罗汉果的果实与其茎叶提取物质量分析及药效学比较研究.pdf

硕士学位论文罗汉果的果实与其茎叶提取物质量分析及药效学比较研究中文摘要罗汉果为葫芦科植物罗汉果（Siraitia grosvenorii Swingle）C.Jeffrey ex Lu et Z.Y.Zhang）的干燥果实，为药食两用传统中药，收 载于历版中国药典一部，具有清热润肺、滑肠通便之功效。由于中药 罗汉果的药用部位为果实，其植物的茎叶通常被废弃.为了充分利用罗汉 果植物资源，本论文对罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学 进行了比较研究，以期为该药用植物茎叶的开发利用提供科学依据。1.采用可见-紫外分光光度法，对罗汉果的果实与其茎叶提取物的主 要化学成分总黄酮含量进行了比较分析研究，建立了可靠性强的含量测定 方法。研究结果表明，罗汉果植物的茎叶提取物总黄酮含量达345.llmg/g,而其果实提取物的总黄酮含量为13.87mg/g,罗汉果茎叶提取物的总黄酮 含量为其果实的20倍以上，从而为该药用植物茎叶开发利用提供了充分 的科学依据。2.采用高效毛细管电泳法，对罗汉果的果实与其茎叶提取物的指纹 图谱进行了比较分析研究，分别建立了两种提取物的规范化指纹图谱。两 者指纹图谱比较分析表明，其指纹峰存在较大差异。罗汉果的果实提取物 指纹图谱标定了 15个共有峰，其茎叶提取物指纹图谱标定了 14个共有峰，两种提取物指认的共有色谱峰仅山奈甘和梅皮素；果实提取物指纹图谱前 半部的色谱峰峰面积较高2号指纹峰，但茎叶提取物指纹图谱则未见此指 纹峰；茎叶提取物指纹图谱中被指认的芦丁指纹峰，果实提取物指纹图谱 中则未呈现。上述结果表明，罗汉果茎叶主要成分为黄酮类成分，且高于 果实提取物。3.采用H型糖尿病大鼠模型（NIDDM）,对罗汉果的果实与其茎叶提 取物进行了药效学比较研究。研究结果表明，罗汉果药用植物的两种提取 物均能不同程度改善n型糖尿病大鼠的空腹血糖、血清胰岛素和脂质性指 标；同时罗汉果茎叶提取物明显改善II型糖尿病大鼠血清胰岛素水平优于 果实提取物的药效作用，具有显著性差异（po.05）。为了探讨罗汉果的 果实与其茎叶提取物对n型糖尿病模型大鼠肝、肾功能的影响，给药30天后检测了实验动物的肝、肾相关指标，发现两种提取物对肝氧化指标、肝转氨酶、肾微量白蛋白及内生肌酊清除率均有一定程度恢复作用，但茎 叶提取物高剂量组动物的肝肾呈现一定程度的肿大现象。本论文通过学科交叉的研究方法，对罗汉果的果实与其茎叶提取物进 行了质量分析和药效学比较研究，其研究结果诠释了该药用植物茎叶药用 部位的药效物质基础，从而为其开发与利用提供了科学依据。关键词：罗汉果；黄酮类成分；质量分析；II型糖尿病大鼠模型 ABSTRACTSiratitiae Fructus is the dry fruit of the cucurbitaceous plant Siraitia grosvenorii(C.Jeffrey ex Lu et Z.Y Zhang).It is the material which can be used as traditional Chinese medicine and food.It has been recorded in the Chinese Pharmacopoeia,stateing that it could help to moist lung for clearing heat as well relieve constipation.Due to the plant is best known for its fruit in Chinese Medicine,the cauline leaves are usually discarded.In order to make full use of this plant resources,this paper is going to compare and analysis on quality and pharmacodynamic of the herbal extracts of cauline lea so as to provide the scientific evidence for the development and utilization of the cauline leaf of this traditional Chinese herb.1.By using the visible-ultraviolet spectrophotometry,this paper comparative analysis the main effective ingredients,total flavone in the extracts both its cauline leaf and fruit,and establishes the reliability of the content determination method.The results indicate that the content of the cauline leaf extract is 345.11 mg/g of flavonoids,but the fruit extract only 13.87mg/g,the flavonoids in cauline leaf extracts is 20 times more than in the fruit extracts.Therefore,this study provides the significant scientific evidence for development and utilization of its cauline leaf2.By using high performance capillary electrophoresis method 9this paper researches the fingerprints and build the standardization fingerprint of two extracts.Comparative analysis of two fingerprints showed different.The fruit extract has 15 fingerprints common peaks,but the cauline leaf extracts inhas 14 fingerprints common peaks,there are only two common chromatographic peaks which are kaempferitrin and quercetin.In the first of the fiuit extract of the fingerprint has a higher area of chromatographic peak which is number 2 fingerprint peak,but it is not present in the cauline leaf extracts of the fingerprint.The cauline leaf extracts has a fingerprint peak which is rutin,but there is not preasent in the fruit extract of the fingerprint.The result indicated that the main components of the cauline leaf extract of Momordica grosvenori are flavonoids,and it is higher than the fruit extract.3.By useing the type II diabetes rat model(NIDDM)to research the extract of the fruit and cauline leaf of Momordica grosvenori.The results show that both two extracts can improved FBQ serum insulin and lipid of NIDDM rats in different level;however the cauline leaf extract can obviously improve the rat serum insulin levels compare to the fruit extract(P 10000 mg/kg,属实际无毒级；Ames试验致突变结果为阴性；罗汉 果皂菩提取物3.0 g/kg（250倍人用量）连续4周对家犬灌胃，短期毒性 试验结果显示其血液指标、血糖与尿糖、肝肾功能以及各组织器官的病理 学均无明显的变化.1.1.5 开发应用，目前，罗汉果广泛应用于保健品、食品、医药、日化消费品等工业中.民间传统的罗汉果泡茶和市场上的罗汉果川贝枇杷膏、罗汉果咽喉片等多 用于镇咳祛痰，还有罗汉果果实的皂甘类成分具有热量低和甜度高的特 点，多用于食品或饮料中做甜味剂.近年来，也不少厂家利用罗汉果降糖 降血脂的功效用于糖尿病的辅助治疗及女性的减肥产品中.1.2罗汉果茎叶的研究概况7湖北中医药大学2012届硕士学位论文1.2.1罗汉果茎叶化学成分诸多文献报道，罗汉果茎叶的化学成分主要有黄酮类成分。L 2.1.1罗汉果茎叶黄酮类成分近年来，有关罗汉果叶黄酮类化学成分的研究逐渐增多.陈全斌等 人测定了罗汉果叶中总黄酮含量并分离得到山奈酚-3,7-0-a-L-二鼠李 糖甘（山奈昔）和榭皮素-3-0-B-D-葡萄糖-7T）-a-L鼠李糖昔（芦丁）两个黄酮苔。本实验室前期研究人员又从罗汉果茎叶中分离得到山奈酚-3-0-L-鼠李糖苔、山奈酚-7-0-L-鼠李糖昔、梅皮素-7T）-L-鼠李糖菩等三种黄山奈酚-3-0-L一鼠李糖昔山奈酚-7-0-L一鼠李糖昔榭皮素-7TbL-鼠李糖普1.2.1.1罗汉果茎叶其他成分喻彬等8人从罗汉果叶中分离得到齐墩果烯型三菇衍生物（棕桐酸P8罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比较研究一香树酯）、笛体皂甘类化合物（0-胡萝卜甘）、三菇类型衍生物（B-香 树脂醇）、较酸类化合物（正二十四烷酸）。6-胡萝卜普（笛体皂昔类）1.2.2 罗汉果茎叶黄酮提取工艺研究本实验室前期研究人员，通过采用正交试验法对罗汉果茎叶的乙醇 回流提取工艺及其大孔树脂纯化工艺进行了优化，适于大规模生产加工。1.2.3罗汉果茎叶药理研究文献报道其总黄铜具有抗氧化的m（其抗氧化活性优于人工抗氧化剂 BHTX防踽抗菌例活血化瘀切等作用，周英等人还发现罗汉果茎叶 总黄酮提取物对RIN-5大鼠胰岛素细胞有促进胰岛素分泌的作用。1-2.4罗汉果毒理实验陈全斌等.以罗汉果黄酮提取物最大浓度和最大体积给小鼠灌胃，结 果显示未见任何毒副反应，所有动物均健康正常生长，最大灌胃药量是 60.85g/kgo急性毒性试验说明罗汉果黄酮的毒性很小。2.U型糖尿病的概述2.1 n型糖尿病糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是由不同病因与发病机制相互作 用而导致的临床综合症，主要表现为糖代谢异常，继而引发脂肪.蛋白 质代谢异常的慢性异质性内分泌代谢疾病。目前有关病因尚不清楚，已 知的因素是：遗传因素、环境因素、病毒感染、自身免疫等.现代医学 9湖北中医药大学2012届硕士学位论文将糖尿病卬分为：胰岛素依赖型IDDM、非胰岛素依赖型NIDDM和其它特 异性糖尿病。NIDDM特点是人体自身能够产生胰岛素，但有胰岛素抵 抗、胰岛素分泌缺陷问题。其病因主要是受遗传和环境因素影响，但 NIDDM受遗传影响更多，其机制也更复杂。NIDDM普遍存在胰岛素抵抗，它是指靶组织细胞对胰岛素生物效应 的敏感性下降出现一系列临床表现，常常伴有高胰岛素血症。它是糖尿 病、高血压病、高血脂症等多种疾病共同的发病基础，常有发生于 同一患者的倾向，故又称为胰岛素抵抗综合征。同时它也是n型搪 尿病和糖耐量降低的主要致病机制，并贯穿于II型糖尿病全过程。许多研究发现肥胖者有明显的高胰岛素血症，容易产生胰岛素抵抗。本 来肥胖也是NIDDM易患因素，许多NIDDM患者都伴有肥胖。多数早期患 者尽管存在胰岛素抵抗，但胰岛。细胞处于代偿期，胰岛素的合成和分 泌均增加可以克服肝脏和肌肉组织的胰岛素抵抗。但随着病情发展，尤其出现胰岛B细胞障碍，胰岛素分说减少后，逐渐出现进餐后高血糖 直至空腹高血糖的出现。持续的空腹高血糖进一步刺激形成高胰岛素血 症，进而可造成B细胞功能恶化，不能正常分泌足够的胰岛素，故出现 临床血清胰岛素低于正常，发展为糖尿病。此外，大量研究表明氧化应 激与NIDDM的发生发展也密切相关2.2 NIDDM的动物模型NIDDM动物模型的种类大体可分类：自发型、转基因动物模型和实 验型。2.2.1自发型NIDDM动物模型自发性NIDDM动物模型是动物自身产生的疾病或经遗传育种饲养的 疾病动物。目前常用的有以下几种：KK小鼠、KK-A”鼠、ob/ob小鼠、db/db 小鼠、NSY小鼠、Zucker fa/fa大鼠、黑线仓鼠等。2.2.2转基因NIDDM动物模型皿切该技术是本世纪80年代初发展起来，主要是将胰岛素信号转导通 路中的某个基因敲除得到理想的NIDDM动物模型。目前较为常用的动物 10罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比校研究模型主要有以下几种：GK/IRS-1双基因剔除小鼠、IR7IRS-1-双基因 剔除杂合体小鼠。2.2.3实验型NIDDM动物模型刈该动物模型是指利用物理、化学及生物等致病因素，人工诱发出类 似人类NIDDM特征的动物模型。其复制手段主要有：注射致高血糖因子；手术切除部分胰腺；注射根皮昔影响肾小管对糖的重吸收；注射化学试 剂四氧嚅唠Alloxan,或链眼佐菌素STZ破坏其胰岛B细胞。Alloxan糖尿病动物模型是通过Alloxan产生有细胞毒性氧自由基 破坏胰腺B细胞导致的，易造成肝肾等组织出现中毒性损坏，部分模型 两个月后容易出现自身缓解。而且其制备受许多因素的影响容易造成动 物死亡率、转阴率高，影响模型的成功率和实验结果的可靠性.目前较 为常用的是膳食诱导辅以STZ注射。STZ对某些动物的胰岛B细胞选择 性的破坏以致胰岛素分泌降低，但造成的高血糖和酮症反应均较缓和，其对肝肾组织损坏较小.先以高脂肪饲料喂养一段时间，引起外周组织 对胰岛素的敏感性降低，再配合适量STZ破坏部分胰岛。细胞功能共同 作用诱导出接近人类的II型糖尿病的动物模型.此模型是U型糖尿病药 物研究的理想动物模型，其特点是：中度高血糖、高血压、高血脂和胰 岛素敏感性下降。2.3用于治疗NIDDM的药物目前常用的治疗药物可分为化学药物和天然药物两大类。2.3.1化学药物主要分为三类：促进胰岛素分泌的药物（磺麻类、非磺胭类）、胰岛素 增敏药物（嘎嘎烷二酮类）和影响糖吸收的药物（双胭类、a-葡萄糖甘酶抑 制剂）。2.3.2天然药物临床上目前仍以合成的化学药物为主，但均存在不良反应，因而近年 来研究植物中的天然降血糖物质比较热门.天然药物的优点是毒副作用 小、来源丰富、作用温和持久、具有综合治疗作用、可延缓并发症等.中湖北中医药大学2012届硕士学位论文医药应用糖尿病有丰富的历史经验，特别是对于糖尿病引起的血管、神经 病变。目前向发现的中药降糖成分主要有皂苔、黄酮、菇类、生物碱、多 糖、多肽和氨基酸等，其中黄酮是很多中草药的有效成份具有较高的的研 究价值。研究发现黄酮类治疗NIDDM的主要机制可能是抗氧化、胰岛素样作用 和抑制a-糖甘酶。梅皮素吠如具有抗氧化性对实验性糖尿病大鼠肾脏的 过氧化脂质及晚期糖基化终末产物均有明显抻制作用，改善肾小球基底膜 和基质增生，提高血清胰岛素的释放水平并清除自由基、降低胆固醇保护 大鼠心肌。水飞蓟素对STZ诱导的糖尿病大鼠有显著抑制脂质过氧化、肾脏组织非酶糖基化作用。桑叶总黄酮可促进外周细胞摄取葡萄糖单 糖。高浓度毛地黄黄酮冈可降低。一糖甘酶的活性。苦骨异黄酮的可明显 抻制a-葡萄糖甘酶类活性，如蔗糖酶和麦芽糖酶。2.4 NIDDM的并发症糖尿病的慢性并发症主要发生在人体的足、眼、肾、心脏、脑等部 位.传统治疗主要是控制血糖、血压，其并发症很少得到关注。这些 并发症的病因实际是对应器官的血管粥样硬化病变，主要分为微血管 和中血管.常见的并发症有：糖尿病酮症酸中毒、非酮症性高渗性昏迷，糖尿病性下肢坏疽、肾病、视网膜病变、神经病变以及糖尿病引起的多种 感染。糖尿病微血管病变有两个主要的发病机制：（1）葡萄糖毒性产物的形 成：氧化应激增加、多元醇通路活跃、糖基化终产物形成及己糖通路活跃.糖毒性产物对细胞信号通路的影响包括蛋白激酶C通路、丝裂原激活蛋 白激酶通路、炎症信号级联通路激活等多种信号通路异常。糖尿病肾病 的临床特征为蛋白尿，晚期出现严重肾功能衰竭。早期多无明显症状，血压略微偏高，出现尿微量白蛋白排出量200口 g/min.临床糖尿病 肾病临床主要有如下表现：蛋白尿，其严重程度多呈进行性发展，直至出现肾病综合征。浮肿。高血压，常见.肾功能不全，糖 尿病性肾病一旦开始，其过程是进行性的，氮质血症.尿毒症是其最罗汉果的果实与其茎叶提取物的质土分析及药效学比较研究终结局,贫血，用铁剂治疗无效,视网膜病变常，与糖尿病肾病并 存.13湖北中医药大学2012届硕士学位论文第二章 罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析比较研究罗汉果的果实作为传统中药应用历史悠久，但其茎叶部位通常被废 弃。为进一步开发利用罗汉果茎叶资源，本实验室前期采用一系列分离纯 化工艺得到罗汉果茎叶提取物，确定了黄酮类化合物为其主要化学成分。本章结合前期研究结果，对罗汉果果实和茎叶提取物进行了质量分析研 究。第一节罗汉果的果实与其茎叶提取物总黄酮的含量分析比较总黄酮是罗汉果茎叶提取物的主要化学成分，且含量高达30%40%。本节研究采用紫外一可见分光光度法（UV）,对果实和茎叶提取物总黄酮的 含量进行了研究，建立了简单、快捷.准确可靠的提取物总黄酮含量测定 方法。1仪器与材料1.1仪器Shimadzu UV-2401紫外可见分光光度计（日本岛津公司），Metter Toledo AL204万分之一分析天平（德国），Sartorius BP211D十万分之一 分析天平，KQ3200DE型超声清洗仪（昆山市超声仪器有限公司），HH-S 型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司），SZ-93A双蒸水发生器.1.2 试剂山奈昔对照品（浙江大学智能信息研究所，纯度在98%以上），甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙醇（分析纯），三氯化铝（分 析纯），聚酰胺（试剂级），水（重蒸谯水）。1.3 药材罗汉果果实和茎叶标准提取物样品由湖北汇特生物有限公司提供（采 用实验室前期茎叶标准提取物的提取纯化工艺提取）,其植株采自广西龙 胜县和平乡，经湖北中医药大学生药教研室吴和珍教授鉴定为葫芦科植物 罗汉果（Siraitiagrosvenori Swingle C.Jefery ex Lu et Z.Y.Zhang）,罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比核研究2实验方法2.1.对照品溶液的制备精密称取减压干燥至恒重的山奈甘对照品适量5.00mg,置于251nl的 容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（0.2mg/ml）.2.2 供试品溶液的制备精密称取罗汉果果实提取物200mg.茎叶提取物10mg,分别移至10ml 容量瓶中，加入50%甲醇溶液8ml,超声处理20min,取出冷却，分别加 50%甲醇稀释至刻度（果实提取物制成20mg/ml的溶液，茎叶提取物制成 lmg/ml溶液）。滤过，取续滤液各5ml,加适量聚酰胺（过60目筛）拌匀，挥干溶剂.将样品加到装有聚酰胺（10g）的色谱柱（内径l.5cm）上端，流速水洗lOOmin,继60%乙醇洗脱80min,收集醇洗脱液,蒸 干，残渣加甲醇定容至5mL 作为供试品溶液。2.3 显色条件与测定波长精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1.0 ml,分别置于10ml试管，加入0.lmol/L A1CL溶液2.0 mL,继加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，放 置20 min,随行试剂作为空白对照，在200 700nm之间进行扫描，结果 见图 211%图 2-1-2.图2TT果实和茎叶供试品紫外吸收图谱15湖北中医药大学2012届硕士学位论文实验结果表明，供试品与对照品溶液在393nm处均有最大吸收，故选 择393nm为测定波长。2.4标准曲线与线性范围分别精密吸取对照品溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5ml置于101nl容 量瓶中，加入0.lmol/L的AlCh溶液2ml,加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20min,随行试剂做空白，于393nm处测定吸光度，以对照品溶液浓 度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算回归方程为Y=19.747 X(r=0.9999)n=5,结果表明山奈甘在0.01-0.05mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性 关系.标准曲线测定结果见图2-1-3。3实验结果3.1方法学考察X 1.1精密度试验16罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比较研究精密吸取对照品溶液1 mL,按2.3项下方法测定吸光度6次，计算 其吸光度值RSD为0.129%,结果见表2-1-1。结果表明仪器精密度良好。表2T-1 精密度试验结果（产6）实验次数123456吸光度A0.4010.4000.4000.4000.4010.400RSD(%)0.1293.1.2稳定性试验取同一样品罗汉果茎叶提取物供试品溶液适量，分别放置0、1、2、4、6、8小时，按23项下方法测定吸收度，计算其吸光度值RSD为0.633%,结果见表2-1-2。结果表明供试品溶液在8小时内较稳定。3.1.3重现性试验表2T-2稳定性试验结果（n=6）放置时间（h）012468吸光度ARSD(%)0.3530.3540.3540.6330.3570.3580.358精密称取同一批号的罗汉果茎叶提取物6份，按22项下的方法制备 成供试品溶液，按2.3项下方法测定吸光度，计算其含量RSD为2.81%,结果见表2-1-3。结果表明本方法重现性良好。表2-1-3 重现性试验结果（门=6）供试品号012468含量(mg/g)RSD(%)359.55347.39353.472.81372.71356.51371.703.2 加样回收率试验精密称取同一批已知总黄酮含量的罗汉果茎叶提取物粉末6份，每份 5 mg,分别准确加入L 5mg的山奈普对照品，按2.2项下方法制成供试品 溶液，按2.3项下方法测定吸光度，计算总黄酮含量和回收率。其平均回17湖北中医药大学2012届硕士学位论文收率为97.3%,RSD为2.33%(n=6),结果见表2-1-4.结果表明本方法稳 定可行。表2-1-4加样回收率试验结果(n=6)样品量(mg)样品含量(mg)加入量(mg)实测量(mg)回收率(%)平均值(%)RSD(%)5.111.761.503.1995.05.001.731.503.1997.75.031.721.503.2098.797.32.335.011.751.503.1996.35.021.701.503.1395.15.011.711.503.22100.83.3 样品测定取罗汉果果实提取物和茎叶提取物各3份，精密称定，按2.2项下方 法制成供试品溶液，分别精密吸取1.0ml于10ml试管中，加入0.Imol/L A1CL溶液2.0 mL,再分别加入50%甲醇稀释至刻度，摇匀，放置20min,在紫外分光光度仪上，以吸收波长393nm测定样品溶液的吸光度，计算其 各自的含量，结果见表2-1-5。表2-5 三批样品总黄酮含量测定结果(n=3)果实样品批号平均含量mg/g茎叶样品批号平均含量mg/g10070115.1610052345.8110080714.2210053337.9210090812.2310055351.50总平均13.87总平均345.114 讨论4.1 本论文以山奈哲为对照品，采用紫外分光光度法测定了罗汉果的果 实和茎叶提取物中总黄酮的含量，其方法操作简便，重现性良好，方法可 靠性强。结果表明，罗汉果果实与茎叶提取物的总黄函含量分别为13.87罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比较研究mg/g和345.11 mg/g,其茎叶提取物总黄酮含量为其果实提取物的25倍 左右，从而为罗汉果茎叶的开发利用提供了实验依据。4.2 在供试品制备的过程中，分别采用了乙酸乙酯、水饱和正丁醇从罗 汉果果实提取物中萃取黄酮类成分，显色后测定结果表明果实提取物与对 照品山奈普的最大吸收峰难以重叠，据推测是因果实提取物中黄酮成分含 量较少，容易受其它成分干扰；采用聚酰胺色谱柱分离方法，显色后测定,果实提取物与对照品山奈普最大吸收基本一致，从而保证了罗汉果果实提 取物与茎叶提取物含量测定的相对准确性。见图2-1-4。水饱和正I醇数次萃取后；聚酰胺柱分离后乙酸乙酯数次萃取后；对照品图2-1-4 果实不同制备方法UV图50004.3 在对照品的选择时，依次采用过芦丁、榭皮素，选择显色系统为 NaN02-Al(NO3)3-Na0Ho在此条件下，选择芦丁做对照品时，在510 nm 处罗汉果果实样品溶液与对照品的最大吸收峰不重叠；选择榭皮素做对照 品时，罗汉果果实和茎叶样品溶液与对照品最大吸收基本一致，但是后面 方法学考察时其重现性和稳定性不好。由于本实验室前期研究罗汉果茎叶 提取工艺时，采用的是山奈甘作为对照品测定总黄酮的含量，故选用山奈 甘作为对照品，三氯化铝溶液作为显色剂，结果发现果实、茎叶样品溶液 与对照品溶液在393 nm处均有最大吸收峰，因此对照品选用的是山奈甘，显色剂是三氯化铝溶液。19湖北中医药大学2012届硕士学位论文第二节 罗汉果的果实与其茎叶提取物总黄酮的HPCE指纹图谱分析比较本论文采用HPCE法，对罗汉果的果实与茎叶标准提取物的指纹图谱 进行比较研究，以期进一步评价两种提取物所含化学成分的差异，同时可 作为两种提取物的质量评价依据。1仪器与材料1.1仪器Beckman P/A system 5000型高效毛细管电泳仪（美国Beckman公司）：配二极管阵列检测器（DAD）,未涂层熔融石英毛细管（有效长度45 cm,75 nmx 57 cm,河北永年锐泮色谱器件有限公司）。METTLER TOLEDO AL204 万分之一分析天平，KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有 限公司），828型奥立龙pH计。1.2材料硼砂、硼酸、乙脑、氢氧化钠均为分析纯，十二烷基硫酸钠（SDS）,水为双蒸水.各10批罗汉果果实和茎叶标准提取物样品由湖北汇特生物有限公司 提供（采用实验室前期茎叶标准提取物的提取纯化工艺提取），其果实和 茎叶采自广西龙胜县和平乡，经湖北中医药大学生药教研室吴和珍教授鉴 定为葫芦科植物罗汉果的果实和茎叶。2实验方法2.1 供试品溶液的制备分别精密称取罗汉果果实和茎叶提取物各200 mg.50 mg,至10 ml 容量瓶中，加入甲醇溶液超声处理20 min,冷却，分别加甲醇稀释至刻度，经0.22 pm滤膜过滤，作为供试品溶液（果实提取物制成20mg/ml的溶液，茎叶提取物制成5 mg/ml溶液）.2.2 对照品溶液的制备精密称取山奈昔、梅皮素、芦丁对照品适量，用甲醇溶解制成每毫升20罗汉果的果实与其茎叶提取物的质式分析及药效学比较研究含0.15毫克的对照品溶液。2.3 电泳条件运行缓冲液 40 mmol/L 硼砂-80 mmol/L 硼酸-40 mmol/L SDS-15%乙脑，PH 10.50,运行分离电压为20 kV,检测波长为340 nm,压力进样 0.5 psi,进样时间为5 s,柱温25P。毛细管冲洗方法：新装毛细管在使用前依次用1 mol/L氢氧化钠冲 洗5 min,水冲洗5 min,以清除毛细管柱中的表面杂质并活化毛细管。开机后用lmol/L氢氧化钠溶液冲洗2 min,水冲洗5 min;每次进样前依 次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液冲洗5 min,水冲洗5 min,0.lmol/L盐酸 溶液冲洗5 min,水冲洗5min,缓冲液冲洗5 min(平衡毛细管柱)。所 有溶液使用前均用0.22 pm滤膜过滤。2.4 测定方法按照2.3项下电泳条件进行分析，考察60 min内供试品溶液的色谱 分离情况，记录40 min色谱图.3实验结果3.1 方法学考察3.1.1 精密度试验称取罗汉果果实提取物，按供试品溶液的制备方法制备，按2.3项下 电泳条件连续进样5次，分别记录指纹图谱，考察色谱峰保留时间和峰面 积的一致性。以山奈苔14号峰为参照峰，计算各主要色谱峰相对保留时 间(RRT)的RSD值均小于3.0%,其相对峰面积(RPA)的RSD值均小于 5.0%,表明仪器的精密度良好，符合相关指纹图谱的技术要求，结果见 表 2-2-1、表 2-2-2.3.1.2 重复性试验称取罗汉果果实提取物，按供试品溶液的制备方法分别平行制备5 份，在23项下电泳条件于1、2、3、4、5h连续进样5次。以山奈昔14 号峰为参照峰，计算其相对保留时间(RRT)的RSD值分别小于4.0%,相 对峰面积(RPA)的RSD值分别小于4.0%,符合相关指纹图谱的技术要21湖北中医药大学2012届硕士学位论文求,结果见表2-2-3、表2-2-4。3.1.2稳定性试验由于样品每次测定需要运行60 min,稳定性可以和精密度同时考察,故样品稳定性考察见表2-2-1、2-2-2,表明供试品溶液至少在5h内稳定,罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比校研究表2-2-1精密度与稳定性试验结果（相对保留时间）峰号 12 345RSD(%)1 0.37970.3877 0.36890.39640.37312.91102 0.41250.3958 0.38510.40250.40082.50603 0.48370.4785 0.47520.49540.46122.60524 0.54440.5458 0.53580.52380.54461.73085 0.60080.5863 0.59460.58340.61452.08936 0.62130.6004 0.60250.61380.64382.84597 0.64990.6159 0.63450.64670.62892.17158 0.66680.6458 0.68350.67190.63592.94969 0.68880.6485 0.69970.68750.67672.870110 0.71230.7059 0.70150.69230.68461.570511 0.72680.7167 0.70640.70230.69551.738412 0.74210.7356 0.72890.73560.76511.890213 0.95010.9458 0.97130.97560.96241.347714 11 111015 1.08481.1084 1.10071.09451.05671.8391表2-2-2精密度与稳定性试验结果（相对峰面积）峰号 12 345RSD(%)1 0.38930.3886 0.39970.38640.37991.83722 3.45233.4495 3.23363.34963.25163.11763 0.47160.4588 0.44370.45340.46752.42734 1.7151.7537 1.69621.79861.71452.36135 1.14481.0812 1.15461.09771.19864.13356 0.45640.4391 0.43520.43370.44212.05347 0.17180.1809 0.16960.17590.17362.48238 0.21140.2056 0.20980.21640.20372.38919 1.58621.5647 1.48261.61181.57463.118710 0.15090.1438 0.15190.14770.14562.319111 0.16860.1653 0.16460.16010.16731.969812 0.35550.3543 0.34560.37250.35232.798913 0.18150.1758 0.17590.18860.17353.402714 11 111015 0.25320.2456 0.22550.23710.23794.315423湖北中医药大学2012届硕士学位论文表2-2-3 重复性试验结果（相对保留时间）峰号 12 345RSD(%)1 0.38610.3796 0.37520.39640.38492.07612 0.40050.3986 0.37960.39520.38532.29893 0.47580.4869 0.48340.47510.49511.71794 0.54820.5482 0.57650.54860.55932.21585 0.60450.5946 0.58370.59450.60081.32756 0.63040.6157、0.62210.61170.63751.69297 0.63770.6288 0.64560.64860.64561.25608 0.65680.6675 0.67560.65980.65891.17179 0.67880.6925 0.69230.66450.66582.008410 0.70880.7048 0.71470.69450.69581.220911 0.71780.7255 0.72280.70230.70331.525412 0.73490.7375 0.78240.75740.77812.915313 0.96420.9675 0.99450.97340.97851.219314 11 111015 1.04561.0752 1.0451.1041.04472.4854表2-2-4 重复性试验结果（相对峰面积）峰号 12 345RSD(%)1 0.39930.3805 0.38850.39120.39541.83012 3.41463.4282 3.30613.36413.58523.04903 0.41020.4387 0.43430.42850.43542.64484 1.76531.7065 1.84681.74361.78452.94465 1.10251.0238 1.13891.09991.11233.91976 0.45380.4268 0.443590.43380.43192.45167 0.17980.1775 0.16830.17490.17372.48908 0.21870.2198 0.21930.21140.20732.61749 1.5071.5897 1.51661.59881.59462.911910 0.14890.1483 0.14960.14260.15282.491011 0.16840.1702 0.17340.16840.16232.398212 0.34890.3247 0.3250.33580.32813.068113 0.17830.1804 0.17260.16820.17922.942314 11 111015 0.24580.252 0.23490.25540.24093.3635罗汉果的果实与其茎叶提取物的质量分析及药效学比较研究3.2指纹图谱及技术参数3.2.1指纹图谱的建立根据10批罗汉果果实和茎叶供试品溶液HPCE图提供的相关参数，分 别建立