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第 43 卷第 3 期2024 年 3 月中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant ResourcesVol.43 No.3Mar.2024施肥对东北春玉米根际土壤细菌群落结构的影响毛晓宁1，2，刘美玲1，2*，李然然3，谢惠春1，2，金兄莲1，2，姜迪1，2（1.青海师范大学 生命科学学院，青海 西宁 810008；2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海 西宁810008；3.东北农业大学 水利与土木工程学院，黑龙江 哈尔滨150000）摘要 目的：研究施肥对东北春玉米根际土壤细菌群落结构的影响，为东北春玉米土壤改良提供科学依据。方法：设置CK（对照，复合肥，65 cm 小垄种植）、KF处理（配方施肥，65 cm 小垄种植）、BMP处理（配方施肥，130 cm 大垄双行种植）3个处理，采用高通量测序技术，比较不同处理间土壤细菌群落结构组成和多样性。结果：CK、KF、BMP 3个处理共鉴定出1 372种细菌群落。在不同大小的垄间施用不同比例的肥料种植春玉米，均能提高土壤根际细菌群落组成和群落多样性；各处理土壤细菌指数排序为BMP KF CK；CK丰富度指数和Shannon指数与处理KF、BMP存在显著差异。优势细菌门水平结构组成分析中均表现为以变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）等为优势的细菌门类，优势细菌属水平结构组成分析中均表现为鞘氨醇单细胞属（Sphingomonas）、念珠菌固体杆菌属（Candidatus Solibacter）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）等为优势菌属；各处理土壤细菌群落在门水平上的PCA分析中CK相似度较低，BMP、KF处理相对聚集。结论：N P K比例为1 2 1、每亩（1亩=0.066 7公顷）施用掺混肥20 kg、耕作方式为65 cm小垄垄上种植春玉米对根际土壤细菌群落多样性的影响更为丰富，对维持作物健康生长具有重要作用。关键词 施肥；土壤细菌群落；高通量测序中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：1006-9690（2024）03-0034-05Effects of Fertilization on Bacterial Community Structure in Rhizosphere Soil of Spring Maize in Northeast ChinaMao Xiaoning1，2，Liu Meiling1，2*，Li Ranran3，Xie Huichun1，2，Jin Xionglian1，2，Jiang Di1，2（1.College of Life Sciences，Qinghai Normal University，Xining 810008，China；2.Qinghai Provincial Key Lab.of Medicinal Animal and Plant Resources on the Qinghai-Tibet Plateau，Xining 810008，China；3.College of Water Conservancy and Civil Engineering，Northeast Agricultural University，Harbin 150000，China）Abstract Objective：To investigate the effect of fertilization on the bacterial community structure of rhizosphere soil of spring maize in Northeast China，and provid scientific basis for soil improvement of spring maize in Northeast China.Methods：Three treatments were set up：CK（control，compound fertilizer，65 cm small ridge planting），KF treatment（formula fertilization，65 cm small ridge planting），BMP treatment（formula fertilization，130 cm large ridge double row planting）.High-throughput sequencing technology was used to compare the composition and diversity of soil bacterial community between different treatments.Results：A total of 1 372 bacterial communities were identified in 3 treatments.Applying different proportions of fertilizer between different sizes of ridges to plant spring maize can improve the composition and diversity of soil rhizosphere bacterial communities.The soil bacterial index of each treatment was ranked as BMP KF CK.The richness index and Shannon index of CK were significantly different from those of KF and BMP.In the analysis of the dominant bacdoi：10.3969/j.issn.1006-9690.2024.03.005收稿日期：2023-03-29，录用日期：2024-03-04基金项目：国家自然科学基金地区项目（32260284）；青海省科技厅基础研究计划青年项目（2023-ZJ-956Q）。作者简介：毛晓宁（1998-），男，硕士研究生，研究方向为生态学。E-mail：*通讯作者：刘美玲（1988-），女，副教授，博士，研究方向为荒漠生态学。E-mail： 34第 3 期毛晓宁，等：施肥对东北春玉米根际土壤细菌群落结构的影响terial phylum-level structural composition，the results consistently showed a dominance of the phyla Proteobacteria，Acidobacteria，and Actinobacteria.At the genus level of dominant bacteria，the prevalent genera included Sphingomonas，Candidatus Solibacter，and Gemmatimonas.The PCA analysis of the soil bacterial communities at the phylum level indicated a lower similarity in the control（CK），while the BMP and KF treatments clustered more closely.Conclusion：When planting spring maize in Northeast China，using 65 cm spaced ridges，applying 20 kg of blended fertilizer per Mu（0.066 7 hectares）with an N P K ratio of 1 2 1，enhanced the diversity of the rhizosphere soil bacterial community，thereby promoting healthy crop growth.Key words Fertilization；Soil bacterial communities；High-throughput sequencing土壤细菌在土壤微生物中数量最多、分布最广，是土壤生态系统最重要的组成之一，适应环境能力较强1；此外，土壤微生物通过化学信号为作物生长获取必须营养物质，也是碳、氮元素循环体系的驱动因素2；土壤细菌多样性和丰富度在提高土壤肥力、促进作物健康生长中发挥重要影响3-4。作物土壤细菌群落结构组成、群落多样性与土壤微生物环境有着密切的关系，环境因子和耕作方式都能影响作物土壤细菌群落结构和多样性，同时对土壤系统结构功能、土壤肥力和作物健康生长有着重要的影响5-6。通过高通量测序技术对作物土壤细菌的研究表明，根际微生物释放激素及应激信号调控等能够保护作物免受病原侵害，促进作物健康生长，提高其抵抗性7；同时合理施肥能有效提高作物土壤中的细菌多样性和丰富度8，进而提高土壤中的细菌总量并促进土壤碳氮的有效循环转化9-10。东北半湿润平原区巴彦县农业发达，盛产玉米、大豆等经济作物。为提高土地质量，按照土地平整、土壤肥沃的要求，加快建设旱涝保收、高产稳产的高标准农田。研究设计在土壤肥沃、耕性好的黑土型土壤进行不同大小垄间、施用不同比例元素（N/P/K）肥种植春玉米。研究不同施肥类型对春玉米根际土壤细菌变化的影响，以期为东北春玉米土壤改良提供科学依据。1材料与方法1.1试验地概况巴彦县农业科学研究所示范园区（455428 464018N、1264553 1274216E）位于黑龙江省哈尔滨市的近郊县，其地势东北高、西南低，平均海拔在132 m左右，属中温带性季风气候，四季分明，日温差较大。年均气温在2.9左右。太阳辐射丰富，年均日照在2 640 h左右。累计平均降水量560 mm，最小降水量为372.5 mm，全年无绝对霜期。1.2实验设计1.2.1实验处理本研究于2020年在巴彦县农业科学研究所示范园区设置700 cm 520 cm的监测小区，土壤质地为重壤土，土壤类型为黑土型。共设置3个梯度处理，分别用CK（对照）、KF、BMP处理表示，每个处理3次重复。CK（对照）施用45%撒可富复合肥，即N 15%、P 15%、K 15%，每亩（1亩=0.066 7 公顷）施用 25 kg，耕作方式为 65 cm 小垄垄上种植。KF、BMP处理采用配方施肥，46%尿素、46%重钙、50%硫酸钾配比，N P K比例为1 2 1，每亩施用掺混肥20 kg。其中KF处理耕作方式为65 cm小垄垄上种植；BMP处理耕作方式为130 cm大垄垄上种植双行。3个梯度处理均为人工开沟均匀撒施，种植密度为每亩保苗3 350株。1.2.2取样分析于2020年5月10日在监测小区种植东北主产的春玉米，种植期间以穴施方式在各处理间施不同量的肥，于次月 20日追施相同量的肥；并于当年 9月27日收获已成熟的春玉米。在施肥工作期间，将按期调查监测小区中存在各种因素下破坏垄等情况，并采用抖土法采集移栽后的根际土壤样品，随机采集不同处理不同重复的土壤样品，将采集的样品立即存于液氮中保存带回实验室，取出样品封存于干冰中邮寄测序公司（上海美吉生物医药科技有限公司）提取DNA，对春玉米的根际土壤细菌群落进行高通量测序。1.2.3测定方法1.2.3.1土壤微生物细菌DNA的提取使用土壤DNA提取试剂盒（上海美吉生物医药科技有限公司）对3个处理细菌提取DNA后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，并用超纯水稀释至 1 ng/L。35中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷1.2.3.2PCR扩增及测序使 用 引 物 338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）对16SrRNA基因V3 V4可变区进行PCR扩增，扩增后，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯化后利用HiSeq的高通量测序平台进行测序分析。1.2.4数据处理采用 Microsoft Excel 2010 软件进行数据记录整理并绘图，并用IBM SPSS Statistics 23软件进行单因素方差分析。2结果与分析2.1测序质量分析3个处理样品经过测序共获得239 759条原始序列数，经过双端序列质控，拼接后产生239 081条有效序列数，占原始序列数的 99.72%；在相似度97.0%水平下进行聚类，共获得 1 372 个 OTUs（表1），并且得到各等级的物种类型数目为1界25门68纲145目224科342属。细菌OTUs丰度的稀释曲线随着测序数量的增加其斜率先逐渐减小后平坦（图1），说明此次数据合理。2.2土壤细菌分布通过韦恩图（图2）可以发现，CK、KF、BMP 3组细菌群落处理共鉴定出了1 372种细菌群落，其中对照组CK有3种独有细菌群落，KF处理有25种独有细菌群落，BMP 处理没有独有细菌群落。并且CK与KF处理有15种共有细菌群落，同KF与BMP处理拥有共有细菌群落数量相同，CK与BMP处理有 5 种共有细菌群落，3 个处理共有 1 309 种细菌群落。2.3土壤细菌群落多样性分析通过评估群落丰富度 Chao1指数和 ACE指数来评估群落多样性 Simpson 指数和 Shannon 指数，施肥对春玉米根际土壤细菌群落多样性的影响见表2，结果表明，各处理土壤细菌指数排序为BMP KF CK；对照组CK的丰富度指数和Shannon指数与KF、BMP处理存在显著差异，而Simpson指数无显著差异。2.4土壤细菌群落组成和结构分析2.4.1优势菌门分析对不同施肥处理下春玉米根际土壤中优势细菌在不同分类水平进行组成分析。3个处理组在门水平上细菌群落相对丰度如图3所示，优势细菌相对丰度排序依次为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）、浮霉菌门（Planc表 1春玉米根际土壤样品数据表Tab.1Data table of rhizosphere soil samples from spring maize处理CKKFBMP原始序列数79 87780 07379 809有效序列数79 65379 83679 592图1春玉米根际土壤细菌OTUs丰度稀释曲线Fig.1Dilution curve of bacterial OTUs abundance in rhizosphere soil of spring maize表 2施肥对春玉米根际土壤细菌群落多样性影响Tab.2Effects of fertilization on diversity of bacterial communities in rhizosphere soil of spring maize处理CKKFBMPSimpson指数0.97 0.02a0.99 0.01a0.99 0.01aChao1指数1 268.97 23.16b1 304.24 10.63a1 310.74 13.54aACE指数1 262.41 19.2b1 289.73 1.48ab1 300.32 18.8aShannon指数7.67 0.56b8.41 0.06a8.50 0.08a注：表中数据为平均值 标准差；多重比较用Duncan法；不同字母表示在P KF BMP，酸杆菌门相对丰度排序为BMP CK KF，其他菌门相对丰度较CK有所增加。2.4.2优势菌属分析3个处理组在属水平上主要细菌群落相对丰度如图4所示，按优势细菌属相对丰度排序依次为鞘氨醇单细胞属（Sphingomonas）、uncultured_bacterium_o_Acidobacteriales、念珠菌固体杆菌属（Candidatus_Solibacter）、Candidatus_Udaeobacter、uncultured_bacterium_f_SC-I-84、uncultured_bacterium_ c_Subgroup_6、Alkanindiges、uncultured_bacterium_ o_Gaiellales、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和uncultured_bacterium_f_Gemmatimonadaceae，各 处 理 优势细菌属相对丰度之和均在42.6%52.5%之间，与对照组 CK相比，处理 BMP与处理 KF相对丰度之和分别减少了 8.7%和 9.9%。各施肥处理中，鞘氨醇单细胞属相对丰度排序为CK BMP KF，芽单胞菌属相对丰度排序为BMP KF CK。2.5土壤细菌群落多样性分析施肥对春玉米根际土壤细菌群落的主成分分析（Principal component analysis，PCA）结果见图5，第1主成分（PC1）样品差异性贡献率为74.73%，第2主成分（PC2）样品差异性贡献率为13.09%，合计达到87.82%。CK处于PC1和PC2的正值区域，KF处理处于PC1的正值区域和PC2的负值区域，BMP处理处于PC1的负值区域和PC2的正值区域，表明主成分之间存在一定的变异性且差异显著。3讨论3.1施肥对土壤细菌群落多样性的影响施肥对经济作物春玉米生产是非常重要的措施，采用高通量测序技术对春玉米根际土壤细菌的组成与多样性等分析发现，3个处理样品经过测序共获得239 759条原始序列数，239 081条有效序列数，并且土壤样品稀释曲线随着测序数量的增加其斜率先逐渐减小后趋于平缓；研究中的物种数量没有显著增加，说明采用高通量测序技术分析施肥对东北春玉米根际土壤细菌群落结构组成和多样性是可行的。不同施肥处理下东北春玉米根际土壤细菌群落结构组间差异分析表明，根系细菌对作物的健康生长及适应性至关重要11。刘魁等12研究表明，配施不同肥能够提高土壤细菌多样性指数，且能提高微生物OTUs数量以及丰富度指数。本文在分析根际土壤细菌时发现土壤微生物OTUs数量、丰富度指数和多样性指数随着施肥比例升高均有所增加，说明施肥能够提高春玉米根际土壤细菌多样性和丰富度指数，这与刘魁等研究结果一致。土壤细菌多样性和丰富度指数的增加有助于提高土壤细菌群落的稳定性。不同类型的作物由于根系分泌物的差异导致作物根际土壤周围细菌群落可利用的底物也产生了较大的差异，影响了土壤细菌的生长图4各处理土壤优势细菌属水平结构组成Fig.4The horizontal structure composition of the dominant bacterial genus of each treatment soil图5各处理土壤细菌群落在门水平上的PCA分析Fig.5PCA analysis of bacterial communities in soil of each treatment at the phylum level图3各处理土壤优势细菌门水平结构组成Fig.3The horizontal structure composition of the dominant bacterial phylum of each treatment soil 37中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷代谢13。本研究对春玉米根际土壤优势细菌门水平结构组成分析发现，各处理间均以变形菌门、酸杆菌门和放线菌门相对丰度最高，相对丰度之和高达97.6%，这与前人研究结果类似14-16，说明各处理间优势菌门存在较宽的生态位，能够适应各种生存环境，只是所占比例不同。研究表明，酸杆菌门相对丰度代表着土壤贫瘠状况，其丰富度与土壤质量呈负相关，丰富度越低则能说明土壤质量越高17-18；而放线菌门大多是腐生菌，通过降解复杂的木质素与纤维素来提高土壤养分含量，且可以参与土壤物质循环和能量转换19，能够提高土壤养分、促进碳代谢和同化、周转有机质等20；本研究组间分析结果发现，各处理组变形菌门相对丰度排序为CK KF BMP，酸杆菌门相对丰度排序为BMP CK KF，KF处理的优势细菌门可更有效地适应种植条件。3.2施肥对土壤细菌群落组成和结构的影响对春玉米根际土壤优势细菌属水平结构组成分析发现，各处理间均以鞘氨醇单细胞属、念珠菌固体杆菌属、芽单胞菌属等为优势菌属，且优势菌属相对丰度之和高达52.5%；经前人研究，鞘氨醇单细胞属可用于芳香化合物的生物降解，并有较高的代谢能力21；芽单胞菌属能够降解复杂大分子中的有机化合物22；各处理中鞘氨醇单细胞属相对丰度排序为CK BMP KF，芽单胞菌属相对丰度排序为 BMP KF CK。土壤中放线菌门鞘氨醇单细胞属显著促进经济作物健康生长。各处理土壤细菌群落在门水平上的PCA分析结果显示，各处理间CK样点距离较分散，相似度较低，可能是因为取样不均一导致的，BMP、KF处理较聚集，说明组内重复性较好，土壤样本数据较相似，且施肥条件下根际土壤细菌群落组成及相对丰度有较大的变异差异。综上所述，KF处理下春玉米根际土壤具有较好的营养环境，对维持作物健康生长具有重要作用，并为进一步开展施肥对东北经济作物种植的研究提供理论依据。参考文献:1 蒋梦芸.农田土壤微生物群落对长期玉米秸秆还田的响应研究 D.重庆：重庆三峡学院，2021.2 李孟芝.三七不同生育期根际土壤微生物组研究 D.武汉：湖北中医药大学，2020.3 徐丽霞.谷田土壤微生物多样性及对谷子生理生化和产量的影响 D.太原：山西大学，2019.4 孙峰，田伟，张菲，等.丹江口库区库滨带植被土壤细菌群落多样性及 PICRUSt 功能预测分析 J.环境科学，2019，40（1）：421-429.5 Morgan J A W，Bending G D，White P J.Biological costs and benefits to plantmicrobe interactions in the rhizosphere J.Journal of Experimental Botany，2005，417：1729-1739.6 Young I M，Crawford J W.Interactions and self-organization in the soil-microbe complex J.Science，2004，304（5677）：1634-1637.7 Lu T，Ke M J，Pei J B，et al.Investigation of rhizospheric microbial communities in wheat，barley and two rice varieties at the seedling stageJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2018，66（11）：2645-2653.8 杨德廉，李祥英，马夙静，等.有机肥施用对烟田土壤细菌多态性的影响 J.中国烟草科学，2018，39（3）：31-38.9 张云伟，徐智，汤利，等.不同有机肥对烤烟根际土壤微生物的影响 J.应用生态学报，2013，24（9）：2551-2556.10丁梦娇，黄莺，易维洁，等.施用有机肥对植烟土壤氮素转化与功能微生物的影响 J .西南农业学报，2016，29（5）：1166-1171.11Haney C H，Samuel B S，Bush J，et al.Associations with rhizosphere bacteria can confer an adaptive advantage to plants J.Nature Plants，2015，https：/doi.org/10.1038/nplants.2015.51.12刘魁，田阳阳，王正旭，等.施用有机肥对烤烟根际土壤细菌群落多样性的影响 J.云南农业大学学报（自然科学），2021，36（6）：977-984.13谷晓楠，贺红士，陶岩，等.长白山土壤微生物群落结构及酶活性随海拔的分布特征与影响因子 J.生态学报，2017，37（24）：8374-8384.14高秀宏，李敏，卢萍，等.呼和浩特市大青山白桦根际土壤细菌群落结构研究 J.生态学报，2019，39（10）：3586-3596.15丁新景，敬如岩，黄雅丽，等.基于高通量测序的4 种不同树种人工林根际土壤细菌结构及多样性 J.林业科学，2018，54：81-89.16陈泽斌，高熹，王定斌，等.生物炭不同施用量对烟草根际土壤微生物多样性的影响 J.华北农学报，2018，33（1）：224-232.17李晨华，张彩霞，唐立松，等.长期施肥土壤微生物群落的剖面变化及其与土壤性质的关系 J.微生物学报，2014，54（3）：319-329.18杜思瑶，于淼，刘芳华，等.设施种植模式对土壤细菌多样性及群落结构的影响 J.中国生态农业学报，2017，25（11）：1615-1625.19Bhatti A A，Haq S，Bhat R A.Actinomycetes benefaction role in soil and plant health J.Microbial Pathogenesis，2017，111：458-467.20李茂森，高卫锴，任天宝，等.遵义烟区不同海拔下植烟土壤细菌群落及影响因素分析 J.作物杂志，2021，6：193-198.21徐慧敏，闫海，马松，等.鞘氨醇单胞菌USTB-05对微囊藻毒素的生物降解 J.中国环境科学，2014，5：1316-1321.22Li F，Chen L，Zhang J B，et al.Bacterial community structure after long-term organic and inorganic fertilization reveals important associations between soil nutrients and specific taxa involved in nutrient transformations J .Frontiers in Microbiology，2017，8：187.38