感染性疾病血清学标志物检验质量保证.pdf

感染性疾病血清学标志物检验质量保证 感染性疾病血清学标志物 :.工 一 肝炎病毒标志物：HBsAg、抗HCV等 抗 HIV 梅毒抗体 其它抗原、抗体检验方法1 .,-ELISA 应用酶标原理的自动化分析仪 应用其它标记物的自动化分析仪 RIA影响ELISA测定的因素 试剂盒的因素 实验操作影响ELISA试剂盒质量的因素固相材料:聚苯乙烯塑料抗原：纯化、合成和基因工程抗原 抗体：多抗、单抗和基因工程抗体 酶结合物：酶免疫测定的核心成份 色原底物：OPD和TMB 运输贮存酶免疫测定操作中的注意事项标本的收集、运送和保存 试剂准备结果判断结果报告及解释可能影响测定结果的标本因素内源性干扰因素：类风湿因子、补体、异 嗜性抗体、治疗性抗体、自身抗体、溶菌 酶、磷脂、药物小分子、总蛋白浓度等外源性干扰因素：溶血、细菌污染、标本 贮存时间过长、凝固不全、反复冻融加样*.j:4 ;.a 加样不可太快，避免加在孔壁上部，不可溅出和 产生气泡。从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴 加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴 加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非 包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。全自动加样系统的标本“交叉污染”问题温育 常采用的温育温度有43。、37C、室温和4C等。温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时 间相对较短。温育时，微孔板应置于水浴（浮于水面）或湿盒中，以使反应溶液的温度迅速与室温平衡。“边缘效应”的排除：使用水浴或在将反应溶液加入至板 孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37。），就可 以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。洗板 每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有 很大关系。洗板液一般为含0.05%Tween20的中性PBS。Tween20为一种非离子去垢剂，既含亲水基团，也含疏水基团。洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的 疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸 附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作 用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相 洗板液中Tween20浓度高于0.2%,可使包被于固 相上的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限一比色 加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀 测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适 比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定,所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色 具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测得 的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所 致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得 的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。ELISA测定的主要问题0 J。a HOOK EFFECT结果的判断一步法的“HOOK EFFECT”产生的原因图l.二步法ELI SA抗原浓度与显色变化的反应曲线Ab+Ag.AbAg（b复合物）（1）Ab Ag+Ab*T Ab Age Ab*（a复合物j（2）一步法的“HOOK EFFECT”产生的原因抗原图2,一步法ELISA抗原浓度与显色变化的反应曲线Ab+Ag+Ab*-Ab Ag Ab*+Ab Ag+Ag Ab*+Ab*Ag Ab*定性免疫测定的CUT-OFF0.08 0.11酶免疫测定出现假阳性的原因操作及仪器因素：加样、洗板、自动化加 样系统的标本间“交叉污染”标本因素：RF、补体、异嗜性抗体、动物 抗体、动物抗体、高浓度电、溶血、细菌污 染、标本贮存时间过长、标本凝固不全酶免疫测定出现假阴性的原因,K-操作、试剂及仪器因素：标本未加、试剂过期或变质、仪器针孔堵塞、标本“交叉污染”标本因素：补体、自身抗体、反复冻融临床免疫检验的室内质控问题 临床免疫检验室内质控不太受重视的原因有三:一方面可能是质控品来源有限或价格因素；其次 是南没有意识到；再有就是本加从何做起。-使用统一合格的校准品开展室内质控才是解决各实验室结果可比性差同时也是保证检验质量的唯 一有效由途径。-室内质控的内涵并不仅仅是使用质控物进行统计 学质控，它包括分析前、分析中和分析后的质量 控制三个方面。免疫检验室内质控既有与临床生化室内质控共性,也有其特性的地方室内质量控制(IQC)IQC主要包括三个方面:(1)测定前的质量控制;(2)统计学质量控制；(3)质量控制的评价。统计学质量控制 理想的室内质控样本的条件 质控物浓度的选择,测定中质控样本的设置、数量及排列顺序 统计学质控的特点 统计质控方法统计质控方法Q 9二 基线测定 质控规则的表达方式及定义 Levey-Jennings质控图方法 Levey-Jennings 质控图结合 Westgard 多规 则质控方法 累积和（CUSUM）质控方法“即刻法”质控方法Levey-Jennings 质控 图+3SD+2SD+1SD-1SD-2SD-3SD测正轨次）0 1 2 3：4 56 7,8 9 10 11 12 13Levey-Jennings质控图 基本的统计学含义 稳定条件下，在20个IQC结果中不应有多于 1个结果超过2SD（95.5%可信限）限度；在 1000个测定结果中超过3SD（99.7%可信限）的结果不多于3个。如以 3s为失控限，假失控的概率为0.3%。“即刻法”质控方法“即刻法”质控方法的实质是一 种统计学方法，即Grubs异常值 取舍法；只要有3个以上的数据即可决定 是否有异常值的存在。统计学质控的有关问题.，V，_.质控图的问题:如何作图？多块板的质控作 图?质控图的不同批试剂间的连续性？“即刻法”的适用性问题？“假阳性”的质控问题?IQC的局限性 在免疫测定中IQC可能测不出的误差 测定前 测定中 测定后样本鉴定不对 样本吸取不对 结果记录错误样本贮存中变质 试剂加入不对 此类误差的发生率在不同的实验室有所不同,般要求小于0.1%,且应均衡地分布于测定前、测定中和测定后的不同阶段。室间质量评价（EQA）EQA Proficiency testing(PT)乙肝标志物检测的问题J A.4:.乙肝“两对半”抗HBc IgM乙肝“两对半”乙肝表面抗原（HBsAg）乙肝表面抗体（抗HBs）乙肝e抗原（HBeAg）乙肝e抗体（抗HBe）乙肝核心抗体（抗HBc）HBsAg测定中可能存在的问题在HBsAg的测定中，最大的问题是假阴性问题：(1)HBsAg含量低于所用方法的测定下限之下。如感染的“窗口期”、急性期后或恢复期、自限 性感染末期的携带者等。(2)编码HBsAg的HBVS基因的突变。(3)HCV/HDV重叠感染对HBV复制和/或H BsAg的表达的抑制作用。(4)测定方法所用抗体对HBV不同基因型检测 敏感性的不同。(5)HOOK EFFECT编码HBsAg的HBV S基因的突变 对检测的影响 HBV容易发生突变，较其他DNA病毒的突 变率要高10倍 突变主要集中在核心启动子、前核心区和 编码病毒包膜蛋白的a决定簇的基因区域。目前的商品试剂盒对HBsAg突变株的测定能力可归为三类：突变HBsAg和野生型均可检出。不能检出突变HBsAg。与野生型抗原相比，突变HBsAg的检出能 力明显降低。使用酶标多克隆抗体的商品试剂，大多数 可归为第一和第三类。HBV S基因变异所致HBsAg假阴 性的最大的问题 输血安全性。尤其是逃逸突变株流行较广 的地区，在HBV高流行区域，突变株的流 行率也高 导致疫苗免疫的失败。要在进行人群HBV 分子流行病学的基础上,考虑研制针对主 要流行HBsAg变异株的乙肝疫苗，保证免 疫的有效性。HBsAg的变异所致的不常见的HBV标 志物模式或不一致的结果 单独抗HBc阳性。HBsAg阴性但HBeAg阳性。血清HBsAg阴性但抗HBc和抗HBs阳性。HBsAg(HBeAg)和抗HBs(大多为 v100IU/ml的低滴度)同时存在。使用不同厂家的HBsAg试剂盒得到的不一 致结果。HBV不同基因型对检测敏感性的影响 HBV基因型依其全基因组大于8%的变化而 分为八型，命名为A到H。基因型A主要存 在于白人，而基因B和C主要在亚洲人群。以单抗为基础建立的HBsAg免疫测定方法,当用于生产单抗的病毒株与流行人群的亚 型/基因型或变异株不同时，可能得不到可 靠的结果总抗HBc机体对HBV抗原的免疫应答最早出现的是对HBcAg的 细胞免疫应答，随后是体液免疫应答产生抗HBc,总 抗HBc包括抗HBcIgM、IgA、IgG和IgE等。抗HBc不是保护性抗体。抗HBc在血中呈低滴度且与抗HBs同时存在，是既往感染的标志。在HBV高流行人群中，抗HBc常作为疫苗免疫前的筛检方法。在欧洲和美国，抗HBc还是血液筛查的一个指标。在我 国，抗HBc没有作为血液筛查指标，其主要原因是抗 HBc检测的假阳性导致血液废弃过多。抗HBc测定存在的最大问题假阳性单项抗HBc阳性结果的解释抗HBc测定假阳性的主要原因 血清（浆）中存在交叉反应性抗体或干扰 性物质 一个主要原因：前母B淋巴细胞的非特异激 活，导致未感染HBV的IgA或IgM相关分子 的产生抗HBc检测特异性的改善 使用还原剂如二硫苏糖醇(dithiothreitol)、重亚 硫酸钾(potassium bisulfite)和半胱氨酸等预 处理血清标本 具有标本预处理的抗HBc试验的特异性在99.8%至99.9%之间。在竞争性抗HBc免疫测定中，只有抑制值大于或 等于90%者可考虑为真正的阳性单项抗HBc真阳性_-r*.4-T.r-】J 4 常为HBVDNA阳性 常见于吸毒者、HIV感染者和HBV/HCV重叠感染者,在吸毒者中最高040%),在妊娠妇女中单独抗HBc反应性的检出率为1.2%TORCH检验有问题 弓形体抗体（IgM、IgG）风疹病毒抗体（IgM、IgG）巨细胞病毒抗体（IgM、IgG）单纯疱疹病毒抗体抗体（IgM、IgG）结果报告的问题阳性、阴性9确认实验（HBsAg中和试验、抗HCV重组 免疫印迹R旧A、抗HIV和梅毒抗体WB）