灰葡萄孢寄生菌Clpse01的杀线活性研究.pdf

40(1)186-195 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2024 年 2 月 收稿日期：2023-06-28 基金项目：国家重点研发项目（2023YFC2604803）作者简介：徐勇，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，教授，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.066 灰葡萄孢寄生菌Clpse01的杀线活性研究 徐 勇1,2，彭子嘉1，徐正梅1，邵雅坤1，蓝 燕1，徐清华3，余仲东1*（1.西北农林科技大学林学院，杨凌 712100；2.修水县农业局，九江 332400；3.先正达（中国）投资有限公司，上海 200120）摘要：在用灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 培养松材线虫的过程中，发掘了一株具有杀线活性的灰葡萄孢寄生菌 Clpse01。本文在光学显微镜下对菌株 Clpse01 的形态和其对灰葡萄孢菌的生长影响进行了观察；采用ITS4/ITS5、LR5/LR0R、Bt2a/Bt2b 和 EF1-688F/EF1-1251R 引物进行了分子生物学鉴定；同时测试了菌株Clpse01 对松材线虫的杀线活性及对松材线虫卵孵化能力和繁殖能力的影响；最后测试了菌株 Clpse01 的胞外蛋白浓度，胞外-葡萄糖苷酶活性和胞外几丁质酶活性。根据形态学和分子生物学结果，将菌株 Clpse01鉴定为假卡鲁卡枝惠霉 Clonostachys pseudochroleuca。菌株 Clpse01 可以缠绕、侵入灰葡萄孢菌的菌丝以获得营养来源，使灰葡萄孢菌的菌丝生长受到抑制。将 2000 条松材线虫接种到长满菌株 Clpse01 的培养基上，8 d 后仅分离出 6 条/皿活线虫，而对照灰葡萄孢菌培养基上分离的线虫数为 33066 条/皿活线虫；菌株Clpse01 发酵液处理松材线虫 48 h 后的校正死亡率为 88%，浓度为 1108孢子/mL 的孢子悬液处理松材线虫 24 h 后的校正死亡率为 88.33%；菌株 Clpse01 2稀释发酵液 24 h 对卵的孵化抑制率为 100%。发酵培养 6 h 后，菌株 Clpse01 胞外蛋白浓度为 1782.917 g/mL，胞外-葡萄糖苷酶为 9.99 U/mL，胞外几丁质酶含量为 0.8792 U/mL，并随发酵时间推移而升高。菌株 Clpse01 通过寄生松材线虫的食物来源灰葡萄孢菌和影响松材线虫的繁殖、存活和卵的孵化起作用，胞外-葡萄糖苷酶、几丁质酶是毒杀松材线虫的两个重要生理因子。关 键 词：松材线虫；灰葡萄孢菌；假卡鲁卡枝惠霉；寄生真菌；生防真菌 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2024)01-0186-10 The Nematicidal Activity of Clonostachys pseudochoroleuca Clpse01 on Botrytis cinerea XU Yong1,2,PENG Zijia1,XU Zhengmei1,SHAO Yakun1,LAN Yan1,XU Qinghua3,YU Zhongdong1*(1.College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Agriculture Bureau of Xiushui County,Jiujiang 332400,China;3.Syngenta Group China,Shanghai 529262,China)Abstract:A parasitic fungus with nematocidal activity,Clpse01,was found while pine wood nematodes(Bursaphelenchus xylophilus)were feeding on Botrytis cinerea media.Clpse01 morphologies and parasite evidences were seen under the microscope.Multiple genes,including ITS,large subunit ribosomal DNA,-tublin and elongation factor,were used for further limiting by the phylogenic tree.Clpse01s nematocidal effectiveness against pine wood nematodes,as well as its effects on egg hatching and reproduction,were investigated.The Clpse01 fermentation fluid was analyzed for extracellular protein concentrations,-glucosidase activity,and chitinase activity.Clpse01 was identified as Clonostachys pseudochloleuca using a combination of morphological and molecular phylogenetic approaches.C.pseudochroleuca Clpse01 was discovered entangling and infiltrating B.cinerea hyphae,acquiring nutrients from them while limiting B.cinerea normal growth.Inoculating 2000 pine wood nematodes into media with full growth of isolate Clpse01 resulted in only 6 alive ones after 8 days,while nematodes isolated from the control medium of B.cinerea reached 33066.The adjusted mortality rate of pine wood 第 1 期 徐勇等：灰葡萄孢寄生菌 Clpse01 的杀线活性研究 187 nematode treated with C.pseudochroleuca Clpse01 fermentation broth for 48 h was 88.0%,while that treated with 1108 conidiospore suspensions per milliliter for 24 h was 88.33%.In double diluent fermentation broth for 24 hours,egg hatching was completely inhibited.After 6 hours of fermentation,the Clpse01 liquid contained 1782.917 g/mL of total extracellular protein,9.99 U/mL of-glucosidase,and 0.8792 U/mL of chitinase.Protein concentrations increased with time.In general,C.pseudochroleuca Clpse01 functions by parasitizing B.cinerea,the feeding fungus,and influencing B.xylophilus reproduction,survival,and egg hatching.Key words:pine wood nematode;Botrytis cinerea;Clonostachys pseudochroleuca;parasitic fungus;biocontrol fungus 松材线虫 Bursaphelenchus xylophilus 可以造成松树水分输导系统严重受损，导致松树迅速枯萎1,2。自1982 年以来，松材线虫在我国快速传播，目前已经突破年均气温 10 的适生界线，呈现向西、向北扩散，向高纬度、高海拔地区蔓延的趋势3。松材线虫对我国的生态和经济造成了严重损害，因此，寻找有效控制松材线虫病的方法一直是科研工作者关注的热点。松材线虫病的防治研究主要集中在加强疫情监测、疫木除治、病害检疫、防治媒介昆虫和树干注射等方面。随着化学药剂的大规模应用，随之而来的是对环境、生态和人体的危害问题，使得人们更倾向于寻找更安全、更环保的解决方案，如生物防治3,4。松材线虫生防真菌主要包括捕食真菌、内寄生真菌和产毒真菌三大类。捕食真菌利用三维菌网、粘性球、粘性分支、收缩环和非收缩环等捕食器官来捕捉和消化线虫，主要集中在节丛孢属 Arthrobotrys、单顶孢属 Monacrosporium 和小掘氏孢属 Dactylella5。枝穗霉属 Clonostachys 真菌分布于世界各地，大多数栖息在热带和温带地区的土壤、真菌和垂死的树木或腐烂的树叶上，少数则寄生于黏菌、线虫、蜱虫、软体动物和蜘蛛等6,7。枝穗霉属真菌是多种真菌的寄生菌，可用于控制多种植物真菌病害。Mascarin 等8发现粉红枝穗霉 Clonostachys rosea 对核盘菌 Sclerotinia sclerotiorum 具有很好的抑制效果。Silva 等9发现翠绿枝穗霉 C.chloroleuca，假卡鲁卡枝穗霉 C.pseudochroleuca 和蚀根枝穗霉 C.rhizophaga 对马铃薯早疫病的防治效果显著。枝穗霉属真菌也是线虫防治的潜力真菌，对多种线虫的生防效果显著。Rodriguez 等10发现粉红枝穗霉可以捕食捻转血矛线虫 Haemonchus contortus、秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans、小杆线虫Rhabditis sp.、全齿复活线虫Panagrellus redivivus和巴特勒线虫Butlerius sp.，捕食率分别为87.7%、94.7%、71.9%、92.7%和 100%。Song 等11发现粉红枝穗霉 YMF1.00133 的甲醇提取物对秀丽隐杆线虫、全齿复活线虫和松材线虫具有杀线活性。本试验在松材线虫的培养过程中发现了一株灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 寄生菌 Clpse01，为探讨该菌株对灰葡萄孢菌和松材线虫的影响，本文研究了该菌株的分类学地位，对松材线虫繁殖能力、卵的孵化率、直接杀灭作用的影响和酶学特征，旨在为进一步开发利用该菌株奠定其理论基础。1 材料与方法 1.1 试验材料 松材线虫保存于西北农林科技大学森林病理实验室，分离自病死的马尾松 Pinus massoniana 主干（陕西省汉中市佛坪县大河坝镇采集）。灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea、新拟盘多毛孢菌 Neopestalotiopsis sp.、芭蕉新拟盘多毛孢菌 Neopestalotiopsis musae 由西北农林科技大学植物保护学院郭云忠教授馈赠。供试菌株发现于松材线虫的培养过程中，松材线虫吃尽灰葡萄孢菌气生菌丝后，培养皿表面仍有白色菌丝残留。用无菌针头将白色菌丝挑至 PDA 培养基上，对其进行分离纯化，获得菌株 Clpse01。1.2 松材线虫培养及消毒 参照李恩杰等12的方法，通过灰葡萄孢菌、新拟盘多毛孢菌、芭蕉新拟盘多毛孢菌培养松材线虫，用30 g/mL 氯霉素和 100 g/mL 硫酸链霉素对松材线虫进行表面消毒。1.3 菌株 Clpse01 形态学和分子生物学鉴定 采用形态学和分子系统学方法进行分类学鉴定。分子系统学鉴定参照 Wang 等13的方法，引物序列及PCR 退火温度见表 1。采用 CTAB 法提取菌株 Clpse01 基因组 DNA，PCR 反应体系 20 L，包含 2SanTaq 188 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 PCR Mix 12.5 L，正反引物各 1 L，DNA 模板 2 L，超纯水 6 L。PCR 循环反应条件：94 预变性 5 min，94 变性 30 s，退火 30 s，72 延伸 1 min，20 次循环；72 延伸 10 min。PCR 产物经 1%凝胶电泳检测后，送上海生工测序。测序结果用 Bioedit 软件拼接，并在 NCBI 中进行 Blast 比对，下载同源性较高的序列作为参考序列。系统发育分析基于 ITS+nrLSU+TUB2+TEF1 组合序列，将所有参考序列导入 MEGA-X中进行序列比对，用 Sequence Matrix 软件对比对后的序列进行串联。使用 MrModeltest 2.3 软件计算序列演化模型，用 raxmlGUI-2.0.0-beta 软件构建最大似然 ML 系统进化树，选取 GTR+I 模型为最优模型，使用rapid bootstrap 法重复采样 1000 次。结合形态学特征，以鉴定菌株 Clpse01 的分类学地位。表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences 基因 Gene 引物 Primer 引物序列 Primer sequence 退火温度 Annealing temperature()ITS413,14 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ITS ITS513,14 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 56 LR513 5-TCCTGAGGGAAACTTCG-3 nrLSU LR0R13 5-ACCCGCTGAACTTAAGC-3 50 TUB2 Bt2a13,15 5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3 Bt2b13,15 5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3 60 TEF1 EF1-688F13 5-CGGTCACTTGATCTACAAGTGC-3 EF1-1251R13 5-CCTCGAACTCACCAGTACCG-3 56 1.4 菌株 Clpse01 对灰葡萄孢菌生长的影响 用直径为 5 mm 的打孔器打取灰葡萄孢菌的新鲜菌丝块 1 个，将其接种到 PDA 平板的一端，在另一端2 cm 处接种菌株 Clpse01，空白对照另一端不接菌，每个处理接种 5 皿。将其放在 25 恒温培养箱内培养 5 d，观察培养皿上的菌丝生长现象。培养 30 d 后，用针头挑取试验组和对照组培养皿气生菌丝，在光学显微镜下观察菌株 Clpse01 菌丝对灰葡萄孢菌形态结构的影响。1.5 菌株 Clpse01 对松材线虫繁殖能力的影响 参照王旻嘉等16的方法，将 1 mL 表面消毒后的松材线虫无菌水溶液（2000 条/mL）接种到长满菌丝的 Clpse01 的 PDA 培养皿中，黑暗 25 共培养 8 d，重复 5 次。采用贝尔曼漏斗法对平板中的松材线虫进行分离，用灭菌的离心管收集底部 15 mL 液体，6000 r/min 离心 3 min，保留 1 mL。用涡旋仪振荡收集的线虫悬液，随机取 20 L 点在载玻片上，5 min 后在光学显微镜下观察线虫存活数、死亡数，重复 5 次。以松材线虫的常用培养菌灰葡萄孢菌、新拟盘多毛孢菌、芭蕉新拟盘多毛孢菌为对照。1.6 菌株 Clpse01 发酵液对松材线虫活性测定 用无菌打孔器取 1 块 5 mm 的 Clpse01 菌饼接入 40 mL PD 培养基中（马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、蒸馏水定容至 1000 mL，pH 7.2），160 r/min、25 摇瓶培养 8 d 后，取上清 8000 r/min 离心 3 min，再用0.22 m 滤膜过滤。发酵液在 96 孔板上进行杀线活性测定，每孔分别加入制备好的发酵液 250 L 和线虫悬浮液 50 L，使线虫的终浓度为 1000 头/mL，以无菌液体 PD 培养液处理为空白对照，每个处理重复 3次。25 静置处理 12、24、36 和 48 h，每次随机取 20 L 点在载玻片上，5 min 后在光学显微镜下统计线虫死亡数目和线虫总数，参照李平等人17的方法，计算死亡率和校正死亡率。1.7 菌株 Clpse01 孢子悬液对松材线虫活性测定 用无菌的 0.05%Tween 80 溶液从菌落生长旺盛的平板上洗下 Clpse01 分生孢子，装入 10 mL 灭菌离心管中，置于涡旋震荡器上充分震荡混匀。用血球计数板计算孢子浓度，置于 4保存待用。在 96 孔板上加入 50 L 线虫悬浮液（300 条左右），再加入 250 L 的孢子悬液，使其孢子浓度为 1108和 1107孢子/mL，以灭菌的 0.05%的 Tween 80 溶液为空白对照。在 25 恒温培养箱中静置处理 12、24 h 后，在光学显微镜下观察线虫死亡症状、死亡数目和线虫总数，参照李平等17的方法，计算死亡率和校正死亡率。第 1 期 徐勇等：灰葡萄孢寄生菌 Clpse01 的杀线活性研究 189 1.8 菌株 Clpse01 发酵液对松材线虫卵孵化的影响 参照 Liu 等18的方法获取松材线虫的卵，再参照李平等17的方法，将线虫平板分离悬浮液转移到无菌玻璃培养皿（直径 90 mm）中，在 25 下放置 0.5 h。小心地去除水和线虫后，用无菌水清洗卵 23 遍，收集到 10 mL 离心管中。8000 r/min 离心 3 min，保留底部 1 mL，在光学显微镜下计算卵的浓度。向 96 孔板中分别加入发酵原液及发酵液的 2 倍、3 倍和 4 倍稀释液 150 L 和松材线虫卵悬浮液 150 L（300 个左右）。将 96 孔板置于 25 恒温箱中孵化，以无菌 PD 处理为空白对照，每个处理重复 3 次。12、24 h 后统计孵化的线虫数，在光学显微镜下观察线虫卵和 J2线虫的数量，并计算孵化率和孵化抑制率。1.9 菌株 Clpse01 胞外物质测定 分别收集培养 0.5、1、2、4 和 6 h 后的 Clpse01 发酵液，4000 r/min 离心 10 min，收集上清液，4 保存。使用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（P0010S）测定粗酶液的蛋白浓度，参照蛋白浓度标准曲线 y=0.0017x0.0305（R2=0.9940）计算上清液蛋白浓度。参照朱婧等19、李芹等20的方法，采用 DNS法分别测定-葡萄糖苷酶酶活、几丁质酶酶活，根据拟合的葡萄糖标准曲线：y=0.0053x+0.0007（R2=0.9992）、N-乙酰基葡萄糖标准曲线：y=0.0106x0.0066（R2=0.9973）计算酶活。1.10 数据统计与分析 通过 Excel 2019 整理数据，采用 SPSS Statistics 19.0 软件对数据进行单因素分析，再用 Origin 2021 软件画图。2 结果与分析 2.1 菌株 Clpse01 形态学和分子鉴定结果 在 25 下，供试菌株 Clpse01 在 PDA 培养基上 20 d 左右可以长满直径 9 cm 的平板，菌落正面中心位置为白色，外围为黄色，布满气生菌丝，背面中心位置为黄色，外围为白色，黄色越靠近中心越深（图1A，B）。产孢时，分生孢子大量堆积形成孢子堆（图 1C，D）。分生孢子梗为帚状，具 4 级分枝，孢子为椭圆形（图 1E，F）。将扩增得到的 ITS（GenBank accession:OR047915）、nrLSU（GenBank accession:OR723498）、TUB2（GenBank accession:OR058866）和 TEF1（GenBank accession:OR733343）序列分别提交 NCBI 进行 Blast 比对，结果显示 Clpse01 与假卡鲁卡枝惠霉 C.pseudochroleuca 的同源性最高，其次为粉红枝穗霉和粉状枝穗霉 C.farinosa。进一步进行 ITS、nrLSU、TUB2 和 TEF1 四基因联合分析，选择 A，B：菌落正反面 Two sides of the colony；C，D：头状分生孢子及产孢结构 Aggregative sporogenous structure；E：橞状次生分生孢子梗 Brush-shaped conidiophores；F：分生孢子 Conidia 图 1 假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 的形态 Fig.1 Morphology of C.pseudochroleuca Clpse01 190 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 GTR+I 作为 ML 分析的最优模型构建 ML 系统发育树，结果显示所构建的枝惠霉属系统发育树拓扑结构与Wang 等13的结果较为一致，而菌株 Clpse01 与假卡鲁卡枝惠霉形成了一个独立的分支，自展值为 77%（图2）。因此，综合 blast 比对结果、系统进化树结果和该菌的形态鉴定结果，将菌株 Clpse01 鉴定为假卡鲁卡枝惠霉。图 2 用最大似然法构建的基于 ITS、nrLSU、TUB2 和 TEF1 合并数据集的枝惠霉属系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree of genus Clonostachys based on maximum likelihood analyses of a combined dataset of ITS,nrLSU,TUB2,and TEF1 sequences 第 1 期 徐勇等：灰葡萄孢寄生菌 Clpse01 的杀线活性研究 191 2.2 菌株 Clpse01 对灰葡萄孢菌的寄生作用 平板对峙试验中，对照组灰葡萄孢菌 5 d 长满培养皿，而试验组灰葡萄孢菌未长满培养皿（图 3A，E）。Clpse01 菌丝同灰葡萄孢菌菌丝在两者接触处有所交叉重叠，30 d 后菌丝覆盖在灰葡萄孢菌菌落表面，显微镜下可观察到灰葡萄孢菌及 Clpse01 的菌丝、产孢结构和分生孢子混合生长（图 3）。同时，观察到 Clpse01菌丝缠绕在灰葡萄孢菌的菌丝上（图 3F，G），灰葡萄孢菌菌丝破裂或萎缩，Clpse01 从其菌丝中生长出来并形成新的产孢结构（图 3H）。A：Clpse01 菌落 The colony of Clpse01；B：正常的灰葡萄孢菌菌丝 Mycelium of B.cinerea；C：灰葡萄孢菌分生孢子 Conidia of B.cinerea；D：灰葡萄孢菌分生孢子梗 Conidiophores of B.cinerea；E：Clpse01 与 B.cinerea 的对峙培养 Confrontation culture of Clpse01 and B.cinerea；F：菌落对峙中菌丝缠绕 Mycelium entanglement in the colony confrontation；G：Clpse01 寄生在 B.cinerea 菌丝上 The parasitism of Clpse01 on the mycelium of B.cinerea；H：B.cinerea 菌丝体上形成的 Clpse01 产孢结构 The sporogenous structure of Clpse01 on the mycelium of B.cinerea 图 3 假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 对灰葡萄孢菌的影响 Fig.3 Effect of C.pseudochroleuca Clpse01 on B.cinerea 2.3 菌株 Clpse01 对松材线虫繁殖能力的抑制效果 Clpse01 对松材线虫繁殖能力的影响显著（表 2），从线虫培养菌灰葡萄孢菌培养基上分离得到的松材线虫的活虫数和总数最多，分别为 33066 和 38666 条/皿。Clpse01 培养基上分离得到的松材线虫的活虫数和总数分别为 6 和 46 条/皿，活虫数和线虫总数均最小，显示出较好的杀灭和抑制线虫繁殖的能力。表 2 不同真菌培养 8 d 后松材线虫的数量 Table 2 The number of B.xylophilus cultured by different fungi after 8 days 真菌 Fungus 活虫数（条/皿）Number of alive nematode(piece/dish)总数（条/皿）Number of nematode(piece/dish)假卡鲁卡枝惠霉 Clonostachys pseudochroleuca Clpse01 64 c 4652 b 新拟盘多毛孢菌 Neopestalotiopsis sp.1366613671 bc 1553314334 b 芭蕉新拟盘多毛孢菌 Neopestalotiopsis musae 1706612838 b 18400.0013860 b 灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 330666882 a 386668441 a 注：图中数据以平均值标准差表示，不同小写字母表示差异显著（P0.05）。Note:Data in the figure were presented as meanSE,data with the different lowercases letters indicated significantly different(P0.05).2.4 菌株 Clpse01 发酵液对松材线虫生长的影响 菌株 Clpse01 发酵液对混合阶段的松材线虫具有显著的杀灭作用（图 4 A）。松材线虫 36 和 48 h 的校正死亡率为 66.23%和 88%，且随着时间的推移，其杀线活性越来越强。松材线虫在发酵液中出现了表皮和体腔分离、体腔断裂的现象（图 4 C，D），而在对照组中，松材线虫未出现异常现象（图 4 B）。2.5 菌株 Clpse01 孢子悬液对松材线虫生长的影响 菌株 Clpse01 孢子悬液对松材线虫具有杀灭作用（图 5A）。1108孢子/mL 孢子液的 12 和 24 h 校正死亡率为 62.23%和 88.33%，1107孢子/mL 孢子悬液的 12 和 24 h 校正死亡率为 19%和 49.67%。Clpse01192 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 孢子悬液对松材线虫的杀线活性随孢子浓度增加而增加。松材线虫在孢子悬液中，出现了表皮皱缩和虫体断裂的现象（图 5C，D），而对照组未出现异常现象（图 5B）。02040608010012243648时间 Time(h)校正死亡率Corrected mortality rate(%)图 4 假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 发酵液对松材线虫的杀线活性 Fig.4 The nematicidal activity of C.pseudochloleuca Clpse01 fermentation broth against pine wood nematodes 校正死亡率Corrected mortality rate(%)图 5 假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 孢子悬液对松材线虫的杀线活性 Fig.5 The nematicidal activity of C.pseudochloleuca Clpse01 spore suspension against pine wood nematodes 2.6 菌株 Clpse01 发酵液对松材线虫卵的孵化抑制作用 菌株 Clpse01 发酵液对松材线虫卵的孵化具有显著的抑制效果，2 倍稀释液可完全抑制卵的孵化。随着稀释倍数增加，假卡鲁卡枝惠霉发酵液对卵的孵化抑制效果有所下降，8 倍稀释液仅为 26.33%（图 6 A）。松材线虫的卵呈长椭圆形，外表光滑（图 6B），25 下放置 24 h 后，对照组卵孵化发育成 J2幼虫（图6C），试验组卵外表无光泽，出现卵膜破裂的现象（图 6D）。第 1 期 徐勇等：灰葡萄孢寄生菌 Clpse01 的杀线活性研究 193 孵化抑制率Incubation inhibition rate(%)图 6 假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 发酵液对松材线虫卵的孵化抑制作用 Fig.6 Incubation inhibition of C.pseudochroleuca Clpse01 fermentation broth on pine wood nematode eggs 2.7 菌株 Clpse01 的胞外物质测定结果 菌株 Clpse01 发酵液中含有大量蛋白质成份。0.5 h 发酵液总蛋白、-葡萄糖苷酶、几丁质酶含量分别为 1752.083、5.97 和 0.4245 U/mL，6 h 分别达到 1782.917、9.99 和 0.8792 U/mL，分泌的蛋白和酶含量随着时间增加而升高（图 7）。时间 Time(h)179017851780177517701765176017551750174501234560.5 1246115109876时间 Time(h)蛋白浓度Protein concentration(g/mL)-葡萄糖甘酶-Glucosidase(U/mL)AB1.00.40.90.80.70.60.5时间 Time(h)0.5 1246几丁质酶Chitinase(U/mL)C A：发酵液总蛋白浓度 Total protein concentration；B：-葡萄糖苷酶含量-glucosidase content；C：几丁质酶含量 Chitinase content 图 7 假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 发酵液胞外物质测定结果 Fig.7 Extracellular substance determination in fermentation liquors of C.pseudochroleuca Clpse01 194 中 国 生 物 防 治 学 报 第 40 卷 3 讨论 根据形态学和分子系统学鉴定，Clpse01 被鉴定为假卡鲁卡枝惠霉 C.pseudochroleuca，这是国内首次报道该种真菌对松材线虫的防治作用。枝穗霉属是松材线虫重要的生防真菌来源之一，其中，粉红枝穗霉对松材线虫的防治研究较多。粉红枝穗霉 YMF1.00133 是从淡水水底木质基质中分离出来的一种枝穗霉属真菌，其发酵液对松材线虫具有杀线活性，其后研究人员对其杀线机理进行了一系列的研究。粉红枝穗霉YMF1.00133 的胞外蛋白酶中存在两种类丝氨酸蛋白酶 Lmz1 和 PrC，其可以有效降解全齿复活线虫的角质层21,22。Zhang 等23通过绿色荧光标记技术探究了粉红枝穗霉 YMF1.00133 对松材线虫的侵染过程，结果显示粉红枝穗霉 YMF1.00133 分生孢子能粘附在线虫角质层上萌发，然后通过芽管结构进入线虫体内，导致线虫死亡和降解。Song 等11通过纯化分离，从粉红枝穗霉 YMF1.00133 的代谢产物中得到两种活性产物，Gliocladin C和5-n-heneicosylresorcinol，其对松材线虫的ED50为200和180 g/mL。粉红枝穗霉YMF1.00133对松材线虫的活性物质，包含胞外蛋白酶和天然化学物质，同时，其芽管和分生孢子等生物结构也参与了对松材线虫的毒杀行动，这表明粉红枝穗霉对松材线虫的杀灭是一个多因素参与的过程。本研究中，假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 的发酵液和孢子悬液对松材线虫表现出显著的杀线效果，可能也是一个多因素参与的过程，并且 Clpse01 还可通过寄生松材线虫的扑食真菌而抑制线虫的生长和繁殖，是一个优良的生防菌。生防真菌可以通过捕捉、寄生、产生毒素和胞外酶侵染等方式杀死线虫。已有研究表明，胞外酶（包括丝氨酸蛋白酶、几丁质酶和胶原蛋白酶）作为重要的毒力因子在侵染线虫过程中能够降解线虫角质层和虫卵卵壳，在线虫生物防治中显示出巨大的应用潜力24。朱先婷等25发现一株可以寄生南方根结线虫卵的长梗木霉，该菌胞外几丁质酶活性与该菌株对南方根结线虫卵的寄生率正相关，表明几丁质酶在该菌穿透线虫卵壳中发挥了重要作用。贡莎莎等26发现少孢节丛孢菌 XJ-A1 的重组几丁质酶液作用秀丽隐杆线虫幼虫后，幼虫虫体体壁皱缩破裂和体壁组织发生降解的现象。本文中，假卡鲁卡枝惠霉可以产生-葡萄糖苷酶和几丁质酶，这可能是松材线虫出现虫体皱缩、断裂和卵膜破裂的原因。松材线虫在繁殖型周期内 45 d 可以繁殖一代27，短时间内即可迅速扩大种群数量，因此有效控制松材线虫种群的增长对松材线虫病防治意义重大。Iqbal等28发现粉红枝惠霉菌株可以寄生在短体线虫Pratylenchus sp.的卵上，导致短体线虫的卵孵化率和种群中幼虫的数量显著下降。Vine 等29将 Lemurostrongylus sp.的卵暴露在粉红枝惠霉菌液中，结果发现粉红枝惠霉菌液中线虫卵出现空泡化现象而造成不可逆的损伤，导致其孵化率显著下降。本文中，假卡鲁卡枝惠霉发酵液同样对松材线虫卵的孵化具有明显的抑制作用。王旻嘉等16筛选木腐菌发现，将 2000 条松材线虫接种到糙皮侧耳和硫磺菌的培养基上，8 d 后完全分离不出松材线虫。李玉中等30发现松材线虫在新假革耳 Neonothopanus nambi 和棕榈微皮伞 Marasmiellus palmivorus平板菌落上完全不能存活，两种真菌菌丝对松材线虫的 48 h 捕食率分别为 100%和 93.6%。本研究中，假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 对松材线虫的种群增长同样表现出明显的抑制作用。灰葡萄孢菌是培养松材线虫的常用菌株，通过其可实现对松材线虫的快速繁殖，而灰葡萄孢菌引起的灰霉病也是一种作物常见真菌性病害且较难防治。Hasan 等31发现当粉红枝惠霉遇到灰葡萄孢菌时会产生乳头、线圈和附着胞，以攻击和穿透灰葡萄孢菌，进而实现寄生。本研究同样观察到假卡鲁卡枝惠霉对灰葡萄孢菌的寄生现象，通过缠绕和侵入最终瓦解灰葡萄孢菌菌丝，但更深层次的观察和研究有待下一步试验。本文发现假卡鲁卡枝惠霉 Clpse01 对松材线虫和灰葡萄孢菌具有双重防治效果，在松材线虫防治领域具有广阔的应用前景。参 考 文 献 1 Nickle W R,Golden A M,Mamiya Y,et al.On the taxonomy and morphology of the pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer 1934)Nickle 1970J.Journal of Nematology,1981,13(3):385-392.2 Futai K.Pine wood nematode,Bursaphelenchus xylophilusJ.Annual Review Phytopathology,2013,51:61-83.3 叶建仁,吴小芹.松材线虫病研究进展J.中国森林病虫,2022,41(3):1-10.4 Lahlali R,Ezrari S,Radouane N J,et al.Biological control of plant pathogens:a global perspectiveJ.Microorganisms,2022,10(3):596.第 1 期 徐勇等：灰葡萄孢寄生菌 Clpse01 的杀线活性研究 195 5 Zhang H,Wei Z,Zhang J,et al.Classification of dendrocola nematode-trapping fungiJ.Journal of Forestry Research,2020,32(3):1295-1304.6 Schroers H J.A monogra