雷公藤红素抑制前体脂肪细胞成脂分化的作用及机制研究.pdf

中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.165DOI:10.19803/j.1672-8629.20230708 中图分类号：R977;R994.1文献标志码：A 文章编号：1672-8629（2024）01-0065-09雷公藤红素抑制前体脂肪细胞成脂分化的作用及机制研究岳兰昕1，沈磐1，周磊1,2，黄从书1,2，周维1#，高月1*（1军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所抗辐射药物研究室，北京 100850；2 天津中医药大学，天津 301617）摘要：目的研究雷公藤红素（celastrol，Cela）对前体脂肪细胞（3T3-L1）成脂分化的抑制作用及其具体机制。方法采用CCK-8 法确定雷公藤红素处理 3T3-L1细胞的最佳浓度；油红 O 染色及免疫荧光法（脂肪细胞标志蛋白Perilipin1，Adiponectin）检测雷公藤红素对 3T3-L1 成脂分化不同时期的抑制作用；Western Blot（WB）检测不同浓度雷公藤红素处理后3T3-L1细胞中调控脂代谢以及分化相关蛋白的表达；对未分化（Con）、分化第1天（MDI）、分化第1 天同时给药250 nmolL-1 雷公藤红素（MCT）的 3T3-L1细胞进行 WB 检测以及 microRNA（miRNA）测序，qPCR 验证筛选得到的 miRNA，进行 KEGG 与 GO 富集分析；过表达 mmu-miR-5121 mimics 和 inhibitor，WB 检测相关蛋白的变化，油红 O 染色检测分化结果。结果Cela 处理 3T3-L1细胞的最佳浓度为 250 nmolL-1和500 nmolL-1；油红 O 染色及免疫荧光结果表明250 nmolL-1与500 nmolL-1Cela 对 3T3-L1成脂分化均有显著抑制作用，250 nmolL-1在 3T3-L1 成脂分化早期（第1 天）便能显著抑制 3T3-L1 成脂分化；250 nmolL-1Cela 处理3T3-L1 24 h 后，能显著抑制 3T3-L1中DFCP1、FAS、ACC、PPAR 等蛋白的表达；分化第1天 FAS 与ACC 表达升高，采用250 nmol L-1 Cela 处理后，ACC、FAS 蛋白表达显著降低；miRNA 测序筛选后qPCR 验证结果表明 mmu-miR-5121在分化第1天减少，但 Cela 处理后含量增加。转染 5121 inhibitor 提高了FAS 与ACC 的含量，5121 mimics则呈现相反作用。单独转染 5121 inhibitor可使得3T3-L1分化成熟，而分化同时添加 5121 mimics可以有效抑制分化。并且 250 nmolL-1 Cela可以抑制5121 inhibitor引起的分化。结论 250 nmolL-1雷公藤红素作用于 3T3-L1成脂分化早期可显著抑制 3T3-L1分化，其可能通过上调 mmu-miR-5121的含量，抑制 FAS 与ACC 的表达发挥作用。关键词：雷公藤红素；前体脂肪细胞；成脂分化；脂代谢；油红 O 染色；mmu-miR-5121The inhibitory effect and mechanism of Celastrol on adipogenic differentiation in 3T3-L1YUE Lanxin1,SHEN Pan1,ZHOU Lei1,2,HUANG Congshu1,2,ZHOU Wei1#,GAO Yue1*(1Anti-radiation Drug Research Laboratary,Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,China;2Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 301617,China)Abstract:Objective To study the inhibitory effect and mechanism of Celastrol(Cela)on adipogenic differentiation in preadipocytes(3T3-L1).Methods CCK-8 was used to determine the optimal concentration of Cela for 3T3-L1 cells.Oil red O staining and immunofluorescence(Perilipin1,Adiponectin)were used to imply the inhibitory effect of Celastrol on 3T3-L1 adipogenic differentiation at different stages.Western Blot(WB)was used to detect proteins expression related to lipid metabolism and differentiation in 3T3-L1 cells treated with different concentrations of Cela;WB,microRNA(miRNA)sequencing and qPCR were used to analyze undifferentiated(Con),differentiation Day1(MDI),250 nmolL-1 Cela treatment on the first day of differentiation(MCT),and KEGG and GO enrichment analysis were performed;mmu-miR-5121 mimics and inhibitor were overexpressed,then changes in related proteins were detected by WB,and differentiation results were detected by oil red O staining.Results The optimal concentrations of celastrol for treatment of 3T3-L1 cells were 250 nmolL-1 and 500 nmolL-1.Oil red O staining and immunofluorescence results showed that 250 nmolL-1 Cela significantly inhibited the adipogenic differentiation of 3T3-L1,250 nmolL-1 Cela at the early stage(the first day)significantly inhibited the adipogenic differentiation of 3T3-L1.WB results showed that treatment with 250 nmolL-1 celastrol significantly inhibited the protein expression of DFCP1,FAS,ACC,and PPAR in 3T3-L1 基金项目：国家自然科学基金资助项目（82192911）；国家中医药管理局中医药创新团队及人才支持计划项目（ZYYCXTD-D-202207）。作者简介：岳兰昕，女，硕士，中药药理与毒理。*通信作者：高月，女，研究员 博导，中药药理与毒理。E-mail:#为共同通信作者。编者按：中药毒性具有发生过程隐匿、毒性物质复杂、毒性机制不明、安全剂量模糊等特点，影响因素有炮制、配伍、剂量、煎煮方法及剂型等。本专栏邀请高月研究员及其团队基于早期毒性发现、毒性物质探究等符合中药特点的毒性评价体系，探讨附子、补骨脂等中药毒性的物质基础、毒性机制和防治措施，为有毒中药临床配伍和应用提供数据和理论支撑。中药毒性物质和机制研究专栏中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.166五环三萜类化合物雷公藤红素(celastrol,Cela)是第一个从雷公藤根皮中分离得到的活性化合物，于1936 年首次被报道，也是临床常用中药雷公藤的主要有效成分。具有抗炎1-2、抗肿瘤3-4、神经保护5等药理作用，近些年还被发现具有很好的减肥效果。2015 年有研究6显示连续 3 周对饮食诱导的高瘦素血症的小鼠进行腹腔给药雷公藤红素，发现在连续给药 15 d 后，小鼠体重已经有明显的下降。后续研究表明雷公藤红素可通过作用于下丘脑，增强机体瘦素敏感性，减少食物摄入、阻断能量消耗的减少、增强小鼠的葡萄糖稳态，而 IL-1R 是其发挥作用的必要条件7。其还可通过抑制下丘脑弓状核中的瘦素负调节蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)1B(PTP1B)和 T 细胞 PTP(TCPTP)8，以及通过部分地调控位于下丘脑中的阿黑皮素神经元中 PERK9增加瘦素敏感性并改善肥胖小鼠的能量平衡。除减少摄入之外，雷公藤红素还可通过增加能量消耗起到减肥作用10。通过激活HSF1-PGC1 增加能量消耗、诱导白色脂肪组织变为棕色脂肪组织、激活棕色脂肪组织和肌肉中的线粒体基因等机制预防肥胖和代谢功能障碍。成脂分化是人体脂肪的主要来源。研究表明雷公藤红素能有效地抑制小鼠前体脂肪细胞（3T3-L1）分化11，也可以抑制人脂肪来源的间充质干细胞的成脂分化12。在分化期间连续给药雷公藤红素，抑制了脂质积累，并且发现过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）、CCAAT/增强子结合蛋白 （C/EBP）以及脂肪酸结合蛋白 FABP4 均被显著抑制，提示这可能是雷公藤红素抑制脂肪细胞分化的机制，具体作用仍需进一步探究。成脂分化中，前脂肪细胞数目增加，形态改变，脂质迅速积累，形成成熟脂滴并最终变为成熟脂肪细胞。这个过程涉及多种分子和细胞因素的调节，包括转录因子、激素、细胞因子和代谢物等。来自细胞因子或其他器官分泌的激素信号如胰岛素，通过作用于前脂肪细胞表达的相应受体，激活下游信号通路，引发细胞进入细胞周期阻滞，在 PPAR 和 C/EBP 2 种转录因子的协同作用下最终形成成熟的脂肪细胞。分化过程中，伴随着脂滴生成与融合，脂肪酸会以甘油三酯的形式储存于脂滴中，有多种脂滴结合蛋白seipin、CIDEC、Rab8A、DFCP1、perilipin1与这个过程紧密相关。脂肪酸可来源于外界摄入或者在体内经乙酰辅酶A羧化酶（ACC）与脂肪酸合成酶（FAS）合成13。此外，越来越多的研究发现在成脂分化中，microRNA（miRNA）起着重要的调控作用。miRNA 是一类短链非编码 RNA，长度在 1922 nt，可以通过结合到 mRNA上抑制其翻译或降解，调控基因表达。研究发现，miRNA 在肥胖患者与正常人体内呈现差异表达，可以通过多种调控方式影响脂肪细胞分化和成熟14-15。目前，国内外学者在雷公藤红素调节脂质代谢方面的作用已有较为深入的研究基础，但在机制阐释方面尚不明晰，因而，本研究旨在探究雷公藤红素对 3T3-L1 的抑制作用，并结合分子生物学及高通量测序技术深入挖掘其潜在调控机制，为雷公藤红素调节脂质代谢方面的研究提供新的思路和数据支撑。1 材料与方法1.1 设备与仪器活细胞成像仪（美国 Bio-Tek 公司，型号：Cytati-on5）；酶标仪（美国Perkin Elmer 公司，型号：VICTORX）；离心机（美国 Beckman 公司，型号：Microfuge 22R）；倒置显微镜（日本 Nikon eclipse 公司，型号：TS100）；电泳仪、转膜仪（美国 BIO-RAD 公司，型号：DYC-Mini4）；显影仪（瑞典Health care公司，型号：Image Quant Las 500）；核酸定量分析仪（美国Thermo Fisher Scientific公司，型号：ND800）；热循环仪（美国 BIO-RAD，型号：T100）；荧光定量 PCR 仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司，Quant Studio 3）。1.2 药品与试剂雷公藤红素，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），胰岛素，油红O 染色液（北京索莱宝科技有限公司）；cells.On the first day of differentiation,the expression of FAS and ACC increased.After treatment with 250 nmolL-1 Cela,the expression of ACC and FAS protein significantly decreased;miRNA sequencing screening and validation showed that mmu-miR-5121 decreased on the first day of differentiation,but increased after Cela treatment.Transfecting 5121 inhibitor increased the content of FAS and ACC,while 5121 mimics showed the opposite effect.Transfecting 5121 inhibitor alone led to adipogenic differentiation,while 5121 mimics could effectively inhibit normal differentiation.And 250 nmolL-1 Cela can inhibit differentiation induced by 5121 inhibitor.Conclusion 250 nmolL-1 Cela significantly inhibited the differentiation at early state of 3T3-L1 adipogenic differentiation,possibly by upregulating the content of mmu-miR-5121 and inhibiting the expression of FAS and ACC.Keywords:celastrol;3T3-L1;adipogenic differentiation;lipid metabolism;oil red O staining;mmu-miR-5121中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.167地塞米松（美国 Sigma-Aldrich）；小牛血清（calf serum-CS）（上海富衡生物）；DMEM 培养基，胰酶，PBS 缓冲液（美国 Thermo-Fisher）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技有限公司）；细胞增殖毒性检测试剂盒（CCK-8，日本同仁化学）；脂联素（Adiponectin），脂滴包被蛋白（Perilipin1），脂肪酸合酶（FAS），乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC），过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）抗体（美国 CST 公司）；免疫荧光染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Mir-XmiRNA qRT-PCR TB Green Kit（宝日医生物技术（北京）有限公司）；mmu-miR-5121-mimics 以及inhibitor（北京欧林格生物技术有限公司）；Lipofectamine RNA iMAX 转染试剂（美国Thermo Fisher Scientific）。1.3 方法1.3.1 药物配置 雷公藤红素储备溶液：将雷公藤红素溶解于DMSO 制备浓度为 200 mg mL-1的雷公藤红素母液，使用前用DMEM完全培养基稀释至2 mmol L-1。IBMX储备液：将 IBMX 粉末溶解于 0.5 mol L-1 KOH溶液，制成 0.25 molL-1的 IBMX 储备液。Insulin储备液：将胰岛素粉末溶解于 0.02 molL-1的稀盐酸溶液中，制成 10 mgmL-1的 insulin 储备液。DXM储备液：地塞米松（DXM）粉末溶于无水乙醇制得10 mmolL-1的 DXM 储备液，取适量用 PBS 稀释至1 mmolL-1。以上试剂均分装后于-20保存。1.3.2 3T3-L1 细胞培养及分化 小鼠前体脂肪细胞即 3T3-L1，购自上海富衡生物科技有限公司，货号FH0359。使用含10%小牛血清（CS），1%青链霉素溶液的 DMEM 完全培养基进行培养，达到 70%汇合度进行传代。分化时将 3T3-L1 细胞以 2104cm-2接种于12 孔板或 24 孔板中，以每皿 1105接种于共聚焦小皿中。待细胞达到 100%汇合度后，加入成脂分化诱导液 I（含 5 mmol L-1 IBMX，10 g mL-1 Insulin及1 M DXM的10%CS-DMEM培养液），此为分化d 0，培养2 d后，d 2更换为诱导液 II（含10 g mL-1 Insulin 的 10%CS-DMEM 培养液），继续培养 2 d后，d 4 更换为10%FBS-DMEM 继续培养，每 2 d更换1次，至d 8 分化结束。1.3.3 CCK-8 法检测 3T3-L1 细胞活力 将状态良好的3T3-L1以每孔 5103接种于 96 孔板中，待细胞生长融合度达 70%，更换为含有不同浓度 Cela（2、1、0.5、0.25 mol L-1，125、62.5、31.25、15.625 nmol L-1）的10%CS-DMEM 培养基，继续培养 24 h 后，PBS 漂洗后，加入含 10%CCK-8 试剂的完全培养基，37孵育14 h，于酶标仪 450 nm 处检测各孔 OD 值。1.3.4 油红O 染色 分化结束后，使用 PBS进行漂洗，加入油红O 固定液室温固定 30 min，弃去固定液，用蒸馏水洗 2 次后，加入 60%异丙醇浸洗 5 min，随后加入新鲜配制的油红O 染色液，浸染 20 min 后蒸馏水洗 25 次至无染液残留，加入 Mayer 苏木素染色液复染核1 min，水洗后加入油红O 缓冲液孵育1 min，随后弃去，加入蒸馏水覆盖细胞并于活细胞成像仪下观察并拍照记录。1.3.5 免疫蛋白印迹实验 将各处理组 3T3-L1 提取总蛋白后进行 BCA 定量，使用 10%SDS-PAGE 进行电泳，采用 PVDF 膜进行湿法转膜，5%脱脂奶粉-TBST 溶液中室温封闭2 h，选择对应的一抗溶液 4孵育过夜，洗膜后加入对应的二抗溶液，室温孵育1 h，洗膜后采用 ECL 法显影。以GAPDH 作为内参，用 Image J 软件对条带进行统计分析。1.3.6 免疫荧光染色法 分化结束后，移除共聚焦小皿中细胞培养基，PBS 漂洗后，加入免疫染色固定液，室温固定 10 min 后进行漂洗，随后加入免疫染色封闭液室温封闭 2 h，分别加入免疫荧光一抗溶液（Adiponectin 和 Perilipin1），4孵育过夜。漂洗后加入对应荧光二抗溶液，于室温避光孵育1 h。再次漂洗后加入抗荧光淬灭封片液（含 DAPI），于活细胞成像仪上拍照记录。1.3.7 总 RNA 提取测序以及 qPCR 检测 Con、MDI、MCT 每组 3 个重复，样品溶于 TRIzol 中，进行转录组测序。采用 TRIzol 法提取总 RNA。预冷 PBS 清洗细胞 2 次，加入TRIzol 反复吹打使细胞完全溶解。室温裂解 20 min，加入 0.2 倍体积的氯仿，混匀后冰上裂解 5 min，12 000 rpm，4离心5 min。吸取上层液体，加入相同体积预冷的异丙醇，4放置10 min，12 000 rpm，4离心15 min，75%预冷乙醇洗涤沉淀 2 min，12 000 rpm，4离心5 min，干燥后加入无Rnase 水溶解 RNA，测定浓度。根据 Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit，采用加尾法进行逆转录后进行 qPCR 定量检测 miRNA。1.3.8 转染 mmu-miR-5121 inhibitor 与 mimics 将 3T3-L1以 2104 cellscm-2的密度接种于 6 孔板中，待其100%汇合后，转染 5121 mimics 或 5121 inhibitor（RNA iMAX 转 染，mimics 浓 度 为 50 nmolL-1，inhibitor 浓度为 100 nmolL-1），同时加入分化试剂或者250 nmolL-1 Cela，24 h 后 WB 检测蛋白表达情况。将 3T3-L1 以 2104 cellscm-2的密度接种于 24 孔中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.168板中，待其生长至接触抑制后，开始分化，并且在分化d 0 以及分化 d 2 换液的同时，过表达 5121 mimics或 5121 inhibitor（同时添加250 nmol L-1 Cela），正常分化，d 8 时，采用油红O 染色检测分化结果。1.3.9 统计学方法 使用 Graph pad Prism 8.0 对数据进行统计分析并制图，各组数据采用均数标准差（x-s）表示，两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析（analysis of variance,ANOVA）。2 实验结果2.1 雷公藤红素作用于 3T3-L1 细胞 24 h 后对细胞活力影响为明确雷公藤红素的作用浓度，采用 CCK8 法检测不同浓度雷公藤红素处理 24 h 后 3T3-L1 的细胞活力（图 1）。相比于对照组，较低剂量的雷公藤红素对于细胞活力并无显著影响，但当浓度达到1 molL-1和 2 molL-1时，3T3-L1 细胞活性显著降低（P0.001，P0.0001）。因此，在后续研究中，采用 250 nmolL-1与 500 nmolL-1浓度的雷公藤红素溶液处理 3T3-L1 细胞。2.2 雷公藤红素抑制 3T3-L1 分化为确证雷公藤红素对于 3T3-L1 分化的抑制作用，采用 250 nmolL-1与 500 nmolL-1雷公藤红素在分化期间连续给药 8 d，于第 8 天进行油红 O 染色与免疫荧光染色。正常分化的细胞中可见有大小不一的脂滴形成，表明3T3-L1成脂分化状态良好，而 250 nmolL-1和 500 nmolL-1 Cela 连续处理后，镜下未观察到明显的脂滴，提示 3T3-L1 成脂分化受到抑制（图 2）。此外，免疫荧光染色结果表明 250 nmolL-1 Cela 作用 8 d 后，其脂滴结合蛋白perilipin1表达量明显下降（图 3）；脂肪细胞分泌的脂联素adiponectin 也明显减少（图4），提示 250 nmol L-1 Cela能显著降低 3T3-L1的成脂分化水平。图 2 3T3-L1细胞分化期间雷公藤红素连续处理 8 d 后油红O 染色情况Figure 2 Oil red O staining of 3T3-L1 cells after 8 days of continuous administration with Celastrol during differentiation图 3 雷公藤红素（250 nmolL-1）连续作用 8 d 后免疫荧光检测 Perilipin1的表达情况Figure 3 Expression of Perilipin1 detected by immunofluorescence after 8 days of continuous treatment with Celastrol(250 nmolL-1)图 4 雷公藤红素（250 nmolL-1）连续作用 8 d 后免疫荧光检测 adiponectin 的表达情况Figure 4 Expression of adiponectin detected by immunofluorescence after 8 days of continuous treatment with Celastrol(250 nmolL-1)注：与对照组相比，*P 0.001;*P 0.0001Note:*P 0.001 vs control;*P 0.0001 vs control图 1 不同浓度雷公藤红素处理对 3T3-L1细胞活力的影响（n=3，x-s）Figure 1 Effects of different concentrations of Celastrol on 3T3-L1 cell viability after treatment（n=3，x-s）cell viability/%Celastrol/molL-12.3 雷公藤红素对 3T3-L1 成脂分化不同阶段的影响为探究雷公藤红素在 3T3-L1 成脂分化不同阶段的效果，采用 250 nmolL-1雷公藤红素分别于分化 03、25、27、47 d 进行处理，油红O 染色。相比于正常分化组，03 d 及 27 d 给予雷公藤红素处理对 3T3-L1 的成脂分化有显著抑制作用（图 5），提示在分化的早期阶段给予雷公藤红素处理对于脂肪分化有较好地抑制作用。中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.169图 5 雷公藤红素在 3T3-L1分化的不同阶段处理后油红O 染色情况Figure 5 Oil red O staining of 3T3-L1 different differentiation stages after treatment with Celastrol图 6 雷公藤红素在 3T3-L1分化的第1天处理后油红 O 染色情况Figure 6 Oil red O staining after treated with Celastrol on the first day of 3T3-L1differentiation注：与0 nmolL-1比较，*P 0.05;*P 0.01;*P 0.001;*P 0.000 1Note:*P 0.05 vs 0 nmolL-1;*P 0.01 vs 0 nmolL-1;*P 0.001 vs 0 nmolL-1;*P 0.000 1 vs 0 nmolL-1图 7 免疫蛋白印迹实验检测雷公藤红素对 3T3-L1细胞中脂代谢以及调控分化相关蛋白的影响（n=3，x-s）Figure 7 Effects of Celastrol on lipid metabolism and differentiation related proteins in 3T3-L1 cells detected by western blot assay（n=3，x-s）基于以上研究，发现雷公藤红素在 3T3-L1 成脂分化的早期有较好地抑制作用，为了进一步确证这一结果，于 3T3-L1成脂分化第1天给予不同浓度雷公藤红素处理。油红O 染色结果如图 6 所示，62.5、125 nmol L-1雷公藤红素作用于第1天，对分化基本无影响，并未影响脂质积累，而 250 nmol L-1雷公藤红素处理能显著抑制脂滴的形成。进一步提示雷公藤红素可能在 3T3-L1成脂分化早期发挥抑制作用。2.4 雷公藤红素对脂代谢以及调控分化相关蛋白的影响为进一步解析雷公藤红素抑制 3T3-L1 细胞成脂分化的机制，通过 Western blot 检测不同浓度雷公藤红素处理作用24 h 后 3T3-L1细胞中调控脂代谢以及分化相关蛋白的表达，C/EBP、C/EBP、PPAR、FABP4、ADAR1的表达结果如图 7所示，相比于正常对照组，当雷公藤红素处理浓度达 250 nmolL-1时，PPAR、DFCP1、ACC、ADAR1 及 FAS 等蛋白表达量均显著降低（P0.05，P0.001）。以上结果提示 250 nmolL-1雷公藤红素处理可抑制 3T3-L1 中 PPAR、ADAR1、DFCP1、FAS、ACC 等调控脂代谢，miRNA修饰，脂滴生成及分化相关蛋白的表达，进而抑制 3T3-L1 成脂分化能力。2.5 分化第1 天给予雷公藤红素处理对相关蛋白的影响为了探究雷公藤红素作用于 3T3-L1 诱导分化第1天抑制成脂分化作用的机制，Western blot 对未进行分化的细胞（Con）、正常分化的细胞（MDI）以及诱导第1天同时给药雷公藤红素 250 nmolL-1处理 24 h 的细胞（MCT）中 PPAR、ADAR1、DFCP1、FAS、ACC 进行检测。相比于未进行分化组（Con），诱导分化 1 d（MDI）后，FAS、ACC 等蛋白的表达发生显著增加（P0.001，P0.05），而 PPAR、ADAR1、DFCP1等蛋白的表达未发生显著改变（P0.05），相比于正常诱导分化 1 d（MDI），250 nmolL-1雷公藤红素处理能显著降低 FAS及 ACC 的表达（P0.01，中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.170P0.05），而 PPAR、ADAR1、DFCP1 等蛋白的表达未发生显著改变（P0.05）（图 8）。以上结果提示 3T3-L1 细胞分化的早期，FAS 及 ACC 发挥着主要的调控作用，并且雷公藤红素可能通过抑制 FAS、ACC 的表达降低 3T3-L1 成脂分化能力。2.6 分化后第1 天 3T3-L1转录组分析及结果验证为了探究 Cela 的抑制分化作用是否与调控miRNA 相关，对 Con、MDI、MCT3 组进行 miRNA 测序。有 8 个 miRNA 在分化第1天含量增加，而 Cela可以下调其含量，有 1 个 miRNA 在分化第1 天含量降低，而 Cela可以上调其含量，为 mmu-miR-5121（图 9）。通过 miRDB 数据库获取这 9 个 miRNA 靶基因并进行功能富集分析，发现主要与能量代谢、免疫和炎症、脂肪/干细胞分化、脂质转运、储存和修饰等相关功能条目和通路有关（图10）。qPCR 实验结果表明，mmu-miR-5121在分化第1天含量降低，250 nmolL-1 Cela 处理 24 h 能使得其含量显著增加，这一结果与测序结果基本一致（图11）。2.7 mmu-miR-5121对于分化的影响以及可能机制为了明确 mmu-miR-5121 对 3T3-L1 细胞成脂分化的影响，实验对 3T3-L1 细胞分别转染 mmu-注：Con.未分化细胞；MDI.正常分化的细胞，即诱导 I 24 h；MCT.诱导第1天同时给药雷公藤红素 250 nmolL-1处理 24 h；与Con 组相比，*P 0.05，*P 0.001;与MDI 组相比，#P 0.05，#P 0.01Note:Con.undifferentiated;MDI.Normally differentiated,induced I 24 h;MCT.simultaneously treated with Celastrol 250 nmol L-1 for 24 h on the first day of induction;*P 0.05 vs Con group,*P 0.001 vs Con group;#P 0.05 vs MDI group,#P 0.01 vs MDI group图 8 免疫蛋白印迹实验检测雷公藤红素作用于分化第1天后对相关蛋白的影响（n=3，x-s）Figure 8 The effect of Celastrol on related proteins after the first day of differentiation was detected by western blot assay（n=3，x-s）注：A.样本区分度分析；B.样本整体表达量分析；C.差异表达的 miRNA；D.mmu-miRNA 差异表达情况（n=3，x-s）Note:A.sample differentiation analysis;B.Analysis of the overall expression level of samples;C.differentially expressed mirnas;D.Differential expression of mmu-miRNA图 9 各处理组 3T3-L1细胞 RNA 转录组测序结果Figure 9 RNA transcriptome sequencing results of 3T3-L1 cells in each treatment groupACDBmiR-5121 inhibitors，以及分化同时转染mmu-miR-5121 Mimics，采用油红O 染色来检测成脂分化水平，相比于正常分化组（NC），转染 mmu-miR-5121 inhibitor 能显著提高 3T3-L1 细胞成脂分化水平，相反，转染中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.171注：Con.未分化细胞；MDI.正常分化的细胞，即诱导 I 24 h；MCT.诱导第1天同时给药雷公藤红素 250 nmolL-1处理 24 h；与Con 组相比，*P 0.001；与MDI 组相比，#P 0.05Note:Con.undifferentiated;MDI.Normally differentiated 24 h;MCT.simultaneously treated with Celastrol 250 nmolL-1 for 24 h on the first day of induction;*P 0.001 vs Con group;#P 0.05 vs MDI group;#P 0.01 vs MDI groupFigure 11 Expression of mmu-miR-5121 in 3T3-L1 cells detected by qPCR（n=6，x-s）图 11 qPCR 实验检测 3T3-L1细胞中 mmu-miR-5121的表达情况（n=6，x-s）mmu-miR-5121 Mimics 能显著减低 3T3-L1 细胞成脂分化水平（图12）。而在 3T3-L1中，mmu-miR-5121 inhibitor 可以上调 FAS 与ACC 的表达量，5121 mimics则起到相反的作用（图 13）。以上结果提示 mmu-miR-5121可以调控 3T3-L1 细胞成脂分化，并且可能与其调控 FAS 和 ACC 的表达有关2.8 雷公藤红素可通过改变 mmu-miR-5121 的含量影响分化为进一步明确雷公藤红素是否可以通过作用于mmu-miR-5121 影响 3T3-L1分化，在分化 03 d，转染 mmu-miR-5121 mimics 或 inhibitor，并且同时以250 nmolL-1 Cela 处理 3T3-L1 细胞，第 8 天进行油红O 染色。结果如图14，相对于分化组，给予 Cela处理能显著降低成脂分化水平，提示雷公藤红素可抑制3T3-L1 细胞成脂分化，转染 mmu-miR-5121 inhibitor能