喉癌及下咽癌血浆肿瘤标志物的蛋白质组学筛选及验证.pdf

Y2617874-_ _ _ _ _ _博士学位论文喉癌及下咽癌血浆肿瘤标志物的蛋白质组学筛选及验证 摘要目的和意义喉癌及下咽癌是严重危害人们生命和健康的常见头颈部恶性肿瘤，病理类 型多为鳞状细胞癌。近年来，由于环境等多种不同致癌因素的共同作用，喉癌 及下咽癌的发病率呈逐渐上升的趋势。尽管以外科手术为主的综合治疗措施取 得较大进展，但是喉癌患者综合治疗后的5年生存率仍无明显的提高。尽管如 此，临床大量数据表明，治疗的早晚对患者预后产生重要的影响。据统计，早 期喉癌、下咽癌治疗效果相对较好，喉功能多可以保留；晚期喉癌、下咽癌由 局部浸润和处淋巴结转移，治疗效果较差，5年生存率下降。由此，提高喉癌、下咽癌疗效的关键在于的早期诊断、早期治疗。然而，喉癌及下咽癌早期诊断 困难，目前尚没有可靠的用于早期诊断的特异性指标，因此，临床上亟待寻找 喉癌及下咽癌相关的特异性肿瘤标志物以辅助早期诊断。随着分子生物学技术的快速发展及对肿瘤研究深入展开，人们对肿瘤的病 因及发病机制认识逐步加深，一些与肿瘤发生、发展及预后有关的癌基因和抑 癌基因相继被发现。基因的功能是通过其编码的蛋白质来实现的，蛋白质才是 生命活动的真正执行者，蛋白质在肿瘤形成中的作用越来越受到重视。蛋白质 组学技术的发展，为从整体水平研究蛋白质组在肿瘤发生、发展及演变过程的 作用提供了新的技术平台，同时为发现新的特异性肿瘤标记物奠定了技术基础。蛋白质组学(pr o t eo mics)是研究细胞、组织或生物体全体蛋白质的科学，旨 I中文摘要在阐明生物体全部蛋白质的表达及功能，包括蛋白质的表达、结构、功能和相 互作用等。通过检测蛋白质在不同环境、不同时期、药物干预、各种疾病及病 理生理过程中的变化，来阐述这些外在因素对细胞代谢的影响，分析改变的蛋 白质在各种疾病过程中发挥的作用，解释各种病理生理过程的分子机理。在肿 瘤研究中，通过蛋白质组学的方法可以对肿瘤组织蛋白质进行全面和深入研究，找到各种异常表达的蛋白质，作为肿瘤诊断的标志物和筛选肿瘤治疗药物的靶 点，也是肿瘤蛋白组学研究的重点。近年来，蛋白质组学技术在肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、宫颈癌等恶性肿瘤的早期诊断方面的研究取得初步的进展，发现 了一系列肿瘤相关蛋白和潜在的肿瘤标记物，为肿瘤相关研究提供了丰富资源。国、内外学者已应用蛋白组学技术初步观察到头颈癌及癌旁组织、原发癌与淋 巴结转移细胞系、头颈癌患者的唾液及血浆等蛋白质表达谱，证实了组织之间 的蛋白质表达谱确实存在差异，并筛选到了一些与头颈癌相关的肿瘤相关蛋白。然而，既往研究的这些成果仍然尚处于初级阶段，尚没有可以应用于头颈肿瘤 临床诊断的肿瘤标记物。既往国外研究是将头颈癌作为一个整体进行研究，未 对每种头颈癌进行分类研究，研究指标缺乏特异性。国、内外大多研究未进行 肿瘤病理分型，也未进行分级和分期，未对治疗前后疗效判断的对比研究，尚 缺乏对预后判断的指标。目前为止，国内外对喉癌及下咽癌的血浆蛋白质组学 研究报道较少，尚没有可供用喉癌及下咽癌早期诊断、治疗及预后监测的特异 性肿瘤标志物应用于临床O基于血浆蛋白质组学在喉癌、下咽癌肿瘤标志物的研究现状及其意义，本 课题研究的目的是应用蛋白组学技术筛选血浆中差异表达的蛋白质组，寻找潜 在的与喉癌、下咽癌患者密切相关的血浆肿瘤分子标志物，为喉癌及下咽癌的 早期诊断提供可靠的实验依据。材料和方法L临床标本搜集20例喉癌患者及20例下咽癌患者血浆标本来自2010年1月2012年6月 南方医院耳鼻咽喉头颈外科门诊及住院患者，均为治疗前患者血浆。喉癌组男博士学位论文性16例，女性4例，年龄5360岁，平均年龄56.3岁。其中声门型10例，声 门上型6例，声门下型3例，贯声门型1例。TNM分期为TjN_ 3M0,其中I 期2例，II期3例，III期12例，W期3例。病理证实为喉鳞状细胞癌。下咽癌 组男性18例，女性2例，年龄5163岁，平均年龄55.4岁。其中梨状窝区癌 15例，下咽后壁癌4例，环后区癌1例。TNM分期为TjN1.3M0,其中I期1 例，I期2例，III期13例，IV期4例。病理证实为下咽鳞状细胞癌。20例正常 健康组血浆标本来自于2012年6月南方医院体检科健康体检者，男性15例，女性5例，年龄5060岁，平均年龄54.6岁。标本保存于80冰箱中备用。2.血浆样品去除高丰度蛋白处理应用 S IGMA Pr o t eo Pr ep Bl u e Al bu min and Ig G Depl et io n Kit 试剂盒，除去 al bu min及Ig G等高丰度蛋白，加强低丰度蛋白的显影。3.血浆蛋白样品的纯化用2-D Cl ean-u p Kit试剂盒除去盐、脂肪、多糖等干扰双向电泳的物质。4.蛋白定量用Et t an2-D Qu ant Kit试剂盒测定样本中蛋白浓度。5.CyDye染料标记内标由样品蛋白各取25晚 混合而成，每块胶内标总量为50jig,用Cy 2染 料进行标记。使用三种特殊的荧光染料Cy 2、Cy 3、Cy 5以50 g蛋白:400pmo l 荧光染料的比例进行标记反应。6.双向凝胶电泳标记好的样品蛋白上样到pH 3-10 NL的24 cm非线性IPG胶条进行水化反 应，避光过夜。置入Et t an，IPGPho r进行第一向电泳，接着用Et t an DALT S ix 电泳仪进行第二向电泳。7.分析胶的成像用Ty pho o n Imag er 9400成像仪对电泳后胶板图像扫描，Cy 2、Cy 3以及Cy 5 分另ij以488/520 nm、532/580 nm 633/670 nm波长激光进行扫描，设定的PMT值 III中文摘要以整块胶或感兴趣的区域内的最大灰度值在60,000-90,000范围内为准。通过 Imag eQu ant TL软件可以看到Cy 2、Cy 3以及Cy 5的图像分别为蓝色、绿色及红色。8.制备胶的制作将含有同等量各组样品蛋白混合后的样品共600-800Ng加样到制备胶进行 一向和二向电泳，具体步骤和参数与分析胶的制备要求相同。用胶体考染法进 行后染色，所得凝胶在DeCy d er 2D差异分析软件中可与DIGE分析凝胶组相匹配 后进行点切取。9.差异点的软件分析及挖胶用DeCy d er V6.5分析软件先进行胶内差异分析(d if f er ent ial in-g el anal y sis,DIA),再进行胶间差异分析(bio l o g ical var iat io n anal y sis,BVA),找到感兴 趣的差异蛋白点，然后对分析到的差异点在制备胶上匹配到相对应的蛋白点，最后利用Et t an S po t pick er全自动斑点切取系统进行挖胶。10.考染胶粒的胶内酶解取出冻存的胶粒，加入胰蛋白酶后，37。恒温水浴中酶解14-16 l ir；抽提后 的酶解肽段用真空冷冻干燥仪冻干至10 R左右。使用ZipTipC18纯化浓缩样 品，最后用2日1含5 mg/ml CHCA基质和洗脱蛋白混合，并直接点到清洁干燥 的MALDI样品靶上。11.质谱鉴定将样品靶输入ABI 4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪中，内标校正，获取肽质 量指纹图谱(pept id e mass f ing er pr int ing,PMF),自动选择最强的10个母离子(pr ecu r so r)进行MS/MS二级质谱，进行氨基酸测序，得到肽序列标签(pept id e seq u ence t ag,PS T)O使用Masco t软件对质谱的PMF及PS丁进行数据库检索比对，采用MS和MS/MS联合模式搜索数据库NCBInr。取蛋白评分大于95%的鉴定结 果为高度可信。取可信度高的结果做进一步的生物信息学分析。IV博士学位论文12.Western blot验证随机选取4例喉癌患者血浆、8例下咽癌患者血浆及8例健康人血浆，进行 West er n-bl o t 验证试验。13.ELISA验证分别取20例喉癌患者、20例下咽癌患者血浆及20例健康人血浆，进行ELIS A 验证试验。14.统计学方法使用统计软件为S PS S 17.0,统计方法为两独立样本均数的1检验，方差齐 性检验用Levene检验，取a=0.05为检验标准。所有计量资料用均数土标准误(xiS E)来反映样本均数的离散趋势。结果1.蛋白定量结果采用2-D Qu ant k it的定量方法的同时，结合S DS-PAGE的染色图片直观显示 来核实定量的准确性。每组取50卜唱上样做S DS-PAGE电泳，结果显示各组间蛋 白条带辉度基本一致，说明定量准确。2.分析胶荧光图像扫描经过荧光差异双向凝胶电泳及Ty pho o n Imag er 9400成像仪对胶进行荧光扫 描，1号胶和2号胶均得到了清晰的蛋白质表达谱，利用Imag eQu ant TL分析软 件观察，不同染料标记的样本呈现不同颜色的图谱。3.DeCyder 2D软件分析蛋白差异点使用DeCy d er 2D差异分析软件对DIGE结果进行分析，经过胶内差异分析和 胶间差异分析，喉癌组血浆总蛋白和健康对照组相比较，共找到了28个差异蛋 白点，其中上调的有9个，下调的有19个。下咽癌患者与健康人血浆相比较，筛 选出表达量差异2倍以上的差异蛋白点共36个，其中表达上调的有16个，表达下v中文摘要调的有20个,4.差异蛋白质的质谱鉴定使用 ABT 4800 MAT.DI-TOF/TOF质谱仪对差异蛋白点进行鉴定。通过 masco t软件检索S wiss-Pr o t数据库鉴定蛋白，去除蛋白名称相同的蛋白，喉癌 血浆中共鉴定出16种蛋白质，分别为碱性磷酸酶、a-1抗胰蛋白酶、免疫球蛋 白片3链C结构域、纤维蛋白原丫链、al酸性糖蛋白1、载脂蛋白L1、结合珠 蛋白、结合珠蛋白相关蛋白、免疫球蛋白九-1链C结构域、免疫球蛋白k链C 结构域、载脂蛋白Al、C反应蛋白、血浆铜蓝蛋白、转甲状腺素蛋白、血红蛋 白a亚基、载脂蛋白C3。下咽癌血浆中共鉴定出18种差异蛋白，分别为血清 白蛋白、碱性磷酸酶、al抗糜蛋白嗨、a2-HS-糖蛋白、血管紧张素原、免疫球 蛋白丫-3链C结构域、纤维蛋白原y链、补体C4-B、载脂蛋白L1、结合珠蛋白、胶原蛋白al链、免疫球蛋白入-1链C结构域、免疫球蛋白k链C结构域、载脂 蛋白A1、血浆铜蓝蛋白、转甲状腺素蛋白、血红蛋白a亚基、载脂蛋白C3。5.Western blot 验证结果West er n bl o t实验结果发现，AGP1在喉癌患者血浆中浓度和健康对照组相 比，呈现升高趋势；AHS G在下咽癌患者血浆中浓度和健康对照组相比，呈现 升高趋势，均与蛋白质组学结果一致。6.ELISA验证结果ELIS A实验结果发现，AGP1在喉癌患者(n=20)血浆中浓度和健康对照 组(n-20)相比，呈现升高趋势，与蛋白质组学结果一致，见图1-11。AGP1 在健康对照组的浓度为965.5349.24iig/ml(土S E),在喉癌患者血浆中浓度为 2109.1399.94 pg/ml(一土S E)。Levene方差齐性检验结果显示两组数据方差齐 性，用两独立样本的，检验，/=10.282,尸0.05(0.000),喉癌组和健康对照组 血浆中AGP1浓度差异具有统计学意义。AHS G在下咽癌患者(n=20)血浆中 浓度和健康对照组(n=20)相比，呈现升高趋势，马蛋白质组学结果一致。AHS G 在健康对照组的浓度为129.364.04 jig/ml(S E),在下咽癌患者血浆中浓度 VI博士学位论文为261.61i8.39Rg/ml(丁士S E)。Leve ne方差齐性检验结果显示两组数据方差齐 性，用两独立样本的，检验，1=-14.197,P 0.05(0.000),下咽癌组和健康对照 组血浆中AHS G浓度差异具有统计学意义。结论本研究应用基于DIGE-MALDI-T0F/T0F质谱技术-生物信息学分析的差异蛋 白质组学技术平台，成功分离并鉴定出喉癌及下咽癌患者血浆的差异蛋白质组，并对两个感兴趣的差异蛋白进行了初步的功能验证，验证结果与实验结果相一 致。本研究可以得到以下3点结论：1.通过DIGE-MALDI TOF/TOF蛋白质组学技术平台分析喉癌组/下咽癌组 与正常对照组血浆的差异蛋白质图谱，并找到了喉癌组/下咽癌组相关的血浆差 异蛋白质。2.利用 West er n bl o t及ELIS A对AGP1及AHS G两个感兴趣的蛋白进行扩 大样本验证，发现AGP 1及AHS G在喉癌、下咽癌中与正常组织血浆差异有统 计学意义，与蛋白质组学筛选结果一致。3.AGP1及AHS G可以作为喉癌/下咽癌的潜在的血浆肿瘤标记物，用于早 期诊断。基于上述结果，血浆蛋白在喉癌和下咽癌发生、发展过程中发挥重要作用，血浆蛋白在喉癌、下咽癌和正常人血浆的差异表达表明，这些差异蛋白与喉癌 及下咽癌密切相关，可成为肿瘤患者的候选特异性血浆肿瘤标志物。蛋白质组 学技术为寻找血液中肿瘤相关分子标志物、为头颈肿瘤的诊断提供了新的途径。关键词 喉鳞状细胞癌下咽鳞状细胞癌头颈部肿瘤肿瘤标志物蛋白质组学荧光差异凝胶电泳质谱分析VII博士学位论文Tumor biomarkers screening and verification of plasm from laryngeal and hypopharyngeal carcinoma patients by proteomics method ABSTRACTObjectives and SignificanceLar y ng eal and hy po phar y ng eal cancer s wer e co mmo n mal ig nant t u mo r s o f head and neck which t hr eat en peo pl es l ives and heal t hs ser io u sl y,and t he mo st co mmo n pat ho l o g ical t y pe was sq u amo u s cel l car cino ma.In r ecent y ear s,d u e t o t he int er act io n o f d if f er ent car cino g enic f act o r s su ch as envir o nment,l ar y ng eal and hy po phar y ng eal cancer incid ences have been o n a g r ad u al u pwar d t r end.Whil e t he pr o g r esses o f co mbinat io n t r eat ment which based o n su r g ical measu r es mainl y have been mad e,t he 5-y ear su r vival r at e o f l ar y ng eal car cino ma pat ient s was st il l no no t iceabl e impr o vement af t er mu l t imo d al it y t r eat ment.Ho wever,cl inical d at a su g g est ed t hat d if f er ent st ag es had sig nif icant inf l u ences o n pr o g no sis o f pat ient s wit h t r eat ment.Acco r d ing t o st at ist ics d at a,t he r esu l t s o f t r eat ment s o n t he ear l y-st ag e o f l ar y ng eal and hy po phar y ng eal cancer s wer e bet t er,and t he l ar y ng eal f u nct io ns wer e bet t er r eser vat ed co mmo nl y;ho wever,becau se o f t he l o cal inf il t r at io n and met ast asis o f l y mph no d es f o r ad vanced l ar y ng eal and hy po phar y ng eal car cino mas,t he t r eat ment r esu l t s wer e d isappo int ed and t he 5-y ear su r vival r at e was d ecr eased.Thu s,t o impr o ve t he co nseq u ences o f l ar y ng eal and hy po phar y ng eal car cino ma,ear l y d iag no sis and ear l y t r eat ment was impo r t ant.Ho wever,since t her eABS TRACTwer e no r el iabl e and specif ic ind icat o r s f o r ear l y d iag no sis o f t he t u mo r s cu r r ent l y,ear l y d iag no sis o f l ar y ng eal and hy po phar y ng eal car cino ma wer e d if f icu l t,t her ef o r e,it was u r g ent l y t o l o o k f o r specif ic t u mo r mar k er s o f l ar y ng eal and hy po phar y ng eal cancer f o r ear l y cl inical d iag no sis.Wit h t he d evel o pment o f t echniq u es o f mo l ecu l ar bio l o g y and t he f u r t her r esear ch o n cancer s,t he u nd er st and ing o f et io l o g y and pat ho g enesis o f cancer s wer e g r ad u al l y d eepened,and so me r el evant o nco g enes and t u mo r su ppr esso r g enes abo u t t u mo r ig enesis,d evel o pment and pr o g no st ic have been f o u nd.Fu nct io ns o f g ene wer e per f o r med by pr o t eins which enco d ed,and pr o t eins wer e t he t r u e per f o r mer s f o r l ives.The d evel o pment o f pr o t eo mics t ecl mo l o g y have pr o vid ed a new t echno l o g y pl at f o r m f o r o ver al l st u d y o n t u mo r d evel o pment and mal ig nant t r ansf o r mat io n pr o cess,as wel l as f o u nd t echnical basis o f l o o k ing f o r t he new specif ic t u mo r mar k er s.Pr o t eo mics is a scient if ic st u d y o f pr o t eo m co mpo sit io ns and t heir var iat io n r u l es o f cel l s,t issu es o r o r g anism,and t he aims o f which is t o cl ar if y t he mo d e o f pr o t ein expr essio n pat t er ns and f u nct io nal pat t er ns o f al l l iving o r g anisms,incl u d ing pr o t eins expr essio n,exist ences,st r u ct u r es,f u nct io ns and int er act io ns and so o n.We can u nd er st and t he ef f ect s o f ext er nal f act o r s t o cel l met abo l ism,t he f u nct io ns o f chang ed pr o t eins in var io u s d isease,and mo l ecu l ar mechanisms o f al l t he pat ho phy sio l o g ical pr o cesses by d et ect ing t he l evel o f pr o t eins in d if f er ent envir o nment s,d if f er ent t ime,d r u g s t r eat ment,d iseases and chang es in phy sio l o g ical pr o cesses.In cancer r esear ch,ad vanced st u d ies have been per f o r med by pr o t eo mic appr o ach,which wer e mainl y o n pr o t ein q u ant it ies,st r u ct u r es,char act er s,r el at io nships and bio l o g ical f u nct io ns o f t u mo r t issu es,t o f u r t her cl ar if y t he mechanism o f t u mo r d evel o pment,t o l o o k f br al l k ind s o f abno r mal expr essio n o f pr o t eins which can be u sed as mar k er s f br cancer d iag no sis and scr eening o f d r u g s t ar g et f o r cancer t r eat ment.In r ecent y ear s,t he pr o t eo mics t echniq u es wer e wel l pr o g r essed in ear l y d iag no sis o f l u ng cancer,l iver cancer,st o mach cancer,r enal cel l car cino ma,and cer vical cancer,and a ser ies o f po t ent ial cancer-r el at ed pr o t eins and t u mo r mar k er s wer e d isco ver ed,which may pr o vid e weal t hy r eso u r ces f o rii博士学位论文 cancer-r el at ed r esear ch.Bo t h d o mest ic and o ver seas st u d ies have o bser ved t hat t her e wer e d if f er ent ial expr essio ned pr o t eins bet ween head and neck cancer s and ad jacent no r mal,pr imar y cancer s and l y mph no d e cel l s,and in sal ivar y pr o t eins,ad d it io nl y,t he r esu l t s wer e co nf ir med by exper iment al d at a.At pr esent,t her e wer e f ew pl asma pr o t eo mics r epo r t s o n l ar y ng eal and hy po phar y ng eal car cino ma,and t her e wer e no avail abl e t u mo r mar k er s f o r ear l y d iag no sis,t r eat ment and pr o g no sis f o r cl inical mo nit o r ing.Acco r d ing t o t he st u d y sit u at io n o f pl asma pr o t eo mics and it s sig nif icance o f t u mo r mar k er s f o r l ar y ng eal car cino ma and hy po phar y ng eal car cino ma,t he pu r po se o f t his st u d y is t o u t il ize pr o t eo mics t echno l o g y t o scr een d if f er ent ial expr essed pl asma pr o t eo me t o l o o k f o r po t ent ial ser u m t u mo r mar k er s f o r pat ient s wit h l ar y ng eal and hy po phar y ng eal cancer s,t her ef o r e,o u r st u d y wil l pr o vid e r el iabl e exper iment al d at a f o r ear l y d iag no sis o f l ar y ng eal and hy po phar y ng eal car cino ma.Materials and methods1.Clinical samples collectionThe pl asma sampl es f r o m 20 cases o f l ar y ng eal cancer pat ient s and 20 cases o f hy po phar y ng eal cancer pat ient s wer e co l l ect ed in Ot o l ar y ng o l o g y Head and Neck S u r g er y o f Nanf ang Ho spit al f r o m Janu ar y 2010 t o Ju ne 2012,and al l t he sampl es wer e co l l ect ed bef o r e t r eat ment.1her e wer e 16 mal e and 4 f emal e pat ient s in l ar y ng eal cancer g r o u p,wit h 53-60 y ear s o l d,T1.4N1.3M0 TNM st ag e,and l ar y ng eal sq u amo u s cel l car cino ma(LS CC)o f pat ho l o g ical l y t y pe;t her e wer e 18 mal e and 2 f emal e pat ient s in hy po phar y ng eal cancer g r o u p,wit h 50-60 y ear s o l d,T1.4N1,3M0 TNM st ag e,and hy po phar y ng eal sq u amo u s cel l car cino ma(HS CC)o f pat ho l o g ical l y t y pe.20 cases o f no r mal pl asma sampl es wer e co l l ect ed f r o m heal t hy phy sical examinat io n d epar t ment o f Nanf ang Ho spit al in Ju ne 2012,wit h 15 mal e and 5 f emal e d o no r s,and 50-60 y ear s o l d.The sampl es wer e d epo sit ed in-80 r ef r ig er at o r.2.High abundance proteins re movement of plasma samplesTo r emo ve hig h abu nd ance pr o t eins su ch as al bu min and Ig G t o st r eng t hen t he d evel o pment o f l o w abu nd ance pr o t eins,a S IGMA Pr o t eo Pr ep Bl u e Al bu min andiiiABS TRACTIg G Depl et io n Kit was u sed.3.Purification of plasma protein samples2-D Cl ean-u p Kit was u sed t o r emo ve sal t,f at,po l y sacchar id es and o t her mat er ial which int er f er e wit h t wo-d imensio nal el ect r o pho r esis.4.Protein concentration determinationThe pr o t ein co ncent r at io n o f t he sampl es wer e d et er mined by Et t an1M 2-D Qu ant Kit.5.CyDye labelingInt er nal st and ar d was pr o t ein mixt u r e o f al l t he sampl es wit h 25p.g each,and 50|ig t o t al pr o t ein f o r int er nal st and ar d in o ne g el,wl iicl i was mar k ed wit h Cy 2 d y e.Thr ee special f l u o r escent d y es named Cy 2,Cy 3 and Cy 5 wer e l abel ed wit h 50k g pr o t ein:400 pmo l d y es.6.Two dimentional electrophoresisThe r ehy d r at io n pr o cess was per f bnned wit h immo bil ized no n-l inear pH g r ad ient(IPG)st r ips(pH 3-10 NL,24 cm)which wer e l at er r ehy d r at ed by Cy Dy e-l abel ed sampl es in t he d ar k at r o o m t emper at u r e o ver nig ht.Iso el ect r ic f o cu sing was t hen per f o r med u sing a IPGpho r appar at u s.The g el s wer e t hen r u n in an Et t an DALT S ix g el t ank.7.Image scanning of analytic gelThe g el s af t er el ect r o pho r esis wer e scanned wit h Ty pho o n Imag er S canner 9400,and t he channel s o f Cy 2,Cy 3 and Cy 5 wer e r espect ivel y scanned by 488/520 nm,532/580 nm and 633/670 nm,and t he PMT val u e was set as t he big g est g r ey val u e wit hin t he r ang e 60000-90000 in t he who l e g el o r t he int er est ed r eg io n.The bl u e,g r een,and r ed imag es which wer e l abel ed wit h Cy 2,Cy 3 and Cy 5 d y es wer e o bser ved r espect ivel y.8.Production of preparative gelA pr epar at ive g el,co nt aining 600-800|ig o f u nl abel cd int er nal st and ar d mixt u r e pr o t eins,was pr epar ed f o r 2DE,t he st eps and par amet er s wer e t he same as t he anal y t ic g el s.Af t er po st-st ainning wit h co l l o id st aining d y es,t he pr epar at ive g el was mat ched wit h anal y t ic g el s t o pick t he d if f er ent ial spo t s anal y zed wit h DeCy d erIV博士学位论文2D so f t war e.9.Differential spots analysis with software and spot pickingDif f er ent ial in-g el anal y sis and bio l o g ical var iat