剂量越高小鼠记忆能力越差，学习能力减退程度越明显，推测DEHP对神经系统具有一定的毒性损伤，而与Pb联合染毒会减少一定的毒性损伤。为探测DEHP与Pb对这一损伤机制中APP酶解通路导致学习记忆影响的相关机制，故进行下一步研究。AD主要病理表现为细胞外淀粉样斑块沉积、细胞内神经纤维缠结和大量神经元的丢失。表 6染毒 12 周组各组脑组织-分泌酶活性，-分泌酶活性、sAPP、A1-40 含量比较组别-分泌酶（U/L）-分泌酶（U/L）sAPP（ng/mL）A1-40（ng/mL）CT 组106.530.5924.101.44117.931.91352.910.28DEHP1103.613.0924.370.74112.063.89353.800.73DEHP297.392.72a26.301.23a110.007.20a354.110.89aDEHP395.556.17a27.371.81a108.412.58a355.290.32aDEHP1+Pb102.241.2125.900.87111.823.98354.540.77DEHP2+Pb97.843.77ab26.111.44a109.244.33a354.851.23aDEHP3+Pb95.742.13ab25.900.95abc108.001.79ab353.850.69abPb102.241.2123.700.84112.172.61353.690.72注：a 与 CT 组比较，P0.05，b 与 Pb 组比较，P0.05，c 与同剂量组比较，P0.05。表 7 染毒 24 周组各组脑组织-分泌酶活性，-分泌酶活性、sAPP、A1-40 含量比较组别-分泌酶（U/L）-分泌酶（U/L）sAPP（ng/mL）A1-40（ng/mL）CT 组103.721.8325.321.36115.714.53354.941.15DEHP199.783.81a26.362.24110.913.20358.432.07DEHP295.283.64a28.791.62a107.813.91a361.163.72aDEHP391.682.26ab29.961.13ab103.292.94ab366.831.06abDEHP1+Pb99.983.2826.132.12110.113.96359.161.63DEHP2+Pb96.883.10a27.011.84ab106.143.98a360.711.81aDEHP3+Pb92.223.18ab28.991.37abc101.802.16ab363.052.58abcPb97.833.8927.522.04108.942.19359.751.13注：a 与 CT 组比较，P0.05，b 与 Pb 组比较，P0.05，c 与同剂量组比较，P0.05。60|智慧健康Smart Healthcare2023 年 第 5 期脑组织中、-分泌酶活性增强，使淀粉样蛋白（A）产生过量，是AD开始的最根本基础。A是由淀粉样前体蛋白（APP）在-分泌酶的作用下产生的，APP经过、-分泌酶在氨基末端切割生成sAPP，包括sAPP和sAPP最终会降解为A16。对小鼠脑内-分泌酶、-分泌酶、sAPP和A1-40进行检测，实验结果显示，DEHP与Pb单一染毒会导致小鼠脑组织中-分泌酶活性降低，sAPP含量减少，使-分泌酶活性增强，A1-40含量增加，引发神经毒性作用，降低小鼠学习记忆能力（P0.05）。在两组实验周期中，与CT组相比，DEHP组与DEHP+Pb组小鼠脑组织-分泌酶、A1-40含量随着剂量增加，效果也相应增加（P0.05），-分泌酶活性，sAPP含量随着剂量增加，效果相应减少（P0.05）。而在两组实验周期中，高剂量DEHP损害作用高于高剂量DEHP+Pb联合染毒效果（P0.05）。这与Morris水迷宫行为学实验结果较为吻合,进一步说明DEHP和Pb联合染毒会对小鼠的学习记忆能力产生影响，可能呈拮抗作用。综上所述，初步证实DEHP对小鼠学习记忆能力有一定损伤作用，并呈现剂量效应关系，而与Pb联合染毒呈拮抗作用，通过DEHP与Pb对AD发病机制中APP酶解通路的影响的研究，初步证明DEHP与Pb均会影响APP通路、-分泌酶活性及sAPP、A1-40的含量，可能促使AD的形成，而在高剂量下，DEHP与Pb联合染毒效果呈拮抗作用。目前，Pb已证实对神经系统具有损害作用，而关于DEHP对神经系统影响的研究机制还不明确，具体机制还需进一步深入研究，也需加强对人体神经系统影响和流行病学的调查研究17，本次实验中经食物、饮水染毒DEHP与Pb，无法精确控制每只小鼠进食与饮水的剂量，是此实验的不足之处，但慢性低剂量染毒更符合人群暴露DEHP的环境。相较于灌胃染毒，经食物、饮水染毒低剂量DEHP，Pb才是接触两种物质最为常见的方式18，这也提示DEHP染毒可能影响人体的学习记忆能力，从而增加AD的发病率，而高剂量DEHP与Pb联合染毒呈拮抗作用，两者间相互影响机制仍需进行下一步研究。参考文献1 Zhao Yi,Li Mu-Zi,Talukder Milton,Luo 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