LC-MS_MS法分析去水山莨菪碱在大鼠体内的药代动力学研究.pdf

药理毒理.65Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床LC-MS/MS法分析去水山著碱在大鼠体内的药代动力学研究吴瑞，刘艳芳，张芳，姚辰昊，余宇洁，张建兰，代书，万峰 2，南峰，李芸霞摘要】目的：评价不同给药途径和剂量对氢溴酸山蓉碱（AniHBr）代谢物去水山蓉碱（RIMPI）在大鼠体内的药代动力学特征的影响。方法：使用LC-MS/MS技术建立RIMPI在大鼠血浆中的生物分析方法。大鼠灌胃氢AniHBr片（12.5、2 5、50 m g k g）以及尾静脉注射AniHBr注射液（4、8、16 mgkg）后，于不同时间点采集血浆以检测RIMPl的血药浓度，评估RIMPI在大鼠体内的药代动力学参数。结果：测定大鼠血浆中RIMPI的方法专属性良好，线性范围为1500ng:mL，批内及批间精密度（RSD）均 11.0%，准确度为9 1.1 10 7.5%，基质效应无明显干扰，达到生物样本分析方法要求。通过灌胃和尾静脉注射给药，在不同剂量下发现RIMPI的药代动力学特征可能呈非线性动力学过程。结论：基于LC-MS/MS技术，建立了RIMPI在大鼠血浆中的方法学并评价了其药代动力学特征。关键词 LC-MS/MS；去水山碱；药代动力学中图分类号 R285.5文献标识码 A文章编号】16 7 4-9 2 6 X(2023)05-011-04Study on pharmacokinetics of raceanisodamine impurityI in Rats by LC-MS/MS/WU Rui,LIU Yan-fang,ZHANGFang,YAO Chen-hao,YU Yujie,ZHANG Jian-lan,DAI Shu,WAN Feng,NAN Feng,LI Yun-xid/(I.School of Pharmacy.State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,Sichuan;2.Chengdu NO.1 Pharmaceutical Co.,Ltd.,Pengzhou 610031,Sichuan;3.Drug Clinical TrialInstitution,The Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,Sichuan)Abstract Objective:To evaluate the influence of different administration routes and doses on the pharmacokineticcharacteristics of dehydrated anisodamine(RIMP I)in rats.Method:High performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(LC-MS/MS)method was used to establish a bioanalysis method for RIMP I in rat plasma.After intragastricadministration of anisodamine hydrobromide(Ani HBr)tablets(12.5,25,50 mg:kg)and tail vein injection of Ani HBr injection(4,8,16 mg:kg)in rats,plasma was collected at different time points to detect the plasma concentration of RIMP I and evaluate itspharmacokinetic parameters in rats.Result:The method for determining RIMP Iin rat plasma had good specificity,with a linearrange of 1500 ng:mL.The intra and inter batch precision(RSD)were lower than 11.0%,and the accuracy was at 91.1107.5%.The matrix effect had no significant interference,meeting the requirements of biological sample analysis methods.Through oraland intravenous administration,it was found that the pharmacokinetic characteristics of RIMP I may exhibit a nonlinear kineticprocess at different doses.Conclusion:With the support of LC-MS/MS technology,a methodology for RIMP I in rat plasma isestablished and its pharmacokinetic characteristics are evaluated.Key words LC-MS/MS;dehydrated anisodamine;pharmacokinetics去水山若碱（阿托酸6-羟基-3-托品酯，RaceanisodamineImpurityI，RIM PI）是氢溴酸山若碱（Anisodamine hydrobromide，A n i H Br）在大鼠体内的一相代谢产物，也是消旋山食若碱在基金项目 四川省科技厅应用基础项目（2 0 2 1JDKY0013作者单位】1.成都中医药大学药学院西南特色中药资源国家重点实验室，四川成都6 11137；2.成都第一制药有限公司，四川成都6 10 0 31；3.成都中医药大学附属医院国家药物临床试验机构，四川成都6 10 0 7 5作者简介】吴瑞，女，硕士研究生，研究方向：中药安全性有效性研究Tel:13540480932E-mail:通讯作者 李芸霞，女，博士生导师，研究方向：中药安全性有效性研究EE-mail:收稿日期 2 0 2 3-10-10合成过程中产生的杂质2)。作为经典的抗胆碱能药物，山若碱与阿托品（Atropine,Atr）结构相似，都是M受体的拮抗剂，在改善血管微循环障碍方面有显著疗效3.41。早期文献报道，Atr的去水代谢产物可能存在副作用，造成急性呼吸抑制5】。而关于山若碱的去水代谢产物尚无相关研究，因此基于HPLC-MS/MS技术，通过对大鼠灌胃和尾静脉注射AniHBr后，检测大鼠体内RIMPI的血药浓度，为AniHBr片和注射液的安全性提供参考。1材料、试药与仪器1.1材料乙腈（色谱纯，FisherScientific）；甲醇（色谱:66PharmacyChinese MateriaMedica2023;14(6)ana中药与临床纯，FisherScientific）；乙酸乙酯（色谱纯，FisherScientific）；重蒸水（实验室自制）；乙酸铵（分析纯，成都市科隆化学品有限公司）；甲酸（色谱级，美国ACS恩科化学公司）；氢氧化钠（分析级，成都市科隆化学品有限公司）1.2试药氢溴酸山若碱片（批号：国药准字H51023899），注射液（批号：国药准字H51021970），去水山若碱标准品（批号：10 1135-201402），硫酸阿托品标准品（批号：10 0 40-2 0 16 13纯度：9 6.7%)由成都第一制药公司提供。1.3仪器岛津LC-20系列高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；40 0 0 QTRAP三重四级杆质谱仪（美国ABSCIEX公司）；TGL-21高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；VX-II多管涡旋萃取震荡器（北京安简科技有限公司）；BT-II水浴式氮吹仪（北京安简科技有限公司）；NA-15L小型氮气发生器（北京安简科技有限公司）O1.4动物36只大鼠，雌雄各半，体重2 50 2 0 g，购买于成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SYXK（川I）2020-124。本项目的所有动物实验均遵循成都中医药大学动物实验伦理委员会批准的动物实验方案和指南（审批号：2 0 2 2 0 7 0 5）。2实验方法与结果2.1标准品溶液的制备精密称取RIMPI适量，用乙腈配成浓度为1mgmL的储备液，于-8 0 C保存。取储备液适量，用乙腈稀释成浓度为2 0 gmL的中间储备液，于-8 0保存。取中间储备液适量，用乙腈稀释成浓度为10 0 0 0、8 0 0 0、6 0 0 0、30 0 0、150 0、50 0、50、2 0ngmL的一系列RIMPI标准溶液。精密称取Atr适量，用甲醇配成浓度为0.5mgmL的储备液，于-8 0 C保存。取储备液适量，用50%甲醇水稀释为150 ngmL的内标工作液。2.2质控样品的制备取中间储备液适量，用乙腈稀释成浓度为8000、30 0 0、50、2 0 n g m L的一系列RIMPI工作液。质控血浆样本由高、中、低、定量下限4个浓度的30 L工作液溶液加入57 0 L空白血浆配制，得到高、中、低、定量下限质控血浆样本中RIMPI浓度依次为40 0、150、2.5、1ngmLl。2.3血浆样品处理取血浆样本50 L，加入2 5L内标工作液，混匀；加人10 L2molLNaOH溶液，混匀；再加入600L乙酸乙酯，混匀后萃取5min；于4，140 0 0rpm离心5min，取上清液40 0 L于40 水浴中氮气吹干，以50 L流动相复溶；于4，140 0 0 rpm离心5min，取上清液10 L进行分析。2.4分析条件采用PhenomenexCis(3.050mm，5m)色谱柱，流动相A为10 mmolL乙酸铵含0.1%甲酸，流动相B为乙腈，以0.4mLmin进行等度洗脱（1/9，v/v），分析时间为4min，柱温箱温度为50 C，进样室温度为15。选择ESI离子源在正离子模式下进行多重反应监测模式监测。氮气作为干燥器，雾化气为50 psi，辅助加热气为50 psi，气帘气为2 0 psi，喷撞气选择Medium模式。RIMPI和Atr的碰撞电压分别为39、44eV，去簇电压分别为7 1、7 8 eV，RI M PI 定量离子对为m/z288.0140.1，A t r 定量离子对为m/z290.3124.3。2.5方法学验证2.5.1专属性空白血浆、定量下限、灌胃12.5mgkgAniHBr1h后的大鼠血浆按照“2.3”项下方法处理后进样分析，所得色谱图见图1。空白血浆的响应低于RIMPI定量下限响应的2 0%，并低于内标响应的5%，可认为该方法专属性良好。(A)122.A42,782.8(B)29001201.455.004:2.42.82.6212424281162(C)142010010600200004.041.0m4图1（A）空白血浆；（B）浓度为1ngmL的RIMPI质控血浆样本；（C）大鼠灌胃给药12.5mgkg1h后的血浆样本；1：RIMPI；2：A t r:67PharmacyChinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床2.5.2标准曲线取“2.1”项下制备RIMPI的系列浓度标准工作液，各取30 L，再加人57 0 L空白血浆，配成RIMPI浓度依次为50 0、40 0、30 0、150、75、2 5、2.5、1n g mL 的系列血浆样本。按“2.3”项下处理后进样分析，建立标准曲线。以RIMPI与内标Atr峰面积比值Y为纵坐标，RIMPI浓度X（n g mL）为横坐标，用加权（W=1/x）最小二乘法进行线性回归，得到线性方程。结果显示，RIMPI在150 0 ng:mL内线性关系良好，线性回归方程为Y=0.00645X+0.000773，R=0.9 9 8 3。2.5.3准确度与精密度取“2.2”项下制备的高、中、低、定量下限（40 0、150、2.5、1ngmL）浓度的质控血浆样品各6 份，按“2.3”项下进行处理后进样分析，连续测定3天，计算批内（n=6）和批间（n=3）准确度（RE）与精密度（RSD），结果见表1，均符合要求。表1RIMPI的准确度与精密度(n=6)批内批间质控浓度分析物准确度精密度准确度精密度(ng:mLl)(RE,%)(RSD,%)(RE,%)(RSD,%)1101.87.898.210.92.5107.57.3105.38.3RIMPI15094.32.496.94.140096.13.291.16.12.5.4提取回收率与基质效应取“2.2”项下制备的高、中、低（40 0、150、2.5ngmL）浓度的质控血浆样品各6 份，按照按“2.3”项下进行处理后进样分析，通过比较血浆样品处理后的平均峰面积比值与相同浓度工作液的平均峰面积比值，研究高、中、低质控水平下的回收率。通过比较6 个不同来源的空白血浆样品处理后添加等浓度工作液的平均峰面积比值与相同浓度工作液的平均峰面积比值，研究高、中、低质控水平下的基质效应，内标归一化后基质因子的变异系数应低于15%，结果见表2，均符合要求。表2 RIMPI的提取回收率与基质效应(n=6)回收率基质效应质控浓度分析物回收率RSD基质因子RSD(ngmLl)(%)(%)(%)2.585.02.61.095.4%RIMPI15086.310.90.963.6%40084.38.80.955.8%2.5.5稳定性取“2.2”I项下制备的高、中、低（40 0、150、2.5n g mL）浓度的质控血浆样品各6份，按照“2.3”项下方法处理，分别考察短期稳定性（室温放置12 h）、处理后稳定性（进样室15放置2 4h）、冻融稳定性（一周内反复冻融3次）和长期稳定性（-8 0 下保存一个月）的稳定性，结果见表3，各条件下稳定性良好。表3RIMPI在大鼠血浆中的稳定性（n=6)短期稳定性处理后稳定性冻融稳定性长期稳定性质控浓度分析物准确度精密度准确度精密度准确度精密度准确度精密度(ng:mL)(RE,%)(RSD,%)(RE,%)(RSD,%)(RE,%)(RSD,%)(RE,%)(RSD,%)2.596.813.796.49.0105.59.6104.510.4RIMPI15097.511.596.156.496.110.894.79.940095.88.698.73.6100.55.3108.96.92.6药代动力学研究36只SD大鼠随机分为灌胃（ig）组和尾静脉注射（iv）组，灌胃组随分为低（12.5mgkg）、中（2 5mg.kg）、高（50 mgkg）组，尾静脉注射随机分为低（4mg.kg）、中（8 mg.kg）、高（16 mg k g）组，每组6 只，雌雄各半。于给药前及给药后2、5、15、30、6 0、9 0、12 0、2 40、360、8 40、6 0 0、7 2 0、1440 m i n 从眼眶静脉采血约0.3mL，置于抗凝肝素钠离心管中并在冰上保存。大鼠全血于450 0 rpm，4，离心10 min后，分离血浆，于-8 0 C冻存。测样前，将样品于常温水浴中解冻，按照“2.3”项下方法处理后，进样分析。实验数据采用PhoenixWinNonlin8.3软件处理，计算相应药动学参数。SD大鼠灌胃12.5、2 5和50mgkg氢溴酸山若碱片，以及尾静脉注射4、8、16 m g kg氢溴酸山若碱注射液后RIMPI的平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药动学参数见表:68Pharmacy andChinese Materia Medica2023;14(6)中药与临床表4大鼠灌胃及尾静脉注射不同剂量AniHBr后RIMPI的血浆药代动力学参数(n=6)给药途径剂量(mgkgl)T/v2(min)Cmax(ng:mL)Tmax(min)AUCo(minng:mL)Vd(mL:kgl)CL(Lmin-kgl)ig12.598.647.020.32.835.012.21973.2679.6701303.462767.41961.5554.1ig25230.4102.949.112.370.015.510187.35096.4846265.2463810.22072.61944.2ig50355.3113.9116.438.8115.066.936844.821919.81164960.91038726.22868.91554.1iv4102.698.8115.56.42.00.07441.13937.790592.457304.1781.392728.9iv8123.1 104.2230.048.92.00.09858.55380.6126326.265172.41074.4725.6iv16185.532.3459.836.62.00.017769.69691.5297068.3196720.61245.5817.3注：Tu2：b i o l o g i c a l h a l f l i f e，生物半衰期；Cmax：药物达峰峰浓度；Tmax：药物达峰时间；AUC：a r e a u n d e r t h e c u r v e，药时曲线下面积；Vd：a p p a r e n t v o l u m e o f d i s t r i b u t i o n，表观分布容积；CL：c l e a r a n c e，清除率(A)(B)2007600-12.5mg-kgAniHBr4mg.kgAniHBrF25mg.kglAniHBr8mgkgAniHBr15050mg-kgAniHBr400+16mg-kgAniHBr100200505001000150020000200400600800t/mint/min图2（A）大鼠灌胃12.5、2 5、50 mgkgAniHBr后RIMPI的平均血药浓度-时间曲线：（B）大鼠尾静脉注射4、8、16 mgkgAniHBr后RIMPI的平均血药浓度-时间曲线3讨论药物的安全性是临床用药的第一要素，药物经代谢后产生的代谢产物浓度将随原药的代谢进程而变化。而具有潜在活性的代谢产物有可能是其药效基础，也可能为用药的安全性产生负面影响。因此，本文首次建立了基于LC-MS/MS技术检测具有潜在副作用的RIMPI在大鼠体内的血浆药物浓度的分析方法，为AniHBr的安全用药提供参考。在建立血浆生物样本处理方法之初，我们考虑了蛋白沉淀法和液液萃取法。蛋白沉淀法能够有效去除血浆中的大分子物质，但空白基质中仍有较明显的杂峰干扰待测物的检测，不能满足检测需求。而液液萃取法能够将药物从血浆中提取，且空白基质的干扰较小，可实现良好的专属性。此外，在RIMPI线性为1 50 0 ngmL的范围下，各质控水平的精密度为2.4 10.9%，准确度为9 1.1 10 7.5%，提取回收率在8 4.3 8 6.3%之间，能够满足2 0 2 0 年版中华人民共和国药典生物样品定量分析方法验证指导原则的相关要求从表4可知，灌胃给予大鼠AniHBr后，RIMPI的AUCo-、T i/z 和Tmax随给药剂量增大而呈非成倍数升高，说明其在12.5 50 mgkg的AniHBr剂量下体内可能呈现非线性动力学过程。在尾静脉注射给药后，RIMPI的达峰时间在2 min出现，说明AniHBr入血后可快速转化为RIMPI。而静脉给药后AUCo-t未随着剂量增大而成倍增加，这一结果与灌胃给药后的AUCo-结果相呼应。此外，RIMPI在口服给药后的代谢较静脉更慢，这有可能是因为口服给药AniHBr时所存在的吸收过程导致RIMPI的转化也随之变慢，从而出现口服代谢更缓慢的情况。非线性药代动力学过程对临床用药的安全性有较大影响，因此对于Ani HBr在临床中的使用，应注意观察不良反应。综上所述，本文建立了基于LC-MS/MS技术的RIMPI在大鼠体内的血浆样本分析方法，比较了2 种给药途径和3种给药剂量下RIMPI的药代动力学特征，为Ani HBr临床应用的安全性提供一定的参考。参考文献1陈怀侠，杜鹏，韩凤梅，等.液相色谱-串联质谱法鉴定大鼠血浆中的山若碱及其代谢物.中国药学杂志,2 0 0 6(15):1178.2陈德俊，徐志洲，陈青，等.消旋山若碱片有关物质的研究.药物分析杂志,2 0 16,36(0 1):144.3张碧花，罗丽，张晓东，等。氢溴酸山若碱在脓毒症/脓毒性休克治疗中的研究进展J.实用药物与临床，2022,25(10):934.4田克钧，钟玉婷，钟一鸣，等.冠状动脉内注射阿托品与保护性临时起搏对急性下壁心肌梗死急诊介入时再灌注心律失常的疗效比较研究J.中国全科医学，2 0 19,2 2(2 9)：3544.5 KRANTZ J J,FORREST J W,HEISSE C K.Contribution tothe pharmacology of apoatropine and its methyl bromideJ.Proc Soc Exp Biol Med,1954,86(3):511.6国家药典委员会.中华人民共和国药典-四部M.中国医药科技出版社，2 0 2 0.（责任编辑：何瑶）