RNA结合蛋白ZFP36在心肌细胞缺氧_复氧损伤中的作用及调控机制.pdf

第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o M a r 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版基础研究R N A结合蛋白Z F P 在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制吕果,孙超峰,张皓,李红军,王芳(汉中市中心医院心内科,陕西汉中 ;西安交通大学第一附属医院心血管内科,陕西西安 ;汉中市疾控中心慢病科,陕西汉中 )摘要:目的探讨R NA结合锌指蛋白(Z F P )在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤和自噬中的作用及分子调控机制.方法H C 大鼠心肌细胞感染Z F P 过表达慢病毒(O E Z F P )或其阴性对照慢病毒(O E Z F P N C)构建稳转细胞株;转染A T G D过表达质粒(O E A T G D)提高A T G D表达.H/R处理诱导心肌细胞损伤;将H C 细胞分为对照组、H/R组、O E Z F P N CH/R组、O E Z F P H/R组、O E A T G D N CH/R组、O E A T G DH/R组、O E Z F P O E A T G D N C H/R组 和O E Z F P O E A T G D H/R组.各 组 细 胞 应 用W e s t e r nb l o t t i n g检测A T G D、B e c l i n、L C 和Z F P 蛋白表达;实时荧光定量P C R(q P C R)检测Z F P 和A T G D mR NA表达;C C K 检测细胞活性;酶联免疫吸附法(E L I S A)检测白介素(I L )和肿瘤坏死因子(T N F )水平;D C F H D A法检测活性氧(R O S)水平;S O D试剂盒检测S O D水平;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞免疫荧光检测L C 自噬体;双荧光素酶报告基因实验检测Z F P 和A T G DmR NA的结合.结果与对照组比较,H/R组中细胞活性降低,I L 和TN F 水平提高,R O S水平升高而S O D水平降低,细胞凋亡增加;A T G D、B e c l i n 蛋白表达上调,同时L C/L C 比值也显著增加;且Z F P 表达上调(P).与O E Z F P N CH/R组比较,O E Z F P H/R组中细胞活性提高,I L 和T N F 水平降低,R O S水平下降而S O D水平升高,细胞凋亡减少,且A T G D、B e c l i n 蛋白表达下调,L C /L C 比值也显著下调(P).与感染O E Z F P N C慢病毒比较,感染O E Z F P 慢病毒降低A T G D UT R报告基因的荧光素酶活性,降低A T G DmR NA稳定性,下调H/R诱导的A T G D mR NA表达(P).与O E A T G DN CH/R组相比,O E A T G DH/R组中的A T G DmR NA和蛋白表达显著上调,且细胞活性降低,I L 和T N F 水平增高,R O S水平升高而S O D水平降低,细胞凋亡增加(P ).与O E Z F P O E A T G DN CH/R组比较,O E Z F P O E A T G DH/R组中细胞活性降低,I L 和T N F 水平增高,R O S水平升高而S O D水平降低,细胞凋亡增加(P).结论Z F P 在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达上调,过表达Z F P 抑制了H/R诱导的心肌细胞损伤,并通过调控A T G D抑制自噬,进而抵抗心肌细胞H/R损伤,证明Z F P 是抵抗心肌缺血再灌注损伤的重要调控分子.关键词:心肌缺血再灌注损伤(M I/R I);锌指蛋白(Z F P );自噬;转录后调控;自噬相关蛋白 D(A T G D)中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:汉中市中心医院青年辅助计划资助项目(Y K )S u p p o r t e db yY o u t hS u p p o r tP r o j e c to fH a n z h o n gC e n t r a lH o s p i t a l(Y K )通信作者:王芳 E m a i l:w f c o m网络出版地址:h t t p s:/l i n k c n k i n e t/u r l i d/R ()T h e r o l ea n dr e g u l a t o r ym e c h a n i s mo fR N Ab i n d i n gp r o t e i nZ F P i nh y p o x i a/r e o x y g e n a t i o n i n j u r yo f c a r d i o m y o c y t e sL G u o,S UNC h a o f e n g,Z HANG H a o,L IH o n g j u n,WANGF a n g(D e p a r t m e n to fC a r d i o l o g y,H a n z h o n gC e n t r a lH o s p i t a l,H a n z h o n g ;D e p a r t m e n to fC a r d i o v a s c u l a rM e d i c i n e,T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fX ia nJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,X ia n ;D e p a r t m e n to fC h r o n i cD i s e a s e,H a n z h o n gC e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n,H a n z h o n g ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v eT oe xpl o r et h er o l eo fZ F P i nc a r d i o myo cyt ei nju rya n da u t oph ag yi n d u c e dbyhy po x i a/r e o xy ge n a t i o n(H/R)s oa s t oc l a r i fyi t sm o l e c u l a rr egu l a t o rym e c h a n i s mM e t h o d s H C r a tc a r d i o myo cyt e s西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版w e r e i n f e c t e dw i t hZ F P o v e r e xpr e s s i ngl e n t i v i r u s(O E Z F P )o r i t sn ega t i v ec o n t r o l l e n t i v i r u s(O E Z F P N C)t oc o n s t r u c t s t a b l ec e l l l i n e s,r e spe c t i v e ly T r a n s f e c t i o no fA T G Do v e r e xpr e s s i o npl a s m i d(O E A T G D)i mpr o v e dt h ee xpr e s s i o no fA T G D Hy po x i a/r e o xy ge n a t i o n(H/R)i n d u c e dmyo c a r d i a lc e l l i nju ry H C c e l l sw e r em a i n lyd i v i d e di n t oc o n t r o lgr o up,H/Rgr o up,O E Z F P N CH/Rgr o up,O E Z F P H/Rgr o up,O E A T G D N CH/Rgr o up,O E A T G DH/Rgr o up,O E Z F P O E A T G DN CH/Rgr o up,a n dO E Z F P O E A T G DH/Rgr o up T h epr o t e i ne xpr e s s i o n so fA T G D,B e c l i n,L C a n dZ F P i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbyW e s t e r nb l o t t i ng T h e mRNA l e v e l so f Z F P a n d A T G D i n H C c e l l s w e r e d e t e c t e d byR e a l t i m ef l u o r e s c e n c equ a n t i t a t i v eP C R(qP C R)T h ev i a b i l i tyo fH C c e l l sw a s d e t e c t e dbyC C K a s s ay T h e l e v e l so f i n t e r l e u k i n(I L )a n dt u m o rn e c r o s i s f a c t o r(T N F )i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbye n zym e l i n k e di mm u n o s o r b e n ta s s ay(E L I S A)R e a c t i v eo xy ge nspe c i e s(RO S)i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbyD C F H DA m e t h o d S ODd e t e c t i o nk i tw a su s e dt od e t e c tt h e S OD l e v e li n H C c e l l s T h e apopt o s i s o f H C c e l l s w a s d e t e c t e d byf l o w cyt o m e t ryL C a u t oph ago s o m e s i nH C c e l l sw e r ed e t e c t e dbyc e l l u l a r i mm u n o f l u o r e s c e n c e D u a l l u c i f e r a s e r epo r t e rge n ea s s ayw a su s e dt od e t e c t t h eb i n d i ngo fZ F P a n dA T G DmRNAi nH C c e l l s R e s u l t s C o mpa r e dw i t hc o n t r o lgr o up,H/Rgr o ups h o w e dd e c r e a s e dc e l l v i a b i l i ty,i n c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,i n c r e a s e dRO S l e v e l sa n dd e c r e a s e dS ODl e v e l s,i n c r e a s e dc e l l apopt o s i s Up r egu l a t e dA T G Da n dB e c l i n pr o t e i ne xpr e s s i o n,i n c r e a s e dL C/L C r a t i o,a sw e l l a supr egu l a t e dZ F P e xpr e s s i o nw e r ef o u n di nH/Rgr o up(a l lP)C o mpa r e dw i t hO E Z F P N CH/Rgr o up,e l e v a t e dc e l lv i a b i l i ty,d e c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,d e c r e a s e d RO Sl e v e l sa n di n c r e a s e dS ODl e v e l s,r e d u c e dc e l l apopt o s i s(P),a n dd o w n r egu l a t e dA T G Da n dB e c l i n pr o t e i ne xpr e s s i o n,d e c r e a s e dL C/L C r a t i ow e r e s h o w n i nO E Z F P H/Rgr o up(a l lP)C o mpa r e dw i t h i n f e c t i o nw i t hO E Z F P N Cl e n t i v i r u s,i n f e c t i o nw i t hO E Z F P l e n t i v i r u sd e c r e a s e dt h el u c i f e r a s ea c t i v i tyo fA T G D U T Rr epo r t e rge n e,d e c r e a s e dt h es t a b i l i tyo fA T G DmRNA,a n dd o w n r egu l a t e dt h eH/R i n d u c e dA T G DmRNAe xpr e s s i o n(a l lP)C o mpa r e dw i t hO E A T G DN CH/Rgr o up,O E A T G DH/Rgr o uph a dupr egu l a t e dA T G DmRNAa n dpr o t e i ne xpr e s s i o n,d e c r e a s e dc e l l v i a b i l i ty,i n c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,i n c r e a s e dRO Sl e v e l s,d e c r e a s e dS ODl e v e l sa n de l e v a t e dc e l l apopt o s i s(a l lP)C o mpa r e dw i t hO E Z F P O E A T G D N CH/Rgr o up,O E Z F P O E A T G DH/Rgr o uph a dd e c r e a s e dc e l lv i a b i l i ty,i n c r e a s e dI L a n dT N F l e v e l s,i n c r e a s e dRO Sl e v e l s,d e c r e a s e dS O Dl e v e l sa n de l e v a t e dc e l lapopt o s i s(a l lP )C o n c l u s i o nT h ee xpr e s s i o no fZ F P i supr egu l a t e d i nH/R i n d u c e dc a r d i o myo cyt e i nju ry T h eo v e r e xpr e s s i o no fZ F P i n h i b i t sH/R i n d u c e dc a r d i o myo cyt ei nju rya n da u t oph ag ybyr egu l a t i ngA T G D,t h u sr e s i s t i ngc a r d i o myo cyt eH/Ri nju ry I tpr o v e st h a tZ F P i sa ni mpo r t a n t r egu l a t o rym o l e c u l eaga i n s tM I/R I K E Y WO R D S:myo c a r d i a l i s c h e m i a r epe r f u s i o n i nju ry(M I/R I);Z F P ;a u t oph ag y;po s t t r a n s f e c t i o nr egu l a t i o n;A T G D心肌梗死(m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n,M I)是引发心血管疾病死亡率位居世界首位的重要原因,其主要病理表现为心肌组织长期缺血缺氧.临床上,及时恢复缺血心肌的血流(再灌注)可限制梗死面积,然而,这种再灌注可能导致组织发生不可逆的损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(m y o c a r d i a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o ni n j u r y,M I/R I).目前尚无有效防治M I/R I的方法.因此,进一步明确M I/R I的分子机制,寻找有效缓解M I/R I的靶点是急需解决的重要科学问题.自噬(a u t o p h a g y)是细胞内维持稳态的一种重要代谢过程.但自噬在心脏的缺血/再灌注(I/R)损伤过程中的复杂作用尚未阐明,需要进一步研究.已有研 究 表 明 自 噬 相 关 蛋 白 D(a u t o p h a g y r e l a t e d D,AT G D)的异常高表达是各种疾病发生自噬的重要原因,但其高表达的原因仍不完全了解 .因此,本研究探究M I/R I中AT G D是否存在异常高表达.研究表明,R NA结合锌指蛋白(z i n cf i n g e rp r o t e i n,Z F P )是一种包含A R E的结合蛋白,与mR NA UT R结 合 降 低mR NA的 稳 定 性.Z F P 具有抗炎、抗凋亡作用,在肺I/R损伤、脑I/R损伤中具有保护作用 ,而尚无报道Z F P 在M I/R I中的表达和相关分子机制.综上,本研究旨在探讨Z F P 在M I/R I中的功能及其分子调控机制,为治疗M I/R I提供新的靶点.材料与方法细胞及试剂H C 心肌细胞(AT C C).DMEM培养基(美国康宁),胎牛血清(G i b c o),C C K 试剂盒(索莱宝生物),白介素(I L )、肿瘤坏死因子(T N F )酶联免疫 吸 附 法(E L I S A)检 测 试 剂 盒(E l a b s c i e n c e公司),活性氧(R O S)、超氧化物歧化酶(S O D)活性、细期吕果,孙超峰,张皓,等 R NA结合蛋白Z F P 在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版胞凋亡检测试剂盒、T r i z o l试剂(碧云天生物),B C A蛋白 定 量 试 剂 盒(普 利 莱 生 物),逆 转 录 试 剂 盒(T a k a r a),S Y B RG r e e nq P C RS u p e r M i x(R o c h e),标准蛋白M a r k e r(赛默飞),P V D F膜、E C L发光试剂盒(M i l l i p o r e),Z F P 、AT G D抗 体(I n v i t r o g e n),B e c l i n、L C/L C、GA P DH抗体及H R P标记的山羊抗小鼠I g G、H R P标记的山羊抗兔I g G、A l e x aF l u o r 标记的山羊抗兔I g G(A b c a m).细胞培养与I/R细胞损伤模型的构建H C 心肌细胞复苏和培养:将从液氮中取出的H C 心肌细胞冻存管迅速置于水浴锅中解冻.将融化的冻存液转入提前备好的含有m L完全培养基(m L/LF B S m L/LDMEM培养基)的培养瓶中,于培养箱(,m L/LC O)中培养h,待细胞贴壁后更换m L新鲜的培养液继续培养.待细胞汇合度达到 时,进行消化传代,并根据实验需求进行铺板.心肌细胞损伤模型的构建:选择生长状态良好的H C 心肌细胞,更换为无血清、无糖的DM E M培养基,置于、m L/LO、m L/LN、m L/LO细胞培养箱中进行缺氧孵育h.然后恢复常态培养即复氧(含 m L/LF B S的DMEM,、m L/LC O培养箱)培养h.细胞分组将H C 心肌细胞随机分为组:c o n t r o l(对照)组为 正 常 培 养;H/R组 为 缺 氧 h/复 氧 h;O E Z F P N CH/R组和O E Z F P H/R组 分别为H C 细 胞 感 染Z F P 过 表 达 阴 性 对 照(O E Z F P N C)的 慢 病 毒、Z F P 过 表 达(O E Z F P )的慢病毒后,缺氧h/复氧h.为了阐明AT G D能否介导Z F P 在H/R诱导心肌细胞损伤中的作用,通过转染AT G D的过表达质粒进行逆转实验,将H C 心肌细胞随机分为O E AT G DN CH/R组、O E AT G DH/R组、O E Z F P H/R组、O E Z F P O E AT G DN CH/R组、O E Z F P O E AT G DH/R组共组,各组分别转染AT G D过表达阴性对照(O E AT G DN C)质粒、AT G D过表达(O E AT G D)质粒、感染O E Z F P 慢病毒、在感染O E Z F P 慢病毒的H C 细胞中转染O E A T G DN C质粒及在感染O E Z F P 慢病毒的H C 细胞中转染O E AT G D质粒,之后再进行缺氧h/复氧h.C C K 检测细胞活性首先建立心肌细胞H/R模型观察H/R诱导后对心肌细胞损伤的影响.根据C C K 试剂盒说明书检测 各 组 的 细 胞 活 性(孔 板),加 入 L/孔C C K 试剂,用锡箔纸避光,、m L/LC O细胞培养箱孵育h,酶标仪 n m的波长下读取吸光度A n m值.此外,无细胞的孔加入 L培养基作为空白孔.E L I S A检测炎性因子水平收集各组细胞,消化后用P B S洗涤细胞,弃去上清.每个E P管中加入 LP B S(含PM S F),超声裂解细胞(冰浴超声,超声 s,间隔s,如此重复 次).参照E l a b s c i e n c e试剂盒说明书检测方法检测I L 、T N F 水平.细胞氧化应激水平检测细胞R O S水平检测采用D C F H D A法.根据R O S荧光法试剂盒说明书,各组细胞的每孔加入 L稀释好的D C F H D A(无血清培养液:D C F H D A ,D C F H D A终浓度为 m o l/L),孵育 m i n.荧光酶标仪下检测.根据S O D检测试剂盒说明书,测定细胞中S O D含量.流式细胞术检测细胞凋亡根据A n n e x i nV F I T C/P I试剂盒说明书,检测各组细胞凋亡.P B S洗涤每组细胞,加入 Lb i n d i n gb u f f e r,设置空白组、V F I T C组、P I组和样品组(V F I T C和P I各L),室温避光孵育 m i n.流式细胞仪进行检测.细胞免疫荧光染色C o n t r o l组、H/R组、O E Z F P N CH/R组和O E Z F P H/R组的细胞经固定,清洗,通透后,g/LB S A(P B S配制)室温封闭h.然后加入一抗,孵 育 过 夜;清 洗 后 加 入 荧 光 标 记 的 二 抗,孵育h(注意避光);弃二抗,D A P I染核后,m L/L甘油封片,显微镜拍照.W e s t e r nb l o t t i n g检测蛋白表达R I P A裂解液分别提取各组细胞总蛋白,B C A蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度.经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜,然后室温封闭h.随后加入一抗,过夜后洗去一抗,加入二抗,室温孵育h.配制E C L化学发光液,将P V D F膜置于化学发光仪上涂适量的化学发光液进行显影检测.实时荧光定量P C R(q P C R)检测m R N A表达T r i z o l法分别提取各组细胞总R NA.反转录试剂盒将其反转录为c D NA;根据实时定量P C R试剂说明书配制 L的反应体系:S Y B Rm i xL、c D NAL、上游引物和下游引物各L、D E P C水L.实时荧光定量P C R反应程序为:预变性 s,(变性s,延伸 s)个循西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版环,采用 a c t i n作为内参,C t法计算mR NA表达变化.双荧光素酶报告基因检测通 过S t a r b a s e数 据 库(h t t p:/s t a r b a s e s y s u e d u c n)预测Z F P 可与AT G DmR NA UT R结合.为了验证结合作用,构建AT G D UT R报告基因载体(AT G D w t)及其对应的突变报告基因载体(AT G D m u t),分别转染到感染O E Z F P N C和O E Z F P 慢病毒 的 细 胞 中,即 分 为组:O E Z F P N CAT G D m u t组、O E Z F P AT G D m u t组、O E Z F P N C AT G D w t组 和O E Z F P AT G D w t组.转染 h后,采用双荧光素酶报告试剂盒检测荧光素酶活性.海肾荧光素酶活性作为内参.R N A稳定性实验在O E N CH/R和O E Z F P H/R组中分别加入g/L放线菌素D,在加入放线菌素D后的、h收 集 细 胞,进 行q P C R实 验,检 测AT G DmR NA表达变化.统计学分析所有数据采用G r a p h P a dP r i s m软件进行统计分析,每种实验至少重复次,实验数据均符合正态分布,以均数标准差(xs)表示.两组之间的比较采用t检验;多组之间的比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用B o n f e r r o n i方法.P 为差异有统计学意义.结果H/R诱导心肌细胞损伤C C K 检测结果发现,与对照组相比,H/R组中细胞活性显著下降(P);E L I S A检测结果显示,与对照组相比,H/R组中I L 和T N F 水平显著上升(P);R O S水平显著升高(P),而S O D水平显著下降(图,P).流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,H/R组中细胞凋亡率增加(P).以上结果提示心肌细胞的H/R损伤模型构建成功.A:C C K 法检测细胞活性;B、C:E L I S A分别检测细胞中I L 、T N F 的水平;D:D C F H D A法检测细胞中R O S水平;E:S O D检测试剂盒检测细胞中S O D水平;F、G:流式细胞仪检测细胞凋亡及统计学比较.与对照组(c o n t r o l)比较,P.图H/R诱导对心肌细胞损伤的影响F i g E f f e c to fH/Ri n d u c t i o no nc a r d i o m y o c y t e i n j u r yH/R诱导心肌细胞自噬L C 细胞免疫荧光结果显示,对照组细胞溶质内L C 绿色荧光呈现无规则的弥散状分布;H/R组细胞内源性L C 呈现出斑点状(图 A),提示H/R诱导后细胞内的自噬水平升高.W e s t e r nb l o t t i n g检测结果显示,与对照组相比,H/R组中AT G D和B e c l i n 蛋白显著增加(P ),同时L C/L C 比值也显著增加(图 BE,P).H/R诱导心肌细胞中Z F P 的表达上调q P C R检测结果显示,与对照组相比,H/R诱导的心肌细胞中Z F P mR NA表达显著增加(图 A,P);W e s t e r nb l o t t i n g检测结果显示,H/R诱导的心肌细胞中Z F P 蛋白表达也显著上调(图 B、C,P).期吕果,孙超峰,张皓,等 R NA结合蛋白Z F P 在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A:细胞免疫荧光检测L C 的表达情况;BE:H/R损伤后自噬相关蛋白A T G D、B e c l i n、L C 的表达情况及统计分析.与对照组(c o n t r o l)比较,P.图H/R诱导对心肌细胞自噬的影响F i g E f f e c to fH/Ri n d u c t i o no na u t o p h a g y i nc a r d i o m y o c y t e sA:q P C R检测Z F P mR NA表达;B、C:w e s t e r nb l o t t i n g检测Z F P 蛋白表达及统计分析.与对照组(c o n t r o l)比较,P.图H/R诱导的心肌细胞中Z F P 的表达情况F i g E x p r e s s i o no fZ F P i nH/R i n d u c e dc a r d i o m y o c y t e sZ F P 过表达可抑制H/R诱导的心肌细胞损伤q P C R和W e s t e r nb l o t t i n g检 测 结 果 显 示,与O E Z F P N CH/R组相比,O E Z F P H/R组的Z F P mR NA和蛋白表达均显著增加(图 A、B,P).C C K 细胞活性结果显示,与O E Z F P N C组相比,O E Z F P H/R组心肌细胞活性显著增加(图 C,P);细胞炎性因子水平检测结果发现,与O E Z F P N C组相比,O E Z F P H/R组中I L 和T N F 水平显著减少(图 D、E,P);氧 化 应 激 水 平 检 测 结 果 显 示,与O E Z F P N C组相比,O E Z F P H/R组中R O S水平显著降低(图 F,P),而S O D水平显著增加(图 G,P);流式检测细胞凋亡结果发现,与O E Z F P N C组相比,O E Z F P H/R组中细胞凋亡率显著减少(图 H、I,P).Z F P 过表达可抑制H/R诱导的心肌细胞自噬L C 免疫荧光检测结果发现,与O E Z F P N C组相比,O E Z F P H/R组内源性L C 在自噬体膜上的斑点状态减少(图 A).W e s t e r nb l o t t i n g检测自噬相关蛋白,结果发现与O E Z F P N C组相比,O E Z F P H/R组中AT G D和B e c l i n 蛋白显著 降 低,同 时L C/L C 比 值 也 显 著 减 少(图 BE,P).Z F P 通过调控A T G D表达抑制自噬S t a r b a s e数据库预测发现Z F P 可与AT G DmR NA UT R结合(图 A).为了证实Z F P 是否西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A:q P C R检测Z F P mR NA表达;B:W e s t e r nb l o t t i n g检测Z F P 蛋白表达及比较;C:C C K 方法检测细胞活性;D、E:E L I S A方法检测I L 、T N F 水平;F:D C F H D A法检测细胞中RO S水平;G:S O D检测试剂盒检测细胞中S O D水平;H、I:流式细胞仪检测细胞凋亡并统计分析细胞凋亡率.与对照组(c o n t r o l)比较,P;与O E Z F P N CH/R组比较,P.图Z F P 过表达对H/R诱导的心肌细胞损伤的影响F i g E f f e c to fZ F P o v e r e x p r e s s i o no nH/R i n d u c e dc a r d i o m y o c y t e i n j u r yA:L C 免疫荧光结果;BE:W e s t e r nb l o t t i n g检测A T G D、B e c l i n、L C 的蛋白表达及统计分析.与对照组比较,P;与O E Z F P N CH/R组比较,P.图Z F P 过表达对H/R诱导的心肌细胞自噬的影响F i g E f f e c to fZ F P o v e r e x p r e s s i o no nH/R i n d u c e da u t o p h a g y i nc a r d i o m y o c y t e s期吕果,孙超峰,张皓,等 R NA结合蛋白Z F P 在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版靶向AT G D mR NA UT R,进一步克隆了含有Z F P 结合位点的AT G D UT R区到荧光素酶载体中.Z F P 过表达降低了荧光素酶活性,而当 UT R位点发生突变时,Z F P 无法与突变的核苷酸结合,荧光素酶活性无显著下降,证明Z F P 直接靶向AT G D mR NA UT R(图 B,P);将Z F P 过 表 达 后,q P C R检 测 结 果 显 示,与O E Z F P N CH/R组相比,O E Z F P H/R组中AT G DmR NA表达显著降低(图 C,P),证明Z F P 过表 达抑制了H/R诱导的心 肌细胞中AT G DmR NA表达;进一步研究Z F P 对AT G DmR NA稳 定 性 的 影 响,用 放 线 菌 素D处 理 细 胞,q P C R检测结果发现,与O E Z F P N CH/R组相比,O E Z F P H/R组中AT G D mR NA半衰期缩短(图 D,P).A:S t a r b a s e数据库预测Z F P 与A T G D的结合位点;B:荧光素酶活性检测结果,与O E Z F P N CA T G D w t组相比,P;C:q P C R检测A T G DmR NA表达,与对照组(c o n t r o l)比较,P;与O E Z F P N CH/R组比较,P;D:A T G DmR NA稳定性实验,与O E Z F P N CH/R组比较,P.图Z F P 通过调控A T G D表达抑制自噬F i g Z F P i n h i b i t e da u t o p h a g yb yr e g u l a t i n gA T