CB518900-病毒与细胞相互作用导致炎症的基础研究应用.doc

项目名称：
病毒与细胞互相作用导致炎症基本研究
首席科学家：
吴建国 武汉大学
起止年限：
.1-.8
依托部门：
教诲部

一、核心科学问题及研究内容
本项目将以病毒与细胞互相作用为基本，环绕病毒感染导致宿主细胞炎症开展6个方面研究工作。

1、DNA病毒感染导致炎症反映规律
疱疹病毒感染会在机体内上皮组织、角膜、甚至脑内等部位引起炎症，不同部位引起炎症效应细胞和炎症介质是理解炎症发生机制核心。以疱疹病毒为重要研究对象，发现并确认也许与DNA病毒感染有关炎症介质并进一步筛选与疱疹病毒感染有关炎症细胞特异组分，并以此为基本，拟定病毒感染诱发炎症因子表达规律。同步，炎症发生需要外源感染生物、机体炎症有关细胞、炎症因子三方面共同作用，三者有序联系在一起途径即为引起炎症胞内外致炎信号通路。将鉴定信号通路中每一环节细胞因子，逐个确认病毒组分与细胞炎症因子配体和受体、胞内炎症信号传播分子关系，最后确认疱疹病毒引起炎症反映信号通路和也许分子机制。由于疱疹病毒感染机体后能导致裂解性感染和潜伏性感染。不同感染成果导致炎症反映发生又不同，而不同感染成果又与病毒有关感染蛋白互相作用关于。通过对作用于同一炎症因子或相似促炎信号通路疱疹病毒编码蛋白进行协同分析，理解这些有相似致炎作用不同病毒调控蛋白所产生调节炎症发生或病毒感染综合效应，最后构建一种DNA病毒感染与诱发炎症反映初级作用网络模型。

2、RNA病毒感染导致炎症反映规律
以汉坦病毒为重要研究对象，通过对RNA病毒与宿主互相作用研究，着重揭示RNA病毒核酸及其编码蛋白与炎症信号通路中重要分子互相作用机制。在此基本上，进一步分析病毒组分与细胞组分互相作用对炎症产生或消除影响，明确影响炎症转归从而导致严重病理性炎症反映规律。研究宿主细胞在RNA病毒感染诱导炎症反映中对各种炎性细胞向炎症部位和引流淋巴结迁移作用，并运用成熟RNA病毒反向遗传学技术，得到重组流感病毒和水疱性口炎病毒（Vesicular Stommatitis Virus），建立果蝇微量注射感染模型，结合生物学信息模型预测候选基因，从事规模性与炎症信号通路有关活体遗传筛选，鉴定新参加RNA病毒炎症反映信号分子，研究其功能和机制，最后拟定RNA病毒感染与诱发炎症反映规律。

3、非编码RNA调控炎症反映机制
鉴定疱疹病毒和汉坦病毒等基因组内非编码RNA并分析其启动子序列特性，探讨病毒非编码RNA在宿主细胞内表达调控方式。在此基本上，鉴定病毒非编码RNA靶向宿主基因，探讨这些基因编码蛋白对炎症反映调控。同步建立病毒非编码RNA致炎转基因小鼠模型，从整体角度探讨病毒对炎症发生、发展过程调控。在此基本上，从动物水平上，探讨病毒非编码RNA对炎症有关信号通路影响以及对促炎因子和血管生成因子表达调控，进一步理解病毒感染导致炎症分子机制。由于在病毒感染导致细胞炎症信号途径活化过程中，胞内miRNA和lncRNA表达对于病毒感染导致炎症调控具备重要意义。为此，咱们也将研究胞内miRNA和lncRNA在炎症信号活化过程中表达变化，研究它们对RIG-I炎症信号调控作用和机制。并进一步以炎症因子IL-6和TNF-α活化巨噬细胞为模型研究细胞表达非编码RNA对IL-6和TNF-α下游信号传导途径调控作用。拟定非编码RNA调控炎症反映作用及机制。

4、病毒感染导致炎症反映生物学效应
进一步探讨调控细胞因子风暴产生宿主因子，特别是ADE与天然免疫信号通路互相作用，发现和鉴定一系列影响宿主细胞因子风暴产生编码蛋白及核心位点，明确其调控细胞因子风暴产生分子机制，从而阐明病毒感染导致炎症反映生物学效应，并以转录组学和蛋白质组学为基本，探讨病毒与媒介、病毒与宿主互相作用导致媒介和宿主在感染病毒先后差别表达基因，分析也许涉及到炎症形成因子在DF、DHF和DSS形成过程中作用，同步分析这些因子在病毒感染细胞后对病毒信息反馈，分析这些来源于媒介和宿主数据，寻找它们共性，特别是在病毒感染导致炎症形成方面共性。依照获得数据采用反向遗传学手段验证这些因子对疾病形成、病毒在媒介中持续感染和病毒增殖影响。 拟定流感病毒感染所致炎症有关重要病毒蛋白与核酸及其生物学效应及机制，运用流感病毒体外细胞和小鼠感染模型，对不同亚型流感病毒、流感病毒重组与点突变体诱导炎症反映，细胞因子、炎症有关通路核心分子等进行系统性检测与分析，探讨流感病毒蛋白以及基因组涉及特殊基因成分例如CpG，辨认宿主不同病原辨认受体模式，与炎症核心分子互相作用机制以及导致各种炎症反映生物学效应，以期发现病毒炎症有关蛋白与基因，及其重组与变异对炎症反映影响。同步结合血清等临床中资源，系统分析流感病毒引起炎症有关细胞因子谱，发现和确认导致免疫病理作用核心分子。

5、病毒感染导致炎症致病机理
研究不同形式FN与汉坦病毒包膜糖蛋白互相作用及其对病毒感染影响、TNFR I与β3整合素在介导汉坦病毒入胞中作用和互有关系、G2对TNFR I功能与否存在调节作用和β3整合素及其有关分子介导汉坦病毒感染血管内皮损伤分子机制，汉坦病毒感染产生炎症细胞因子/趋化因子分子机制。同步以血管内皮细胞或单核巨噬细胞为模型，探讨病毒感染与NF-κB途径之间关系以及趋化因子CXCL10（IP-10）在汉坦病毒致病中作用，汉坦病毒及其感染细胞与NK细胞互相作用。澄清IL-17、IP-10、MCP-1等核心炎症反映因子在甲型流感病毒H1N1、H5N1单一及混合感染导致炎症反映过程中作用以及甲型流感病毒感染介导炎症反映共性与个性分子靶标和涉及信号转导通路网络以及补体介导免疫病理损伤在流感病毒致病中作用及其机制。

6、病毒感染导致炎症反映网络调控
以流感病毒为重要研究对象，研究病毒与细胞互相作用导致炎症反映网络调控。在流感不同病程中炎症因子（COX-2、iNOS、IL-32等）表达水平检测及记录学分析；从启动子水平研究流感病毒及其基因产物分别对COX-2、iNOS、IL-32转录调控影响；对COX-2、iNOS、IL-32表达有调控作用转录因子筛选；研究转录调控因子与启动子DNA互相作用；流感病毒感染诱导COX-2、iNOS / IL-32表达信号通路。
IL-32在炎症反映中作用以及与COX-2、iNOS互有关系研究。有炎症活性IL-32剪接异构体筛选；受IL-32调控下游炎症因子筛选和IL-32在炎症网络中生物学功能研究；IL-32与COX-2互有关系研究；IL-32与iNOS互有关系研究；COX-2、iNOS、IL-32在炎症反映网络中上下游关系。COX-2、iNOS、IL-32在炎症网络中调控机制研究。依照前期实验得出这些基因在炎症网络中上下游调控关系，在同上细胞模型中，选取上游基因进行过表达或基因沉默。检测共转下游基因启动子截短和突变报告基因活性，找到受调控转录位点，并进行转录因子与下游基因启动子DNA结合实验，从而拟定上游基因对下游基因表达调控机制；检测与下游基因表达调控有关信号通路影响，拟定上游基因调控下游基因信号通路。进一步开展表观遗传修饰与COX-2、iNOS、IL-32表达调控关系以及甲基化酶参加调控炎症机制研究，涉及：炎症基因甲基化测序和分析，流感病毒和乙肝病毒慢性中甲基化酶调控炎症基因表达变化机制研究等。

二、预期目的
（一）总体目的
本项目完毕将在病毒感染导致炎症反映基本研究和防治基本研究方面获得具备自主知识产权、领先于国际同类研究创新性成果，提高国内在传染病基本研究领域研究水平和国际影响力，为防治病毒性传染病供坚实理论根据和技术支撑。

（二）五年预期目的
1、分离鉴定新细胞炎症因子
建立一种以大规模基因筛选为基本技术平台，构建果蝇病毒感染模型，结合生物信息学和分子生物学办法和手段，分离与拟定3～4个与病毒感染导致炎症有关新细胞炎症因子；掌握病毒感染导致细胞炎症因子产生基本规律，并阐明其在病毒感染导致炎症新机制。

2、揭示病毒蛋白和核酸调控炎症作用新机制
以DNA 病毒和 RNA病毒为模式，阐明病毒蛋白和核酸在调控炎症发生、发展与转归中作用机制；揭示病毒蛋白和核酸对干扰素信号通路调控，进而抑制宿主防御，增进病毒自身繁殖机制；充分理解病毒感染导致炎症反映本质因素，阐明病毒对炎症信号通路影响及也许新致病机制。

3、阐明非编码RNA在炎症反映中作用机制
构建病毒非编码RNA转基因小鼠，鉴定一批新病毒非编码RNA，并揭示其影响细胞表观遗传学修饰，从而调控炎症信号通路新机制。完善病毒感染并活化炎症信号传导细胞模型，建立干预非编码RNA表达小鼠模型，研究非编码RNA对小鼠体内病毒感染调控作用；通过大规模测序和深度分析细胞miRNome，拟定病毒感染中，胞内非编码RNA表达谱变化，揭示细胞非编码RNA在炎症信号传导途径、炎症因子表达与释放或炎症因子下游信号途径中调控作用及机制。

4、明确病毒感染导致炎症反映生物学效应
阐明病毒变异对免疫应答与炎症反映生物学效应，揭示病毒感染导致不同炎症反映机制，发现和鉴定一系列诱导ADE效应病毒增强型表位，明确模式辨认信号分子调控ADE基本过程，阐明其诱导炎症反映生物学效应；掌握病毒不同分离株对动物感染性差别以及不同致病性毒株感染导致炎症因子水平差别规律，分析病毒感染导致炎症反映及其对病毒致病性影响；明确病毒感染导致血管内皮细胞损伤分子机制；阐明病毒感染引起细胞因子/趋化因子产生导致炎症及其致病分子机制，明确病毒感染者HLA表型与病毒肽段表位关系，以及CTL辨认不同表位与炎症反映损伤关系；阐明病毒致炎症反映规律以及补体介导免疫病理损伤在流感病毒感染中作用及机制。

5、提出病毒感染导致炎症网络调控模型
拟定病毒感染导致表观细胞遗传修饰变化及其在炎症发生发展中作用，明确病毒感染导致炎症核心因子及信号通路互相作用及有关分子机制，构建病毒感染导致炎症作用网络模型。

6、获得一批科研成果
在病毒感染导致炎症反映分子机制研究领域获得某些开拓性科研突破，刊登150～200篇具备国际影响SCI 收录论文，力求在本领域和国际生物医学顶级刊物刊登影响因子不不大于10论文6～8篇，获得3～5项开拓性科研突破；获得一批拥有自主知识产权高水平技术成果，申请国家创造专利10～15 项；获得国家级科技奖励1～2 项；争取获得较好经济和社会效益。

7、培养一批人才
培养一批在病毒致炎研究领域具备国际竞争力先进中青年科学家和后备人才。

8、造就一支队伍
造就一支跨学科、跨领域、精诚合伙、团结奋进、开展病毒感染与炎症反映研究专门科研队伍。

9、开展学术交流
开展有关国内外学术交流2～3次。

三、研究方案
（一）学术思路

1、DNA病毒感染导致炎症反映规律
以已知外源生物诱发炎症反映为借鉴和基本，从DNA病毒感染分子生物学特点出发，理解DNA病毒诱发炎症反映普通规律，以及与老式细菌诱发炎症反映相比共通之处及差别或特点。在掌握DNA病毒所产生有关致炎分子机制后，为该类病毒诱发炎症反映构建一种初级互相作用和信号通路网络。
2、RNA病毒感染导致炎症反映规律
诸多RNA病毒通过其自身RNA和编码蛋白对感染机体后诱导炎症反映进行调控，破坏机体对于炎症反映精准调控，进而导致临床上不同症状。本项目拟研究炎症反映有关信号转导机制，在此基本上阐明RNA病毒感染导致炎症反映规律。通过核酸－蛋白质或蛋白质－蛋白质互相作用，研究病毒诱发炎症普通规律，以及病毒编码蛋白对炎症产生或转归特定过程进行调控，从而导致病理性炎症反映分子机制。
3、非编码RNA调控炎症反映机制
立足于病毒感染导致巨噬细胞胞内非编码RNA表达谱变化，以病毒感染巨噬细胞导致RIG-I炎症信号活化为模型，研究在RIG-I炎症信号活化过程中其他重要非编码RNA表达变化，筛选其中表达差别明显并验证重复性良好非编码RNA。以炎症因子IL-6和TNF-α活化巨噬细胞为模型，使用高通量芯片检测此过程中胞内非编码RNA表达谱变化，筛选发生明显表达变化非编码RNA，并通过上述思路探求这些非编码RNA对于IL-6和TNF-α下游信号传导途径调控作用；通过体内干预如上非编码RNA，谋求干预病毒感染导致炎症新靶点。在病毒感染小鼠动物模型中，尝试通过干预如上非编码RNA，进而影响RIG-I炎症信号活化导致炎症反映，以谋求体内干预病毒致炎新靶点和新思路。
4、病毒感染导致炎症反映生物学效应
立足于国内重要病毒性传染病流行特点，选取登革病毒等为研究对象，聚焦国际前沿科学问题，以病毒与细胞互相作用导致炎症为主线，从细胞和分子水平，开展对病毒感染导致炎症反映生物学效应原创性研究，揭示登革病毒ADE产生规律，登革病毒感染发生炎症反映与其导致DF、DHF和DSS形成机制，以及炎症反映和病毒性脑炎形成机制，为药物和新型疫苗设计提供科学根据。
5、病毒感染导致炎症致病机制
炎症是机体对各种损伤性刺激一种防御反映，也是随着各种疾病状态一种共有病理现象。综合采用各种细胞生物学、分子生物学及免疫学技术，以设计周密实验研究为主，结合大量临床标本系统检测，从分子、细胞及整体（涉及实验动物和临床患者）等不同层面和角度，对病毒与细胞互相作用导致炎症及其致病机制开展研究。重要涉及病毒入胞途径中核心分子在感染中作用及其机制，病毒感染导致血管内皮细胞损伤分子机制，固有免疫和特异性细胞免疫应答在病毒致炎症反映及免疫损伤中作用及其机制；病毒感染引起急性肺损伤核心炎症反映因子及其作用机制，补体介导免疫病理损伤在病毒致病中作用及其机制等。 6、病毒与细胞互相作用导致炎症反映网络调控
结合临床数据，综合分析流感病毒感染导致炎症反映中炎症因子表达调控规律，研究病毒核酸和病毒蛋白表达引起炎症基因表达分子机制，炎症因子时序调控规律以及炎症因子互相调控网络，研究新型炎症因子并拟定其在炎症网络中作用。表观遗传修饰变化和蛋白泛素化调控炎症网络机制，为抗炎药物研发打下基本。

（二）技术途径

1、DNA病毒感染导致炎症反映规律
（1） 运用PCR技术构建上述HSV-1复制必须蛋白一系列缺失突变体。
（2） 通过酵母双杂交和免疫共沉淀拟定上述HSV-1复制蛋白-细胞因子详细作用位点。
（3） 接着对病毒复制蛋白基因进行点突变，使上述互相作用蛋白失去互相结合能力但不变化其复制活性区功能。
（4） 通过重组病毒办法重新构建突变病毒；检测感染重组病毒细胞IFN-γ及其她炎症反映细胞因子水平变化状况；探讨在病毒感染状态下，信号通路活化或抑制与炎症因子表达调节之间关系。
2、RNA病毒感染导致炎症反映规律
（1） 通过病毒与宿主互相作用，研究宿主辨认RNA病毒并产生验证反映规律，着重研究RNA病毒核酸及其编码蛋白通过与炎症信号通路中重要分子互相作用分子机制。
（2） 研究RNA病毒核酸及其编码蛋白通过与炎症产生或消除过程重要蛋白质互相作用，影响炎症转归从而导致严重病理性炎症反映规律。着重研究重要医学病毒编码蛋白对补体系统、花生四烯酸炎症因子调控 ，从而导致严重病理性炎症反映分子机制。
（3） 研究宿主细胞表达LIGHT分子在RNA病毒感染诱导炎症反映中对各种炎性细胞如单核/巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞向炎症部位和引流淋巴结迁移作用；对免疫保护和免疫病理影响；并摸索其分子机制。
（4） 运用改造病毒建立果蝇微量注射感染模型，结合生物学信息模型预测候选基因，从事规模性与炎症信号通路有关活体遗传筛选，鉴定新参加RNA病毒炎症反映信号分子。
（5） 果蝇RNA病毒感染模型建立：建立不同免疫系统发育阶段果蝇感染模型。并进一步通过组织、细胞、分子水平拟定参加RNA病毒性炎症反映新调节因子。
3、非编码RNA调控炎症反映机制
（1） 运用生物信息学办法，预测病毒基因组中非编码RNA。
（2） 运用RNA免疫沉淀技术，辨承认以与组蛋白甲基化酶互相作用病毒非编码RNA；运用ChIP-seq技术，探讨病毒非编码RNA对宿主染色质重塑。
（3） 运用质谱分析病毒蛋白翻译后修饰，阐明病毒蛋白磷酸化、泛素化修饰对干扰素通路影响；运用表达谱基因芯片技术，探讨病毒非编码RNA对宿主细胞转录组调控。
（4） 构建适合病毒非编码RNA转基因小鼠模型，研究病毒致炎过程及机制。用病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞为细胞感染模型，用病毒直接注射小鼠腹腔或滴鼻作为体内病毒感染模型，观测非编码RNA对病毒感染导致炎症调控作用。
（5） 对于观测RIG-I炎症信号活化导致胞内miRNA或lncRNA表达谱变化，基于已有研究平台，咱们拟使用miRNA芯片和lncRNA芯片筛选炎症过程中发生明显表达差别miRNA或lncRNA。
（6） 使用第二代测序技术深度揭示巨噬细胞miRNome，观测巨噬细胞miRNA表达模式，谋求在巨噬细胞中富集表达miRNA。
（7） miRNA和lncRNA功能研究。通过高表达或抑制有关miRNA或lncRNA，观测其在病毒感染导致RIG-I炎症信号活化模型中对RIG-I下游重要信号分子活化、炎症因子表达和病毒自身复制等方面影响。
（8） miRNA靶基因鉴定技术。使用惯用miRNA寻靶软件如TargetScan或miRanda等搜索有关miRNA也许靶基因，再将这些也许靶基因进行GO或KEGG富集运算，以发现与炎症有关信号通路中核心分子有关也许靶基因。随后，逐个构建如上也许靶基因3’UTR荧光素酶报告基因，进一步验证miRNA与靶基因互相作用。
（9） 非编码RNA体内干预技术。在病毒感染小鼠动物模型中，尝试通过干预如上非编码RNA，进而影响RIG-I炎症信号活化导致炎症反映。
4、病毒感染导致炎症反映生物学效应
（1） 建立登革病毒体内外ADE模型，拟定相应抗体ADE活性，同步运用KO小鼠观测炎症分子在体内生物学效应。
（2） 建立流感病毒靶细胞模型，建立某些重要免疫分子如促炎症细胞因子、趋化因子以及炎症反映核心蛋白敲除细胞系用于体外感染或炎症反映细胞感染模型。
（3） 运用免疫敲除小鼠建立相应流感病毒感染小鼠模型。
（4） 通过病毒基因定点突变、重组突变体等分子生物学手段，系统全面分析不同流感病毒感染导致细胞和机体炎症反映，找出病毒与宿主在验证反映核心分子。
（5） 建立模仿登革病毒持续感染细胞DGE文库，运用Illumina测序技术分析文库tag序列，并以蚊全基因库和人全基因库为对象，进行tag注释，结合差别分析系统分析基因表达差别。
5、病毒感染导致炎症致病机制
（1） 研究不同形式FN与汉坦病毒包膜糖蛋白互相作用及其对病毒感染影响；检测HFRS患者血清中FN及TGFβ1含量；拟定汉坦病毒包膜糖蛋白G2在TNFR I上结合位点；明确TNFR I在介导汉坦病毒入胞中作用。
（2） 建立模仿血管内皮细胞构造体外血管内皮细胞系或HUVEC生长和通透性检测模型，以及血管内皮通透性定量测定技术；针对重要促炎/致炎分子或信号传递分子尝试各种阻断方案如特异性抗体、siRNA、特异性抑制剂/激动剂等。
（3） 检测汉坦病毒NP、G1/G2表位特异性T细胞，并筛选其中阳性肽对抗原肽刺激有应答HFRS患者进行HLA-I、II类位点基因分型，拟定其中具有CD4＋或CD8＋表位15肽序列；测定HFRS患者外周血中特异性T细胞分泌细胞因子种类和频率。
（4） 建立甲型H1N1、H5N1流感病毒单独感染及混合感染细胞模型和动物模型；在RNA水平和蛋白水平检测上述感染细胞IL-17、IP-10、MCP-1等炎症反映因子及其差别变化；在RNA水平和蛋白水平检测上述感染动物体内IL-17、IP-10、MCP-1等炎症反映因子及其差别变化。
（5） 拟定和发现与补体作用病毒蛋白/功能区，并研究参加激活和作用于补体系统病毒成分和作用方式、途径等。
6、病毒与细胞互相作用导致炎症反映网络调控
（1） 免疫学手段，涉及免疫组化技术，酶联免疫反映等；分子生物学手段，涉及PCR，克隆和构建技术等；基因沉默技术，瞬时过表达表达以及信号通路抑制剂使用拟定炎症网络中核心节点上下游关系。
（2） DNA定点突变技术研究转录因子磷酸化及生物学功能。
（3） 荧光素酶报道系统测定COX-2、iNOS、IL-32以及带筛选炎症基因启动子活性。
（4） 荧光定量PCR分析炎症基因病毒感染先后及炎症进程中mRNA变化。
（5） Western blotting分析炎症基因以及转录因子表达水平。
（6） EMSA及CHIP分析蛋白质-DNA结合及启动子区DNA互相作用。
（7） Bisulfite Sequencing PCR研究炎症反映过程中COX-2、iNOS、IL-32启动子甲基化水平变化并拟定其位点。
（8） Methylation-EMSA，methylation-CHIP研究启动子核心位点甲基化状态影响炎症基因表达分子机制。

（三）创新性和特色

1、阐明病毒感染导致炎症反映规律和新机制
研究DNA病毒感染导致炎症反映规律为这一命题提供坚实基本研究，自身就具备创新性。此外，进一步研究RNA病毒感染导致炎症反映与其她信号通路之间关联性，有助于加深对RNA病毒致炎规律网络调控机制理解。环绕宿主调节炎症反映中免疫保护和免疫病理平衡这一重要前沿问题，研究病毒编码蛋白对补体等炎症介质干扰过程，有也许揭示病毒新致病机制，并且为病毒感染导致炎症提供可寻普遍规律。
2、明确非编码RNA调控炎症反映作用机制
从蛋白修饰（磷酸化和泛素化）角度研究病毒蛋白和宿主蛋白以及病毒和宿主非编码RNA之间互有关系，具备较好创新性，将为进一步理解病毒感染和致病机理，设计小分子抗病毒药物提供良好根据。通过研究在miRNA或lncRNA层面干预病毒感染导致炎症反映，拟采用有关技术在谋求体内干预病毒致炎新靶点方面具备较强创新性。
3、拟定病毒感染导致炎症反映生物学效应
ADE效应风险使得疫苗及治疗性抗体研究面临极大挑战，特别是ADE效应参加调节干扰素反映及炎症反映生物学效应亟待阐明。此外，以实验研究为主，结合大量临床患者标本系统检测，阐明病毒感染直接损伤，特别是血管内皮损伤分子机制，以及免疫病理损伤，特别是CTL辨认不同表位与炎症反映损伤关系具备较强创新性。从分子、细胞及整体动物不同角度和层面，明确病毒感染导致炎症反映过程中核心因子及信号通路，阐明病毒致炎症反映规律以及补体介导免疫病理损伤在感染中作用及其机制，也是本课题研究特色之一。
4、构建病毒与细胞互相作用导致炎症反映网络调控
本课题收集大量临床样本进行检测，获得急、慢性炎症临床数据。对炎症发生发展中炎症网络机制研究结合了临床数据和感染模型中实验数据，不但使该研究获得数据更加接近真实状况，而其该工作更具备现实意义，研究成果可对传染病临床治疗提供有价值参照。

（四）可行性分析

本项目总体方案切实可行，一定会获得突破性成果。
1、人才队伍
承担本项目研究课题负责人和学术骨干是国内病毒学、免疫学、分子生物学和传染病学等领域先进中青年科学家、有主持或负责国家研究项目丰富经验，多数都是从海外留学归来并已卓有成效地开展工作研究人员，有丰富研究成果和研究经验。
2、学术水平
项目构成员在病毒学、分子生物学、传染病学、免疫学等领域均做出过重要贡献， 近年来，以第一作者或通讯作者刊登SCI收录论文300余篇，涉及国际权威期刊：N Engl J Med (IF:47.05)，Nat Immunol (IF:26.000)，Cancer Cell (IF:25.288)，Cell Stem Cell (IF:23.563)，Immunity (IF:20.589)，Nat Cell Biol (IF:19.527)，J Clin Invest (IF:16.592)，Mol Cell (IF:14.608)，Hepatology (IF:11.355)，Blood (IF:10.55)，PNAS (IF:9.432)，Mol Cell Proteomics (IF:8.791)，Trends Immunol (IF:8.768)，Cell Death Differ (IF:8.240)，Clin Infect Dis (IF:8.195)，Cancer Res (IF:7.543)，Nucleic Acids Res (IF:7.479)，Oncogene (IF:7.135)，Autophagy (IF:6.829)，FASEB J (IF:6.401)，Small (IF:6.171)，J Infect Dis (IF:5.865)，J Immunol (IF:5.646)，J Biol Chem (IF:5.328)，Eur J Immunol (IF:5.179)，J Virol (IF:5.150)，J Proteome Res (IF:5.132)等。此外，团队之间已有成功合伙经验和基本、联合刊登过多篇论文。
3、前期基本
项目负责人和课题负责人有主持国家科研项目丰富经验，能有效执行及管理课题与项目，在本领域内具备良好可信度和影响力。本项目各个课题均有有关研究人员长期从事本领域研究基本，各种课题有关研究人员在各自领域获得过突破性成果，在病毒学、分子生物学、传染病学、免疫学等方面具备优势力量（详见七和八），研究内容和技术路线系统性强，起点高，基本好。
4、科学问题
本项目构成员在研究团队已有工作基本上、依照最新研究动态提出聚焦国际前沿核心性科学问题，学术思想和技术体系具备先进性和可操作性（见3.1 创新性）。
5、技术平台
本项目依托4个国家重点实验室，6个部门重点实验室或研究中心，以及满足病毒研究需要BSL-3/ABSL-3实验室和实验动物设施，已有相称规模和优良实验条件，具备完毕本项目所必备实验平台和设施设。
（五）课题设立
课题间关系
本项目将设臵 6 个课题，每个课题均以病毒感染和炎症反映致炎机制为研究中心，课题与课题之间既相对独立，又互相交叉；既在各自研究领域有创新性，又对其他课题有指引和借鉴作用。可以说，是一种立项明确、创新点和特色突出、整合性强总体研究方案。 各课题之间互有关系如图1所示

图1、课题设臵示意图（课题之间关系）
课题1 ： DNA病毒感染导致炎症反映规律
研究目的： 从分子生物学角度发现和拟定DNA病毒感染导致炎症反映普通规律。
研究内容： （1）确认HSV-1引起炎症反映有关宿主细胞和炎症因子。在前期工作基本上，进一步筛选并确认与疱疹病毒感染成分互相作用炎症细胞特异组分，并以此为基本，发现病毒感染诱发有关炎症因子表达和释放规律。验证HSV-1蛋白与炎症反映蛋白之间直接或间接互相作用，进一步研究它们互相作用所导致生物学功能，从而揭示两种病毒感染分别引起炎症反映分子机理。比较同属疱疹病毒科两种不同病毒感染所导致互相作用差别和共同之处，进一步分析它们感染过程分子机制。 （2）HSV-1蛋白与细胞炎症因子互相作用引起炎症反映信号通路和其有关分子机制发现与拟定。研究病毒蛋白与信号通络直接或间接互相作用有助于更好理解该病毒引起体内炎症反映分子发生机制。采用典型分子生物学互作和定位手段，确认HSV-1组分与细胞炎症因子配体和受体、胞内炎症信号传播分子，进一步研究病毒蛋白对抗原呈递过程、信号通路传递、炎症反映限度等影响。最后构建HSV-1引起炎症反映信号通路和也许分子机制，探讨信号通路活化或抑制对病毒感染进程影响。 （3）HSV-1编码病毒蛋白对炎症发生协同作用。比较同属疱疹病毒科两种不同病毒HSV-1感染细胞，在相似信号传导通路下所产生不同炎症反映过程及限度，利于研究两者在感染过程中异同，寻找治疗由于感染而致病办法。采用干扰特定炎症分子或信号通路手段，理解这些有相似作用通路不同病毒致炎蛋白所产生正反馈或负反馈综合效应，最后构建一种DNA病毒分子诱发炎症反映初级网络模型。
经费比例： 15.5%
承担单位： 中华人民共和国医学科学院医学生物学研究所、武汉大学
课题负责人： 李琦涵
学术骨干： 刘奋勇、霍文哲、张莹、关振宏

课题2 ： RNA病毒感染导致炎症反映规律
研究目的： 探讨参加RNA病毒性炎症反映新调节因子及其分子作用机制；阐明RNA病毒对炎症信号通路影响及也许致病机制；对控制炎症反映及其导致病理损伤及应对病毒治疗提供理论根据。
研究内容： （1）通过病毒与宿主互相作用，研究宿主辨认登革病毒并产生验证反映规律，着重研究RNA病毒核酸及其编码蛋白通过与炎症信号通路中重要分子互相作用分子机制。 （2）研究登革病毒核酸及其编码蛋白通过与炎症产生或消除过程重要蛋白质互相作用，影响炎症转归从而导致严重病理性炎症反映规律。着重研究重要医学病毒编码蛋白对补体系统、花生四烯酸炎症因子调控 ，从而导致严重病理性炎症反映分子机制。 （3）研究宿主细胞表达LIGHT分子在登革病毒感染诱导炎症反映中对各种炎性细胞如单核/巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T细胞向炎症部位和引流淋巴结迁移作用；对免疫保护和免疫病理影响；并摸索其分子机制。 （4）运用改造登革病毒，建立果蝇微量注射感染模型，结合生物学信息模型预测候选基因，从事规模性与炎症信号通路有关活体遗传筛选，鉴定新参加RNA病毒炎症反映信号分子。拟定参加RNA病毒感染导致炎症反映新因子，并剖析该因子介导RNA病毒性炎症反映新通路和新机制，揭示RNA病毒感染导致炎症反映及起转归规律；阐明先天性免疫应答与炎症小体信号传导途径互相交联分子机制。
经费比例： 13.8%
承担单位： 中华人民共和国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所、中华人民共和国科学院生物物理研究所
课题负责人： 曹诚
学术骨干： 钟辉、朱明昭、潘磊

课题3 ： 病毒非编码RNA调控炎症反映机制
研究目的： 探讨病毒或宿主非编码RNA在调控病毒感染导致炎症反映中作用及其机制；构建适合病毒非编码RNA转基因小鼠模型，从整体上研究病毒致炎机制。
研究内容： （1）进一步完毕对病毒基因组内非编码RNA预测和鉴定，分析非编码RNA及其启动子序列特性，探讨其在宿主细胞内表达调控方式。通过辨认病毒基因组内非编码RNA，鉴定其中miRNA以及可以与组蛋白甲基化酶结合非编码RNA，建立病毒非编码RNA与宿主之间互动关系，涉及调控宿主蛋白表达，以及调控宿主细胞组蛋白修饰；发掘新病毒蛋白翻译后修饰方式，探讨其对炎症有关信号通路影响；发现和拟定细胞表达非编码RNA在RNA病毒感染导致RIG-I炎症信号活化过程中所发挥调控作用和有关机制。 （2）鉴定病毒microRNA靶向宿主基因，并探讨这些基因编码蛋白对炎症反映调控。依照microRNA发卡状构造序列特性，运用生物信息学办法从病毒非编码RNA中辨认miRNA。然后从基因组数据库中搜索与miRNA序列匹配宿主靶基因，并通过荧光素酶报告系统，确认病毒miRNA对宿主mRNA调控。同步，运用表达谱基因芯片技术，研究病毒miRNA对宿主细胞转录组调控，并探讨病毒miRNA所致细胞因子风暴。在这些实验基本上，挑选恰当miRNA构建转基因小鼠模型，从整体上研究病毒miRNA致炎机制及其生物学效应。 （3）辨认对宿主表观遗传学修饰有调控作用病毒非编码RNA，并探讨这些非编码RNA致炎机制。通过RNA免疫沉淀（RIP）以及RNA pull-down办法，分别在体内和体外鉴定能与组蛋白甲基化酶结合病毒非编码RNA。运用ChIP-seq办法研究病毒非编码RNA对宿主组蛋白修饰调控。同步，辨认受病毒非编码RNA调控基因启动子序列模式。在这些研究基本上，以炎症有关信号通路为出发点，研究病毒非编码RNA对SOX6-p21waf1、JAK-STAT以及MAPK信号通路影响，并探讨病毒感染对炎症反映网络调控。 （4）发掘新病毒蛋白翻译后修饰方式，阐明其对干扰素信号通路调控机理。从病毒感染细胞中纯化病毒M1和NP蛋白，通过质谱分析M1和NP磷酸化、泛素化位点，并寻找病毒蛋白发生磷酸化作用激酶和发生泛素化E3连接酶。阐明M1、NP蛋白磷酸化和泛素化对病毒非编码RNA调控，探讨病毒蛋白翻译后修饰对病毒生物学特性、致病力及免疫力影响，明确其对干扰素信号通路调控。
（5）建立病毒非编码RNA致炎转基因小鼠模型，从整体角度探讨病毒对炎症发生、发展过程调控。构建适合于研究病毒非编码RNA与宿主嗜性细胞和免疫细胞互相作用致炎转基因小鼠模型。建立病毒非编码RNA转基因小鼠品系，并对转基因小鼠进行有关病理分析。之后，从整体动物水平上，探讨病毒非编码RNA对炎症有关信号通路影响，以及对促炎因子和血管生成因子表达调控，进一步理解病毒致炎机制。同步，咱们也将运用构建小鼠模型，开展小分子药物筛选有关工作，为具备自主知识产权新药创制提供基本支持。 （6）在RNA病毒感染导致胞内RIG-I炎症信号途径活化过程中，研究胞内miRNA表达谱变化，发现此类miRNA对RIG-I信号调控作用及机制。通过揭示和分析巨噬细胞miRNome，发现巨噬细胞富集表达miRNA，研究其对病毒感染导致RIG-I炎症信号活化调控作用及有关机制。明确在病毒感染导致胞内RIG-I炎症信号活化过程中胞内lncRNA表达谱变化，揭示此类lncRNA对RIG-I炎症信号途径调控作用及机制。在炎症因子如IL-6和TNF-α等下游信号活化过程中，发现胞内非编码RNA表达谱变化，明确此类非编码RNA在IL-6和TNF-α等炎症因子下游信号途径中调控作用及有关机制。
经费比例： 20.7%
承担单位： 中华人民共和国科学院微生物研究所、中华人民共和国人民解放军第二军医大学、北京大学
课题负责人： 陈帅
学术骨干： 侯晋、鲍嫣、鲁凤民、罗广湘、刘晓玲、高诗娟

课题4 ： 病毒感染导致炎症反映生物学效应
研究目的： 掌握病毒感染导致炎症细胞因子产生基本规律，发现和鉴定一系列诱导ADE效应病毒增强型表位，明确模式辨认信号分子调控ADE基本过程，阐明其诱导炎症反映分子机理，为抗病毒药物和新型疫苗研究提供新靶标。 研究内容： （1）登革病毒体内外ADE模型建立。登革病毒ADE效应重要与未成熟病毒颗粒关于，为建立有效ADE模型，一方面采用弗林蛋白酶缺陷型人LoVo细胞或蚊C6/36细胞增殖登革病毒产生大量未成熟病毒颗粒。采用表面Fc受体阳性人单核/巨噬细胞K562、U937或THP-1细胞，将相应抗体进行系列倍比稀释后与制备未成熟登革病毒混合孵育，然后加入到上述细胞中进行感染；阴性对照采用未感染细胞组，阳性对照采用无抗体病毒感染组。分别采用流式细胞术、实时定量PCR、蚀斑形成实验评价不同抗体稀释度对病毒复制影响，计算感染增强倍数，拟定相应抗体ADE活性。一方面使用登革2型病毒皮下免疫小鼠，8周后采集血清，测定中和抗体水平和体外ADE活性。然后选取适当浓度抗血清皮下接种AG129基因敲除小鼠，正常鼠血清作为对照，进而使用不同剂量登革1型病毒袭击，监测血清中TNF-α和IL-10等水平和病毒载量，观测重要脏器病理变化，记录14d内各组小鼠死亡率，通过生存分析拟定其ADE效果。 （2）ADE条件下干扰素信号分子调控炎症反映机制。分别在不同正常感染和ADE条件下，观测登革病毒感染单核/巨噬细胞以及PBMC细胞后诱导I型干扰素反映和炎性细胞因子水平，病毒感染对JAK1、Tyk2、STAT1/2/3等信号分子影响及与病毒载量动态关系；分析单核/巨噬细胞以及PBMC等模式辨认受体TLR3、TLR7/8等表达水平，检测上清中IFN-α、炎性细胞因子水平和子代病毒产量。重点针对IL-10等采用抗体封闭或siRNA敲除等办法，观测其对登革病毒ADE感染调控作用，