Penicilazaphi...is诱导哮喘炎症的机制研究_黄俊敏.pdf

Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8海南医学2023年4月第34卷第8期Penicilazaphilone C抑制NETosis诱导哮喘炎症的机制研究黄俊敏，王才春海南医学院第一附属医院呼吸内科，海南海口571199【摘要】目的探讨Penicilazaphilone C(PAC)对哮喘小鼠炎症反应的影响，以及中性粒细胞胞外诱捕网的形成(NETosis)介导哮喘发生发展的可能机制。方法在体外，采用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)诱导健康小鼠的中性粒细胞产生中性粒细胞胞外诱网(NETs)。设置四组PAC的不同剂量组及对照组，通过测定dsDNA的产生了解抑制效果。在体内，采用脂多糖(LPS)诱导建立哮喘小鼠模型，将30只小鼠随机分成对照组、哮喘组、地塞米松组、DNase 组及PAC组。测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子和炎性细胞水平；对肺组织采用 HE染色、PAS染色及免疫荧光；通过Western blotting检测肺组织中的瓜氨酸化组蛋白；通过荧光镜检验证哮喘小鼠是否产生了NETs。结果在体外，1.2 mg/mL的PAC可以显著抑制NETs的形成0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mLPAC组结果分别为(0.720.17)RFU、(0.350.09)RFU、(0.160.02)RFU、(0.110.03)RFU)，差异有统计学意义(P0.05)；在体内实验中，小鼠BALF中的dsDNA与对照组(165.406.99)ng/mL相比，哮喘组(300.008.27)ng/mL的含量明显增加，差异有统计学意义(P0.05)；BALF中有大量细胞因子及炎性细胞，中性粒细胞约占62%，肺组织明显受损。PAC组小鼠的中性粒细胞水平为(235.5021.03)104cells/mL，明显低于哮喘组的(796.5012.47)104cells/mL，差异有统计学意义(P0.05)；PAC组小鼠肺组织病理改变较哮喘组明显减少，PAC组小鼠的炎症评分为(1.170.41)分，明显低于哮喘组的(3.170.75)分，差异有统计学意义(P0.05)；与哮喘组对比，PAC组Western blotting检测出的瓜氨酸化组蛋白水平显著下降。结论利用LPS成功建立中性粒细胞型哮喘小鼠模型；PAC可以显著缓解哮喘小鼠炎症，其机制与抑制瓜氨酸化组蛋白和NETosis有关。【关键词】小鼠；哮喘；炎症；中性粒细胞；中性粒细胞胞外诱捕网；组蛋白；机制【中图分类号】R-332【文献标识码】A【文章编号】10036350（2023）08106507Mechanism of inhibition of NETosis-induced asthma inflammation by Penicilazaphilone C.HUANG Jun-min,WANG Cai-chun.Department of Respiratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou571199,Hainan,CHINA【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Penicilazaphilone C(PAC)on the inflammatory response ofasthmatic mice and the possible mechanism of the formation of Neutrophil extracellular traps(NETosis)in the develop-ment of asthma.MethodsIn vitro,NETs were induced in neutrophils of healthy mice with phorbol 12-my-ristate-13-acetate(PMA).Four groups of different doses of PAC and control groups were set up to understand inhibitoryeffect by measuring the production of dsDNA.In vivo,a asthma mouse model was established by inducing lipopolysac-charide(LPS),and 30 mice were randomly divided into 5 groups:control group,asthma group,dexamethasone group,DNaseI group,and PAC group.The levels of cytokines and inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured.Lung tissues were stained with HE staining,PAS staining,and immunofluorescence.Citrullinated his-tone H3 in lung tissue was detected by western blotting.NETs production in asthmatic mice was verified by fluores-cence microscopy.ResultsIn vitro,1.2 mg/mL PAC could significantly inhibit the formation of NETs:the levels ofNETs in the 0.3 mg/mL,0.6 mg/mL,0.9 mg/mL,1.2 mg/mL PAC group were(0.720.17)RFU,(0.350.09)RFU,(0.160.02)RFU,(0.110.03)RFU,respectively,with statistically significant differences(P0.05).In vivo,the dsDNAof BALF in the asthma group was significantly higher than that of the control group:(300.008.27)ng/mL vs(165.406.99)ng/mL(P0.05).There were a large number of cytokines and inflammatory cells in BALF,and neutrophils account-ed for about 62%.In addition,lung tissue was obviously damaged.The level of neutrophils in PAC group was signifi-cantly lower than that in asthma group:(235.5021.03)104cells/mL vs(796.5012.47)104cells/mL(P0.05).The in-flammation score was(1.170.41)points in the PAC group,significantly lower than(3.170.75)points in the asthmagroup(P0.05).The expression level of citrullinated histone H3 was significantly decreased in the PAC group com-pared to the asthma group.ConclusionThe neutrophilic asthma mouse model was successfully established by LPS.PAC can significantly alleviate inflammation in asthmatic mice,and the mechanism is related to the inhibition of citrulli-nated histone H3 and NETosis.【Key words】Mice;Asthma;Inflammation;Neutrophil;Neutrophil extracellular traps;Histone;Mechanism 论著 doi:10.3969/j.issn.1003-6350.2023.08.001基金项目：国家自然科学基金(编号：81660004)。第一作者：黄俊敏(1996)，女，住院医师，硕士，主要研究方向为呼吸系统疾病。通讯作者：王才春(1966)，男，主任医师，研究生导师，主要研究方向为呼吸系统疾病，E-mail：S。哮喘是一类常见的慢性呼吸道疾病，全球约有3.34亿哮喘患者1。中性粒细胞胞外诱捕网(neutro-phil extracellular traps，NETs)是中性粒细胞衍生的胞外支架，由颗粒蛋白装饰的解聚染色质组成。NETs不1065海南医学2023年4月第34卷第8期Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8仅有抗感染的作用，而且对非感染性疾病也有重要影响2。Toussaint等3发现NETs释放的DNA促进鼻病毒诱导的过敏性哮喘的恶化。Pham等4指出NETs通过损伤气道的上皮细胞，从而导致多种细胞(包括中性粒细胞、肥大细胞等)参与炎症的发生，加快哮喘的进展。多数研究表明NETs与哮喘的炎症进程相关。但针对NETosis诱发哮喘的详细机制及治疗研究较少。Penicilazaphilone C是从中国海南省海口市海岸的腐烂树叶中生长的真菌Penicillium sclerotiorum分离并进行结构鉴定为新的嗜氮酮类化合物。由于该类化合物的基本结构和文献报道的Penicilazaphilone A和B相同5-6，故将其命名为 Penicilazaphilone C(PAC)。PAC对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等细菌有较强的抑制作用7。PAC具有很多生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、细胞毒作用等8。在目前的国内外文献中，针对PAC的研究为数不多。本研究在PAC抗氧化及抗炎作用的基础上推测PAC通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成(NETosis)的产生来达到其预防或治疗哮喘的作用。1材料与方法1.1材料Penicilazaphilone C由本课题研究团队提供，化学结构见图1。BCA蛋白定量检测试剂盒、脂多糖、DNase 均购自 Servicebio(货号分别为：G2026-200T、G5032-10MG、G3342-200U)。ELISA试剂盒、Triton X-100、DAPI均购自Sigma(货号分别为：RAB0263-1KT、T8787-50ML、D9542-1MG)。1.2实验方法1.2.1小鼠体外诱导NETs所有实验均严格按照申请内容进行。实验所用的30只68周龄健康雄性BALB/c小鼠从广州市赛柏诺生物科技公司购买，提前送到海南医学院实验室进行饲养。取健康小鼠新鲜外周血，用10 nmol/L的PMA刺激中性粒细胞。4%甲醛固定细胞，0.1%Triton X-100 通透，再用 5%BSA 阻断 1 h，细胞与抗髓过氧化物酶(Myeloperoxi-dase，MPO)抗体孵育，接着与Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔抗体孵育。对中性粒细胞培养上清液中的双链DNA(dsDNA)的水平进行定量，用酶标仪来测定dsDNA的荧光强度。PAC 由本课题研究团队提供。设置四组PAC的不同剂量组(0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL)，了解抑制效果，最终确定最佳有效剂量，以便进行下一步的体内实验。1.2.2哮喘小鼠模型的建立小鼠适应性喂养1周后，根据相关研究方案9-10建立LPS诱导的小鼠哮喘模型(图2)，采用LPS腹腔注射和雾化吸入的方法建立小鼠哮喘模型。把30只雄性小鼠依照数字表随机分成五组，每组6只，即对照组、哮喘组、地塞米松组、DNase I组及PAC组。用1 mg/mL的LPS与氢氧化铝Al(OH)3凝胶制成混合溶液。除对照组外其他4组在第1天、第7天用其腹腔注射致敏小鼠。第1421天，持续7 d以 1 mg/mL 的 LPS 气雾剂雾化激发哮喘，30 min/d。对照组在致敏及激发阶段用0.9%NaCl溶液雾化。对于DNase 组，雾化激发暴露前和雾化后8 h分别雾化吸入DNase 溶液(120 U DNase I溶于5 mL 0.9%NaCl溶液)30 min。第2148天，对照组和哮喘组的小鼠只接受腹腔注射0.9%NaCl溶液。在致敏及致激后，地塞米松组小鼠在第2148天连续4周予2 mg/kg地塞米松灌胃。PAC 组小鼠按照 PAC 的有效剂量进行灌胃。造模结束24 h后统一处理小鼠。1.2.3Western blotting肺组织块用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，清洗后将肺组织分成小块进行匀浆。裂解后收集上清。取蛋白溶液，用BCA蛋白浓度 测 定 试 剂 盒 测 蛋 白 浓 度，上 样、电 泳。用SDS-PAGE分离细胞总蛋白提取物，并转移到PVDF膜上，加上脱脂牛奶封闭 30 min，加入配置好的一抗，4孵育摇床过夜。回收一抗，洗膜后加入TBST快速洗脱，将二抗用TBST按照15 000的比例进行稀释，室温下孵育 30 min 后洗脱。依照说明书对CitH3及组蛋白进行化学修饰，并使用修饰的抗CitH3抗体和抗组蛋白抗体进行检测。1.2.4组织学肺组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，进行HE染色、PAS染色及免疫荧光。HE和PAS染色在显微镜下观察上皮细胞、炎性细胞的浸润及黏液分泌等，并使用先前研究描述的方法对支气管以及血管周围的病变程度进行评分10。观察到的每个支气管评分从0到4分，总共评分10个区域。评分图1Penicilazaphilone C的化学结构Figure 1Chemical structure of Penicilazaphilone C图2LPS诱导小鼠哮喘模型实验流程图Figure 2Flow chart of mouse asthma model induced by LPS注：ip，腹腔注射；inh，雾化吸入；ig，灌胃；NS，0.9%NaCl溶液；DEX，地塞米松。Note:ip,intraperitoneal injection;inh,aerosol inhalation;ig,intragastricadministration;NS,0.9%NaCl solution;DEX,dexamethasone.1066Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8海南医学2023年4月第34卷第8期标准：0分，没有细胞浸润；1分，有少许细胞浸润；2分，有1层细胞浸润；3分，有2至4层细胞浸润；4分，有大量细胞(超过4层细胞)浸润。肺组织的整体炎症表现以支气管周围和血管周围炎症评分的平均数来表示。肺组织切片同时进行MPO 和瓜氨酸化组蛋白H3(citrullination of histone H3，CitH3)等NETs标志物染色。进行抗原修复及封闭。玻片上依次放入一抗及二抗，室温孵育50 min。加DAB显色液，苏木素复染细胞核。使用共聚焦显微镜从每个切片中随机选择5个区域，使用荧光显微镜进行成像。1.2.5支气管肺泡灌洗液对BALF当中的相关炎性细胞及细胞因子进行检测。麻醉小鼠后，气管插管后用PBS冲洗肺组织3次来获取BALF。BALF在4下离心，上清液分离，在-80下保存。采用ELISA 检测白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17(IL-17)和肿瘤坏死因子-(TNF-)。将BALF离心沉淀，重悬于PBS中，细胞计数器测定总细胞数。对于细胞比例测量，细胞悬液移至薄片机的收集孔中，并通过离心将细胞移到玻片上进行Wright/Giemsa染色。根据细胞大小、形态和细胞核形态鉴定各类细胞，计算嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞在BALF中的数量。1.2.6NETs各组小鼠腹主动脉采血，细胞悬液加入24孔板中，并刺激3 h以鉴定NETs结构。4%多聚甲醛固定，0.5%TritonX-100 通透，室温下在 5%BSA内封闭。加入一抗混合物(小鼠抗MPO抗体)，加入二抗混合物(兔抗 CitH3 抗体)，在室温下孵育。DNA用DAPI染色。用 Fisher Science的抗褪色荧光贴装介质清洗并贴装玻片。用荧光显微镜观察图像。为了检测肺组织中产生的 NETs，使用抗MPO和抗组蛋白H3抗体开展免疫荧光染色。组织放置在含有甲醛的PBS中，石蜡包埋。将切片进行脱蜡和再水化。进行抗原修复及封闭。切片依次与兔抗MPO抗体和小鼠抗组蛋白H3抗体一同孵育。洗涤后将样品与可识别CitH3(驴抗小鼠 IgG)和 MPO 的二抗一同孵育(驴抗兔 IgG)。切片及 DAPI 溶液在室温下孵育 20 min，拿抗荧光衰减封片试剂来封片。用载玻片扫描仪获得免疫荧光图像。1.2.7NETs的定量在体外实验中，PMA刺激中性粒细胞4 h后，收集底层离心，收集富含dsDNA的上清液。将上清液离心，丢弃上清液，再用PBS重悬颗粒。用SYTOX绿板阅读器分析NETosis。NETs的重要成分是释放到细胞外空间的dsDNA。PicoGreen试剂盒可以特异性地测量细胞外dsDNA，以准确反映NETs的生成。从BALF上清液中提取的dsDNA进行定量。将细胞悬液移入96孔板中并孵育，加入QuantiTPicogreen试剂。用荧光分光光度计检测dsDNA的荧光强度(激发波长：480 nm，发射波长：520 nm)，得到标准曲线，y=0.1 578x0.5676，R2=0.9 987(y是DNA浓度，单位为ng/mL，x是荧光值)。将荧光值放入公式中，得到样品的DNA浓度，从而对NETs进行定量。1.3统计学方法应用GraphPad Prism 8.0软件对实验数据进行分析。计量资料呈正态分布，以均数标准差(x-s)表示，组间两两比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1PAC体外抑制NETosis为了研究PAC是否在体外抑制PMA刺激的NETosis的形成，通过测定健康小鼠外周血中分离的中性粒细胞外DNA含量来实现(图3A)。数据结果显示，对照组所测得的dsDNA相对荧光单位为(1.430.47)RFU，随着PAC剂量的增加，抑制作用也在加强。在0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL 的剂量下 dsDNA 相对荧光单位分别为(0.720.17)RFU、(0.350.09)RFU、(0.160.02)RFU、(0.110.03)RFU，差异具有统计学意义(P0.05)。在1.2 mg/mL的PAC处理之后dsDNA显著降低，表明在体外一定浓度下PAC可以有效抑制NETosis。2.2哮喘小鼠体内存在NETs为了确认本次实验建立的哮喘小鼠模型中的NETs的形成，主要通过检测 NETs 及其标志物(CitH3、MPO 和 dsDNA)来实现。首先检测 BALF 中的 dsDNA(图 3B)，哮喘组dsDNA水平为(300.008.27)ng/mL，对照组为(165.406.99)ng/mL，差异有统计学意义(P0.05)。哮喘组dsDNA水平较对照组明显增高。CitH3是NETosis的图3小鼠体内和体外dsDNA的变化情况Figure 3The changes of dsDNA in vivo and in vitro in mice注：A，体外PMA处理小鼠中性粒细胞，对照组及0.3 mg/mL、0.6 mg/mL、0.9 mg/mL、1.2 mg/mL PAC 组的 dsDNA释放情况；B，Picogreen 法检测各组小鼠BALF的dsDNA浓度；RFU，相对荧光单位；aP0.05。Note:A,Mouse neutrophils were treated with PMA in vitro,and dsDNArelease was measured in control group and 0.3 mg/mL,0.6 mg/mL,0.9 mg/mL,1.2 mg/mLPAC groups;B,The dsDNA concentration ofBALF in each group was detected by Picogreen;RFU:relativefluorescent unit);aP0.05.1067海南医学2023年4月第34卷第8期Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8图4小鼠肺组织变化情况Figure 4Changes of lung tissue in mice注：A，Western blotting检测肺组织组蛋白H3和CitH3的表达；B，各组小鼠肺组织DNA、CitH3和MPO的荧光染色；CitH3，红色荧光；MPO，绿色荧光；DNA，蓝色荧光；DEX，地塞米松。Note:A,The expression of histone H3 and CitH3 in lung tissue was detected by Western blotting;B,Fluorescent staining of DNA,CitH3 and MPO inlung tissue of mice in each group;CitH3,red fluorescence;MPO,green fluorescence;DNA,blue fluorescence;DEX,dexamethasone.图5细胞计数器检测各组小鼠BALF中各类细胞的数量Figure 5The number of each type of cellin BALF of each group was detected by cell counter注：A，BALF的总细胞数；B，BALF嗜酸性粒细胞的数量；C，BALF巨噬细胞的数量；D，BALF中性粒细胞的数量。aP0.05。Note:A,The number of total cells in BALF;B,The number of eosinophils in BALF;C,The number of macrophages in BALF;D,The number ofneutrophils in BALF.aP0.05.图6小鼠体内细胞因子变化情况Figure 6Changes of cytokines in mice注：A，ELISA检测哮喘组小鼠的BALF中IL-4、IL-6、IL-17、TNF-水平；BD，ELISA检测对照组、哮喘组、地塞米松组、DNase 组及PAC组小鼠BALF中IL-6、IL-17、TNF-水平。aP0.05。Note:A,The levels of IL-4,IL-6,IL-17,and TNF-in BALF of asthmatic mice were detected by ELISA;B,C,D,the levels of IL-6,IL-17,andTNF-in BALF of control group,asthma group,dexamethasone group,DNase group,and PAC group were detected by ELISA.aP0.05.重要标志物之一，Western blotting检测肺组织CitH3的表达(图4A)。与对照组相比，哮喘组的CitH3呈高表达状态。在PAC或DNaseI处理后CitH3表达明显减弱。图4B中，与对照组相比，哮喘组小鼠肺组织中CitH3、MPO及其共定位明显。DNase 组和PAC组小鼠肺组织中的共定位较哮喘组减少。2.3各组小鼠BALF中的炎症反应为了研究哮喘小鼠炎症浸润情况，对各组小鼠BALF中的炎症细胞和细胞因子进行了检测(图 5、图 6)。哮喘组小鼠BALF中有大量炎症细胞浸润，其中中性粒细胞所1068Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8海南医学2023年4月第34卷第8期占比例大(约62%)。哮喘组小鼠BALF中IL-4、IL-6、IL-17和TNF-水平分别为(18.912.79)pg/mL、(57.091.70)pg/mL、(79.931.99)pg/mL、(31.433.11)pg/mL，其中IL-17显著增加，差异有统计学意义(P0.05)。2.4各组小鼠肺组织的改变为了评估NETosis诱导的哮喘小鼠肺组织损伤程度，采用HE染色和组织学评分(图7A、7C)评价肺组织气管和血管周围病变情况。哮喘组肺组织可见显著的白细胞浸润，炎症评分(3.170.75)分，提示存在多层炎性细胞浸润，上皮细胞严重受损脱落。与哮喘组小鼠相比，DNase 组和PAC组的肺炎症程度弱。PAC组比DNase I组治疗效果更显著。PAS染色观察哮喘组肺组织大量黏液渗出，还发现了增多的杯状细胞及胶原沉积(图 7B)。PAC组肺组织显示支气管周围的胶原沉积及杯状细胞显著减少。2.5PAC体内抑制NETosis体外细胞实验证实了一定浓度PAC对NETosis有抑制作用。为了检测PAC在体内抑制NETosis的能力，对NETs的特异性标志物MPO及CitH3进行共定位鉴定。与对照组比较，在哮喘组小鼠肺组织中，发现了大量的CitH3及MPO图7小鼠肺组织损伤情况Figure 7Lung tissue injury in mice注：A 和C，通过HE 染色、组织学评分及上皮细胞存活率来评价肺组织损伤；B，PAS 染色观察肺组织黏液渗出及杯状细胞增生等(400，比例尺，50 m)。aP0.05。Note:A and C,Lung injury was evaluated by HE staining,histological score,and epithelial cell survival rate;B,PAS staining was used to observemucous exudation and goblet cell proliferation in lung tissue(400;scale:50 m).aP60%的哮喘定义为中性粒细胞型哮喘。有调查表明约50%的哮喘患者属于中性粒细胞型，中性粒细胞与重度哮喘和激素不敏感型哮喘密切相关15。中性粒细胞诱导相关细胞因子并延续炎症周期，中性粒细胞和中性粒细胞衍生介质可作为慢性气道疾病炎症和组织损伤长期存在的原因之一。哮喘炎症与多种免疫驱动机制有关。目前将哮喘分为T2型和非T2型。Th2介导的途径被认为是过敏性哮喘的驱动力，即T2型哮喘16。T2型哮喘与嗜酸性粒细胞、IgE、IL-4和IL-5有关。非T2型哮喘通常涉及中性粒细胞、IL-6、IL-17和TNF-17-18。本研究中构建的哮喘模型主要涉及IL-6、IL-17和TNF-，其中IL-17占绝对优势。以Th17细胞为主介导的哮喘称为Th-17型哮喘或中性粒细胞型哮喘。LPS增加促炎细胞因子的释放19，有研究提出LPS能够通过促进CD4+细胞分化为Th17细胞，从而导致哮喘表型从嗜酸性细胞型转变为中性粒细胞型20。这种转变会造成皮质类固醇耐药、哮喘控制不佳和病情加重。本研究对BALF中的3类细胞进行检测，哮喘组嗜酸性粒细胞约占16%，中性粒细胞约占62%，证明该实验建立的是中性粒细胞型哮喘模型。PAC 可以通过抑制NETosis的形成来减轻中性粒细胞型哮喘炎症。糖皮质激素对NETosis抑制作用弱，这也是部分哮喘患者对糖皮质激素的治疗反应不佳的原因。在 2004 年，Brinkmann 等21首次描述了 NETs。NETs是处在细胞外的网状结构，是由染色质纤维所构成，上面装饰着蛋白质和多肽，通常存在于中性粒细胞的颗粒和细胞质中。在这些蛋白中有MPO、组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、钙卫蛋白及溶菌酶等22-23。NETosis是中性粒细胞爆炸性释放出NETs的过程，该过程是一种特殊类型的程序性细胞死亡。多种物质可以刺激NETosis的发生，包括PMA、LPS、IL-8及钙离子载体等24。本研究的实验模型使用LPS诱导小鼠哮喘的发生，PMA成功刺激体外中性粒细胞产生NETs。PMA是一种植物来源的天然有机化合物，通常被用作有效的NETs诱导剂25。PMA诱导自杀性NETosis的发生，该模式以蛋白激酶C激活、细胞内钙释放、Raf-MEK-ERK通路激活、NADPH氧化酶组装和ROS的产生为起点。过氧化氢触发NE和MPO的激活，随后它们从嗜天青颗粒中动员起来并移位到细胞核，促进染色质解聚26。同时细胞内钙水平的增加导致PAD4的激活，PAD4参与组蛋白的瓜氨酸化，染色质解聚。随后是核膜的解体，核质和胞质集聚，紧接着细胞膜破裂，中性粒细胞的内容物以网状结构扩散到细胞外空间27。细胞外dsDNA作为NE-Tosis的标志物之一，生理上NETs可被血清DNA酶降解。核酸酶具有多种功能，例如控制生物膜形成或扩散、帮助某些病原体通过组织损伤侵入宿主和调节宿主免疫反应28。有研究评估了重组人脱氧核糖核酸酶对NETosis的影响，结果显示NETosis被抑制，同时中性粒细胞的浸润减少及炎症减轻29-30。DNase 是一种主要存在于血浆中的核酸内切酶，它作用于单链DNA、dsDNA和染色质，优先以非序列特异性的方式切割DNA29。DNase除了被用作分子生物学工具外，还被批准用来治疗囊性纤维化。患者痰中存在NETs，会导致痰液黏度增加30。DNase可以减少染色质解聚，并在一定程度上改变NETs相关蛋白的溶解活性31。但由于DNase在血清中的稳定性低，一定程度上限制了机体利用DNase来抑制NETs32。本实验用DNase来处理哮喘小鼠，与PAC组相比，多项数据表明PAC 的治疗结局更好，对于 NETosis，PAC具有比DNase更好的抑制效果。综上所述，本研究表明NETosis与哮喘的发病机制密切相关，同时对糖皮质激素治疗中性粒细胞型哮喘缺乏有效性做出了解释。PAC基于其抗炎和抗氧化作用来抑制NETosis，上述结果为PAC对哮喘的保护作用提供了新的信息。通过PAC来抑制NETo-sis的形成可能会成为减轻哮喘炎症的一个新的治疗靶点。1070Hainan Med J,Apr.2023,Vol.34,No.8海南医学2023年4月第34卷第8期参考文献1Vos T,Abajobir AA,Abate KH,et al.Global,regional,and nationalincidence,prevalence,and years lived with disability for 328 diseas-es and injuries for 195 countries,19902016:a systematic analysisfor the Global Burden of Disease Study 2016 J.Lancet,2017,390(10100):1211-1259.2Jorch SK,Kubes P.An emerging role for neutrophil extracellulartraps in noninfectious disease J.Nat Med,2017,23(3):279-287.3Toussaint M,Jackson DJ,Swieboda D,et al.Host DNA released byNETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacer-bation J.Nat Med,2017,23(6):681-691.4Pham DL,Ban GY,Kim SH,et al.Neutrophil autophagy and extra-cellular DNA traps contribute to airway inflammation in severe asth-ma J.Clin ExpAllergy,2017,47(1):57-70.5 Arunpanichlert 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