氧诱导视网膜病变模型小鼠肾组织代谢组学研究.pdf

CD01:10.3760/cma5989-20220526-00248实验研究.19.中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期Chin JExp Ophthalmol,January2024,Vol.42,No.1氧诱导视网膜病变模型小鼠肾组织代谢组学研究董利军祁慧杨宇航毛星星张国明张少冲雷和田深圳市眼科医院暨南大学附属深圳眼科医院深圳市眼病防治研究所，深圳518 0 40通信作者：雷和田，Email：le ih e t ia n 18 h o t m a il.c o m【摘要】目的探讨高氧环境对氧诱导视网膜病变（OIR）模型小鼠肾脏代谢物的影响，了解病理性视网膜血管新生和肾损伤之间的潜在机制。方法采用随机数字表法将16 只健康SPF级C57/B6J新生小鼠随机分为OIR组与正常对照组，每组8 只。小鼠自出生后标准饲养至第7 天（P7），O I R 组小鼠和母鼠置于（7 52）%的高氧箱中饲养至P12,然后正常饲养；正常对照组一直在正常环境下饲养。各组小鼠在饲养P17时采用二氧化碳安乐死，取视网膜组织铺片并行血管异凝集素（IB4）染色，观察视网膜血管形态、中央无灌注区及病理性新生血管情况；另取小鼠肾组织进行液相色谱-质谱分析，取其对应小鼠的全血进行抗凝处理，通过离心沉淀，获得不含细胞成分的血浆，对血浆进行靶向代谢组学分析。使用代谢组学数据处理软件ProgenesisQIv2.3对质谱信息进行解析，用无监督的主成分分析及正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）来区分各组间代谢轮廓的总体差异，比较2 个组间代谢物的倍数变化。以变量权重值 1且P0.05为条件筛选出差异代谢物。基于KEGG数据库对差异代谢物进行代谢通路富集分析。结果视网膜铺片IB4染色结果显示，P17时正常对照组小鼠视网膜血管分布均匀；OIR组小鼠视网膜周边血管迁曲、紊乱，中央可见大面积无灌注区域形成，在视网膜无灌注区和血管区交界处形成大量新生血管簇，呈强荧光染色。OIR组小鼠视网膜无灌注区相对面积为（2 5.16 3.50）%，明显大于正常对照组的（0.6 30.30）%，差异有统计学意义（t=12.0 7,Pl and P value0.05 was used to screen out differential metabolites.Metabolic pathway enrichmentanalysis of differential metabolites was performed based on the KEGG database.The feeding and use of animals werestrictly in accordance with the requirements of the Ethics Committee of Jinan University,and the research protocol wasreviewed and approved by the Ethics Committee of Jinan University(No.20200401-54).ResultsThe IB4staining of retinal wholemounts showed that the retinal blood vessels were evenly distributed in the P17 mice fromcontrol group.The peripheral retinal vessels were tortuous and disordered with a large non-perfusion area in centralregion in P17 mice from OIR group,and a large number of neovascularization clusters were formed at the junction ofthe nonperfusion area and the vascular area of the retina,showing strong fluorescent staining.The relative area ofretinal nonperfusion area in 01R group was(25.163.50)%,which was significantly larger than(0.630.30)%innormal control group(t=12.07,P1为筛选条件评估2 个组之间有差异的代谢产物及其倍数变化（foldchange,FC）。1.2.6肾组织代谢产物KEGG富集通路分析对筛选得到的差异代谢物利用其KECGID在KECG（h t t p：/w w w.k e g g.j p）数据库进行富集分析，应用超几何检验，找出与整个背景相比，在显著性差异表达代谢物中显著富集的代谢通路，以P0.05为阈值，满足此条件的代谢通路为在差异代谢物中显著富集的代谢通路，P值越小，则该代谢通路的富集越显著。1.3统计学方法采用SPSS22.0统计学软件进行统计分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以xs表示。OIR组与正常对照组间小鼠视网膜无灌注区相对面积、肾组织代谢产物差异倍数和血浆代谢产物的差异比较均采用独立样本t检验。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.12个组小鼠视网膜血管分布及无灌注区相对面积比较视网膜铺片IB4染色结果显示，正常对照组P17小鼠视网膜血管均匀分布于整个视网膜，血管走行正常；OIR组小鼠视网膜中央出现大面积的无灌注区，与血管区界限明显，其分界处形成大量新生血管簇，血管走行紊乱（图1）。OIR组视网膜无灌注区相对面积为（2 5.16 3.50）%，明显大于正常对照组的（0.6 30.30）%，差异有统计学意义（t=12.07,P1为筛选标准，共筛选出组间差异代谢物2 36 个，其中表达上调134个，下调10 2 个（图4）。2.32个组小鼠肾组织差异代谢物的鉴定及分层聚类分析对筛选的VIP值 1结合t检验中P0.05的差异代谢产物标准在HMDB、Li p i d m a p s、M ET LIN以及自建库进行比对鉴定，得到2 6 种有意义的化合物（表1）。OIR组小鼠肾组织中甘油磷脂类化合物PC20：4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0和PC22:6(4Z,7Z,10Z,R2=(0.0,0.9)Q2=(0.0,-0.488)1001000050(%8:81)100d5000(%t1)2d00.R2Q2-50-5000-100-10.000-1000100-10000010.0000.000.250.500.751.00PC1(24.1%)APC1(21%)200permutations1componentsC图2 2 个组小鼠肾组织代谢产物分析图A：PC A 表达的代谢产物总体分布图B:OPLS-DA测试的代谢轮廓图C:RPT的反应排序图蓝色矩形和红色三角分别代表正常对照组小鼠肾组织样本和OIR组肾组织小鼠样本Figure 2Metabolites analysis diagram of mice renal tissues in different groupsA:Overall distribution of metabolites by PCAB:Metabolite profileby OPLS-DA test C:RPT reaction sequence diagram The blue rectangle represented mouse kidney tissue samples from normal control group,while thered triangle represented the kidney tissue mouse samples from OIR group0.471.0PC14:1197.1/20-2(11Z-147.)PEP-18-0/204(6E.8Z.11Z.14Z)(SOHISI)0.59,tz15.Cktaga1rco.1-o0.2KS13:0V19.0PS18:0V19-0(H100)dPEP-1R-0/30:416E.X2B1Z,14Z)(SOHIS)0.0PC204(5Z8Z211Z.142)10.0L-HiA40PPC14:1(921/202(11Z.14Z)0.0A-Dhydro-2H-I-bPC2054(SZ.8Z,11Z.14ZNO.0-0.5-0.22-HylruirurtscaxidLyoPC00r160L-leyeudineA4-hhydro-2H-3-b-1.0-0.4-0.20.00.2-0.20.00.2PC1(21%)PC1(21%)图32 个组小鼠肾组织代谢产物OPLS-DA模型的载荷图和S-plot图A：载荷图图中每个点代表一种代谢物，代谢物距离载荷图中心的距离越远，载荷值越接近于-1或1，即该代谢产物作用愈大B:S-plot图横坐标是组间比较的代谢产物与影响的特征值，纵坐标是代谢产物得分。代谢产物越靠近右上角和左下角，表示组间差异越显著Figure 3 Loading plot and S-plot of OPLS-DA model of mice renal metabolites in two groups A:Loading plot Each dot represented a metabolite.The farther the metabolite was from the center of the loading plot,the load value was closer to-1 or l,indicating the greater effect of the metabolite wasB:S-plot diagram The horizontal coordinate was the characteristic value of the metabolites and effects being compared between groups,and the verticalcoordinate was the metabolite score.The closer the metabolites were to the upper right and lower left corners,the more significant was the difference betweengroups24：Chin J Exp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期8VIP611224下调无显著变化2上调P=0.050-6-3036log,(FC)图42 个组小鼠肾组织差异代谢产物火山图圆点越大提示VIP值越大，VIP值1且远离坐标轴原点者为优先考虑的潜在生物标志物VIP：变量权重值；FC：倍数变化Figure 4Volcano plot of differential metabolites in mice renal tissuebetween two groups of miceThe bigger the dot,the bigger the VIPvalue.Dots with a VIP value 1 and far from the origin of the axis werethe potential biomarkers with priorityVIP:variableimportantinprojection;FC:fold change13Z,16Z，19 Z)/0：0 代谢产物表达上调，PC14：1(9Z)/20:2(11Z,14Z)和PEP-18:0/20:4(6E,8Z,11Z,14Z)（50 H S）代谢产物表达下调。氨基酸类代谢物精氨酸、鸟氨酸、哌可酸和羟基赖氨酸代谢产物水平升高。分层聚类分析结果显示，相较于正常对照组，OIR组肾组织中氨基酸类代谢物精氨酸、鸟氨酸、哌可酸、脯氨酸和羟基赖氨酸含量及甘油磷脂类化合物PC14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z）、PEP-18:0/20:4（6 E,8 Z,11Z,14Z）（50 H S）含量均明显升高,PC20：4（5Z,8 Z,11Z,14Z)/0:0、PC 2 2:6（4Z，7 Z,10 Z,13Z,16 Z19 Z）/0：0 含量及嘌呤类（鸟嘌呤、羟嘌醇）和脂肪酸类（15-棕榈酸甲酯、2，6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-ol)含量均降低(图5)。表12 个组小鼠肾组织中主要差异代谢产物比较Table 1 Comparison of main differential metabolites in mouse kidney tissue between OIR group and normal control group代谢物分子式VIPLog2(FC)P值PC 14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)C42 H7sNO,P23.10-0.760.0001PEP-18:0/20:4(6E,8Z,11Z,14Z)(50HSJ)C43H7sNO:P21.87-0.92a0.0005L-isoleucineC,H13NO221.590.26b0.000 53,4-dihydro-2H-1-benzopyran-2-oneC,H0220.680.25b0.00042-hydroxycinnamic acidC,H0313.310.16h0.004.4L-histidinolC.H.N,O12.82-0.15a0.000 4PC 20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0C2.H5oNO,P11.380.27h0.000 8PC 22:6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0C3oHsoNO,P10.890.38b0.001 7L-pipecolic acidC.H.,NO29.080.28h0.000 3L-histidineC,H,N,O24.960.25b0.0001phosphoglycolic acidC,H,O,P3.910.10b0.000 4oxypurinolC,HAN,O23.890.32b0.0012guanosineCioHi3 N,O,3.49-0.74a0.0002L-ornithineC,H/2 N,023.470.46b0.001 015-methylpalmitateCi7 H 34 022.89-0.14a0.0003N-acetylmannosamineC,His NO.2.630.28h0.00205-hydroxylysineC,Hi4N,032.290.53b0.000 3guanineC,H,N,O2.21-0.70a0.000 12,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-olCi7H32 02.12-0.16a0.001 6N-acetyl-D-glucosamineC.H,sNO61.840.37h0.000 3L-arginineC,H.4N4O27.330.28b0.001 1L-glutamineC,HioN,O31.680.75h0.0045hypoxanthineC,H,N4O9.430.13b0.0100L-prolineC,H,NO210.700.22h0.0039adenosine monophosphateCloH,4N,O,P2.05-0.270.033 8adenosineC1oH/3N,O42.01-0.40a0.0453注：P值表示富集显著性a：下调产物；b：上调产物VIP：变量权重值；FC:倍数变化Note:P value indicated enrichment significance a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expressionVIP:variable importance of projection;FC:fold change25.ChinJExpOphthalmollanuary2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期OIR-1OIR-2OIR-3 OIR-4OIR-5OIR-6OIR-7OIR-8WT-1WT-2WT-3WT-WT-5 WT-6WT-WT-8L-prolineL-histidineL-arginine-pipecolicacidL-isoleucine03,4-dihydro-2H-1-benzopyran-2-one-glutamine2-hydroxycinnamicacidPc22:6(4Z,7,10Z,13Z,16Z,19Z)0:0L-ornithine5-hydroxylysineN-acetyimannosamineN-acetyi-D-glucosaminePC20:4(5z,82,11Z,14ZV0:0oxypurinolphosphoglycolicacidhypoxanthineadenosinemonophosphateadenosinePEP-18:0/20:4(6E,8Z.11Zz.14ZX50HS)PC14:1(9Z)/20:2(11Z,14Z)15-Methylpalmitate2.6,8.12-tetramethyi-2,4-tridecadien-1-olL-histidinolguanineguanosine图52 个组小鼠主要差异代谢产物聚类热图垂直轴代表代谢产物，水平轴代表不同样本组。红色表示代谢产物含量最高，蓝色表示含量最低，轴上的分叉越近说明相似度越高OIR：氧诱导视网膜病变；WT：野生型Figure 5 Clustering heat map of the main differential metabolites of mice between twogroupsThe vertical axis represented the metabolites,and the horizontal axis representeddifferent sampling groups.Red color indicated the highest level of metabolites,and blue colorindicated the lowest level.Closer bifurcations on the axes indicated higher similarityOIR:oxygen-induced retinopathy;WT:wild type2.42个组小鼠肾组织中差异代谢产物KEGG通路富集差异代谢物KEGG通路富集分析结果显示，差异代谢产物的前10 个富集通路主要涉及ABC转运蛋白、嘌呤代谢、癌症中的胆碱代谢、氨酰-tRNA生物合成、mTOR信号通路、精氨酸生物合成、蛋白质消化吸收、吗啡成瘾、癌症中的中心碳代谢、cGMP-PKG信号通路(图6)。ABCtransportersPurinemelabolismCholinemetabolism incancerAminoacyl-tRNAbiosynthesisNumbermTORsignalingpathwayArgininebiosynthesisProteindigestionandabsorption3Morphineaddiction5Centralcarbonmetabolismincancer7cGMP-PKG signalingpathwayPyrimidinemetabolismP值D-Arginineand D-ornithinemetabolismNeuroactive ligand-receptorinteraction0.04Regulationof lipolysis inadipocytesSphingolipidsignalingpathway0.03Reninsecretion0.02Glycerophospholipidmetabolism0.01ParkinsondiseasecAMP signalingpathwayPl3K-AktsignalingpathwayPantothenateand CoA biosynthesis0.10.20.30.40.5富集因子图6 2 个组小鼠主要差异代谢产物排名前2 0 KEGG富集通路气泡图富集因子越大，提示富集程度越高；气泡点越大，说明该通路上发生变化的代谢物越多Figure 6TOP 20 KEGG enrichment pathways bubble diagram ofmain differential metabolites between two groups of miceA largerenrichment factor indicated a higher level of enrichment.The larger thebubble point was,the more metabolites were changed in that pathway2.5小鼠血浆氨基酸类代谢产物的靶向鉴定根据VIP值结合t检验P0.05的标准对小鼠血浆氨基酸类代谢产物在HMDB、Lipidmaps、M ET LIN以及自建库比对鉴定得到11种具有明显差异的主要氨基酸类代谢物。与正常对照组比较，OIR组小鼠血浆内天冬酰胺和丁酰肉碱的代谢水平降低,缬氨酸、酪氨酸、亚油基肉碱、半胱氨酸、十四碳二烯酰肉碱、丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和癸二烯酰肉碱的代谢水平明显升高（表2）。KEGG通路分析表明，这些代谢产物主要富集在氨酰-tRNA生物合成，精氨酸生物合成，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,泛酸和CoA生物合成，癌症中的中心碳代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解，ABC转运蛋白等信号通路(图7)。3讨论ROP是一种以视网膜缺血、病理性新生血管形成为特点，发生于早产儿和低出生体重儿的不可逆致盲视网膜病变，主要特征是玻璃体中VEGF表达水平上调，但其具体发病机制尚未完全阐明。有研究发现，大鼠OIR模型中同时存在高氧诱导的肾生成受损机制，认为其可能是由活性氧和VECF-A引起的微血管生成改变所致。VECF在维持正常肾功能方面也起着至关重要的作用，从足细胞释放的VECF与肾小球毛细血管上的VEGF受体2 相互作用，促进内皮孔的完整性和维持由此产生的肾小球屏障功能2 1，而缺氧会诱导VECF分泌，充足和适量VECF的产生和血管生成对肾脏和眼组织正常功能的维持是必要的，但高水平的VEGF会导致血管过度生成，从而导致ROP、糖尿病视网膜病变和肾病等的发生2-24。而以 OIR小鼠为研究对象，用代谢组学的方法探寻高氧导致肾损伤的机制，可以从人体的整合医学角度为ROP的发病机制研究提供新的思路。本研究中，OIR小鼠肾组织匀浆中氨酰-tRNA生物合成相关的代谢物表达增多。已有研究显示,ROP患者和OIR模型大鼠的血浆中、OIR模型小鼠的视网膜匀浆中氨酰-tRNA生物合成通路代谢物发生变化 17.2 0,2 5 。同时有研究报道白内障合并糖尿病患者房水中氨酰-tRNA生物合成通路代谢物发生变化2 6 在秀丽隐杆线虫的正向遗传筛选得到的编码氨酰-tRNA合成酶的基因合成酶的rrt-1,敲除rrt-1和大多26Chin J Exp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期表2OIR组与正常对照组小鼠血浆主要氨基酸类差异代谢物比较Table2Comparison of differential amino acid metabolites in mouse plasmabetween OIRgroup and control group代谢物分子式VIPLog2FCP值asparagineH,NCOCH,CH(NH,)CO,H3.21-0.2840.0037valine(CH,),CHCH(NH,)CO,H2.620.62h0.0007tyrosine4-(HO)C,H,CH,CH(NH,)CO,H2.541.04h0.000.7linoleylcarnitineC25,H4sNO42.430.66h0.0005cysteineHSCH,CH(NH,)CO,H2.320.61b0.0026butyrylcarnitineC.H2;NO42.26-0.58a0.0028tetradecadienoylcarnitineC2,H4INO42.160.84b0.0001alanineC,H,NO21.840.99b0.001 3citrullineC,Hi3N,O31.700.24h0.004 2tryptophanCiHi2 N,021.320.39h0.004 3decadienoylcarnitineC,H2,NO41.070.20b0.046 9注：a：下调产物；b：上调产物OIR：氧诱导视网膜病变；VIP：变量权重值；FC：倍数变化Note:a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expressionOIR:oxygen-inducedretinopathy;VIP:variable importance of projection;FC:fold changeWT-1WT-2WT-3WT-4WT-5 WT-6WT-7WT-8OIR-1OIR-2OIR-3OIR-4 OIR-5OIR-6OIR-7OIR-82asparaginebutyryicarnitine1decadienoyicarnitinecysteine0tyrosinetetradecadiencyicarnitine-1citrultinevaline-2alaninefinoleylcamitinetryptophan3.53.02.52.01.51.00.50.0nthesisnthesisabolismnthesis5biosylismincancernate011COABCtransportersuCInargininebiosyOandgluhenatearaminoacyl-tRNAbiosynthesiscapantothecentral,leucine and isoleucinedegradation,aspartateavaline,leucineand isolvaline,alanine,B图7 2 个组小鼠血浆主要差异代谢产物聚类热图和KEGG通路分析A：小鼠血浆主要差异代谢产物聚类热图B：代谢通路富集图WT：野生型；OIR：氧诱导视网膜病变Figure 7 Clustering heat map and KEGG pathway analysis of the main differentialmetabolites in plasma between two groups of miceA:Clustering heat map of the maindifferential metabolites in mouse plasma B:Enrichment map of metabolic pathwaysWT:wildtype;OIR:oxygen-induced retinopathy数其他编码氨酰-tRNA合成酶的基因，可以使动物免于缺氧诱导的死亡2 7 因此，高氧诱导肾损伤的发病可能与氨酰-tRNA的生物合成有关。本研究中，OIR组小鼠肾组织匀浆中精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸和脯氨酸表达增多，这4种氨基酸是“精氨酸和脯氨酸代谢途径”的重要组成部分。Lu等18 认为精氨酸和脯氨酸代谢是造成大鼠血管增生的主要途径。Wang 等2 8 研究结果表明，GCN2/ATF4通路通过氨基酸介导的VEGF表达促进肿瘤生长和血管生成，而限制氨基酸通过GCN2/ATF4途径诱导血管生成能够调节VEGF和H2S的产生2 9 。此外,氨基酸剥夺能够诱导人视网膜色素上皮细胞株VEGF的表达30 。因此,氨基酸及其相关途径可能在高氧诱导肾损伤的发病中发挥重要作用,而在OIR小鼠血浆样本靶向氨基酸代谢组学中,精氨酸生物合成通路同样富集大量差异代谢物，表明在高氧诱导下肾损伤与视网膜病变的发病机制可能具有相似性。进一步的研究需要揭示氨基酸代谢的功能和机制以及这些交叉参与的途径在视网膜新生血管中的作用。本研究结果还显示，OIR组小鼠血浆中蛋白质的消化与吸收通路发生改变,与既往对ROP患者血浆和OIR小鼠视网膜的代谢组学分析结果一致1-1.31。蛋白质的消化和吸收在促进早产儿发育和降低早产儿患病风险方面起着重要作用32 。本研究还发现OIR小鼠肾匀浆中的ABC转运蛋白相关代谢产物大量富集，ABC转运蛋白是在长期进化中形成的高度保守的一大基因家族编码的一类跨膜蛋白，含有负责多种底物跨细胞膜运输的膜蛋白。这些底物包括代谢产物、药物、毒素、内源性脂类、多肽、核苷酸和留醇3。在低氧状态下，已证实其对P-糖蛋白编码基因（ABCB1）的调节作用34。而ABCA1基因也在低氧诱导下在内皮细27：ChinJExpOphthaOJanuary2024.Vol.42.No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期胞中表达35】,其已经被证实能够通过介导ABCA1基因表达来抑制黑色素瘤血管生成和发展36 同时本研究还发现，OIR小鼠肾组织嘌岭代谢途径中代谢物发生变化,而在ROP相关的代谢物研究中未见报道，而嘌呤代谢途径可能与糖尿病微血管并发症的发生密切相关37 。本研究中代谢物腺苷含量降低,次黄嘌呤和黄嘌呤含量升高，嘌呤代谢循环中，腺苷被转化成腺嘌岭呤，然后脱氨形成肌苷，肌苷被转化为次黄嘌呤，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下被转化为黄嘌呤,黄嘌呤也是黄嘌呤氧化酶的底物，可增加超氧化物的生成。而超氧化物能够刺激机体新生血管生成3O总之,本研究确定了OIR小鼠肾组织匀浆中代谢谱的变化。通过生物信息学分析，ABC转运蛋白、嘌呤代谢途径、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成和蛋白质的消化与吸收是与发生改变的代谢物相关的主要KEGG途径。这些代谢物以及涉及的代谢途径，可能参与了肾损伤和视网膜新生血管疾病的病理过程。然而本研究中未能同时综合分析OIR小鼠血浆、视网膜以及肾匀浆样本代谢产物，不利于发现缺氧诱导的肾损伤和ROP发病机制之间的关联，还要通过化合物诱导以及基因敲除的方式在后续研究中对本研究筛选到的代谢物以及代谢通路进行验证，进一步探讨其具体的作用机制。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明董利军：参与酿和设计实验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、文章撰写；祁慧、杨宇航、毛星星：参与实施研究、采集数据；张国明、张少冲：参与实验设计及论文指导；雷和田：参与实验设计、论文审阅及定稿参考文献1 Daruich A,Bremond-Gignac D,Behar-Cohen F,et al.Retinopathy ofprematurity:from prevention to treatmentJ.Med Sci（Pa r i s),2 0 2 0,36(10):900-907.D0I:10.1051/medsci/2020163.【2 李曼红，王亮，张自峰，等.两种抗VECF药物治疗1型早产儿视网膜病变的疗效比较J.国际眼科杂志，2 0 2 1,2 1（5）：8 6 6-8 7 1.D01:10.3980/j.issn.1672-5123.2021.5.24.Li MH,Wang L,Zhang ZF,et al.Comparison of the effectiveness ofconbercept versus ranibizumab in the treatment of type 1 retinopathy ofprematurityJJ.Int Eye 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