铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化.pdf

第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化杨柳青1，范钦1，白雅洁1，许颖2，罗继娜2，成家茂1，陈海燕2，3（1.大理大学基础医学院，云南大理，671003；2.大理大学临床医学院，云南大理，671003；3.大理大学第一附属医院超声科，云南大理，671013）摘要：【目的】探讨铁皮石斛多糖（DOP）对CCl4 诱导肝纤维化（HF）的影响及其作用机制。【方法】将56 只雄性SD 大鼠随机分为七组：正常组（NG）、模型组（MG）、秋水仙碱组（CG，0.1mg/kg）、扶正化瘀组（FG，0.45g/kg）、低剂量DOP 组（LDG，0.05 g/kg）、中剂量DOP 组（MDG，0.1 g/kg）和高剂量DOP 组（HDG，0.2 g/kg），每组8 只。采用皮下注射40%CCl4 橄榄油混合液制备HF 大鼠模型，每3 d 注射1次，共10周。造模第6周结束后，各药物组分别给予秋水仙碱、扶正化瘀和DOP 溶液灌胃处理，NG 和MG 大鼠给予等量0.9%生理盐水处理，每天1次，连续4周。各组大鼠肝组织病理学采用苏木精-伊红（HE）、Masson 染色、天狼星红（Sirius red）染色检测；肝功能和肝纤四项指标采用血液生化法检测；肝组织中-SMA、Col-I、E-cadherin、ZEB1 基因和蛋白的表达分别采用RT-qPCR 法和Western Blot 法检测。【结果】HE、Masson、Sirius red 染色结果显示MG 大鼠肝脏组织出现典型的HF 病理特征，LDG、MDG 和HDG 大鼠HF 均出现不同程度改善。肝功能检测结果显示，LDG、MDG、HDG 大鼠的血清AST、TBIL、AKP 水平与MG 相比均显著降低（P 0.05或 0.01），血清ALT 水平除LDG 外均显著降低（P 0.05或 0.01）。肝纤四项指标检测结果显示，LDG、MDG、HDG 大鼠的血清HA、LN、PC-、COL-含量与MG 比较均明显下降（P 0.05或 0.01）。基因、蛋白检测结果显示，LDG、MDG、HDG 大鼠肝组织中-SMA、COL-I、ZEB1 的相对表达量明显降低（P 0.05或 0.01），而E-cadherin 的相对表达量升高（P 0.05或 0.01）。此外，HA、-SMA、COL-I、ZEB1、E-cadherin 的表达均存在一定的DOP 剂量依赖性。【结论】DOP 可通过抑制大鼠肝组织的上皮-间质转化减轻CCl4 诱导的HF 程度。关键词：肝纤维化；铁皮石斛多糖；上皮-间质转化；E-钙黏蛋白；锌指E盒结合同源框1中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0076-09DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240004.011Dendrobium Officinale Polysaccharide Alleviates Hepatic Fibrosis via Epithelial-Mesenchymal TransitionYANG Liuqing1，FAN Qin1，BAI Yajie1，XU Ying2，LUO Jina2，CHENG Jiamao1，CHEN Haiyan2，3（1.School of Basic Medicine，Dali University，Dali 671003，China；2.School of Clinical Medicine，Dali University，Dali 671003，China；3.Department of Ultrasound Medicine，The First Affiliated Hospital of Dali University，Dali 671013，China）Correspondence to：CHENG Jiamao；E-mail：Abstract：【Objective】To investigate the effect of Dendrobium officinale polysaccharide（DOP）on CCl4-induced hepatic fibrosis（HF）and its mechanism.【Methods】A total of 56 male SD rats were randomly divided into seven groups：normal group（NG），model group（MG），colchicine group（CG，0.1 mg/kg），Fuzheng Huayu group（FG，0.45 g/kg），low-dose DOP group（LDG，0.05 g/kg），middle-dose DOP group（MDG，0.1 g/kg）and high-dose DOP group（HDG，0.2 g/kg），with 基础研究 收稿日期：2023-09-25 录用日期：2023-12-01基金项目：2021年云南省地方本科高校基础研究联合专项资金（202101BA070001-101）；2023年度云南省教育厅科学研究基金（2023Y0962）作者简介：杨柳青，第一作者，研究方向：中医药抗肝纤维化作用及其机制，E-mail：；成家茂，通信作者，教授，研究方向：中医药抗肝纤维化作用及其机制，E-mail：第1期杨柳青，等.铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化8 rats in each group.HF rat model was established by subcutaneous injection with 40%CCl4 olive oil mixture，every 3-day for 10 weeks.At the end of the sixth week，the drug groups were treated with colchicine，Fuzheng Huayu and DOP solution by gavage respectively，once a day for 4 weeks.NG and MG groups were similarly handled with an equal amount of 0.9%normal saline.Liver histopathology was detected using hematoxylin-eosin（HE），Masson and Sirius red staining；blood biochemistry was tested for liver function and four indicators of HF；RT-qPCR and Western Blot were used to measure the expression of-SMA，Col-I，E-cadherin，and ZEB1 genes and proteins in the liver tissues of rats，respectively.【Results】HE，Masson，and Sirius red staining showed that the liver tissue of MG rats had typical pathologic features of HF，and the degree of HF was alleviated in LDG，MDG，and HDG rats，respectively.Liver function test results showed that the serum AST，TBIL，and AKP levels were significantly lower in LDG，MDG，and HDG，compared with those of the MG（P 0.05 or 0.01）.Meanwhile，ALT levels in serum deceased remarkably except in LDG（P 0.05 or 0.01）.The four results of HF showed that the serum HA，LN，PC-，and COL-levels in LDG，MDG，and HDG rats were significantly decreased compared with those of the MG（P 0.05 or 0.01）.The relative expressions of-SMA，COL-I，and ZEB1 genes and proteins were significantly decreased in the liver tissues of LDG，MDG，and HDG（P 0.05 or 0.01），and the relative expression of E-cadherin gene and protein increased（P 0.05 or 0.01）.In addition，the expressions of HA，-SMA，COL-I，ZEB1 and E-cadherin were dependent on the dose of DOP.【Conclusion】DOP alleviated the degree of CCl4 induced HF in rats by inhibiting the epithelial-mesenchymal transition in liver tissue.Key words：hepatic fibrosis；dendrobium officinale polysaccharide；epithelial-mesenchymal transition；E-cadherin；Zinc finger E-box binding homeobox 1J SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（1）：76-84肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是慢性肝病发展为肝硬化、肝癌、肝功能衰竭等终末期肝病的共同病理生理过程，以肝内弥漫性的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）进行性积累为主要特征，具有可逆性。HF 过程中肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）被活化，产生大量的I 型胶原蛋白（collagen type I，Col-I）等 ECM 成分，并表达高水平的-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，-SMA）1。研究认为，上皮细胞经历上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一个可逆的过程，在纤维化和癌症发展中发挥着至关重要的作用，参与了HSC的激活2，可增加肌成纤维母细胞和成纤维细胞的数量，从而驱动多器官纤维化的发生3。目前尚无明确可用于抗HF 的特效药物，但中医药具有多渠道、多层次、多靶点的综合药理作用，在治疗HF 方面具有独特优势4。铁皮石斛对癌症、消化系统疾病和免疫性疾病等具有良好功效5。本课题组前期研究发现6，滇产铁皮石斛及其主要药效成分多糖（dendrobium officinale polysaccharide，DOP）可 通 过 TGF-、Hh、Wnt/-catenin 信号通路发挥抗HF 作用。其中，TGF-/Smad是纤维化的主要途径，其特征为胶原沉积和EMT，并伴有过量的氧自由基7。但 DOP 对 EMT 介导的抗HF 潜在机制仍不清楚。本实验主要探讨EMT 在DOP 抗HF 作用中的机制，为防治HF 提供新思路和新方法。1 材料与方法1.1材 料1.1.1实验动物随机选择8周龄无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性SD 大鼠 56 只，体质量（150 20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证编号 SCXK（湘）2019-0004，饲养于大理大学动物实验中心，使用普通饲料和纯净水自由饮食饮水，光照 12 h/黑暗 12 h，温度 18 22，适应性饲养1周后开始实验。本实验所有操作均符合大理大学实验动物伦理要求。1.1.2主要药物DOP 粉剂购自于宁夏香草生物技术有限公司（生产批号：XC221015），秋水仙碱片购 自 云 南 植 物 药 业 有 限 公 司（生 产 批 号：20221101），扶正化瘀胶囊购自上海黄海制药有限责任公司（生产批号：211138）。1.1.3主要试剂分析纯CCl4购自于西陇科学股份有限公司；天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine 77第45卷中山大学学报（医学科学版）transaminase，ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）购自于南京建成生物工程研究所；层黏连蛋白（laminin，LN）、透明质酸（hyaluronic acid，HA）、型前胶原（PC-）、型胶原（Col-）酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒购自于上海酶联生物科技有限公司；苏木精-伊红（HE）、Masson、天狼星红（Sirius red）染色试剂盒购自于北京索莱宝科技有限公司；总RNA 提取试剂盒购自于天根生化科技（北京）有限公司；2 Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix，RIPA 裂解液、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔一抗、HRP 标记的山羊抗兔IgG，购自于武汉赛维尔生物科技有限公司；E-钙黏蛋白（E-cadherin）、锌指 E 盒结合同源框 1（zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1）、-平滑肌肌动蛋白（-SMA）、I型胶原蛋白（Col-I）抗体购自于武汉三鹰生物技术有限公司。1.2方 法1.2.1造模及分组采用随机数字法将56 只大鼠分为正常组（normal group，NG）、模型组（model group，MG）、秋水仙碱组（colchicine group，CG；0.1 mg/kg）、扶 正 化 瘀 组（Fuzheng Huayu group，FG；0.45 g/kg）、DOP 低、中、高剂量组（low-dose DOP group，LDG；middle-dose DOP group，MDG；high-dose DOP group，HDG；分 别 给 予 DOP 0.05 g/kg、0.1 g/kg、0.2 g/kg）8。参考 中华人民共和国药典（2020版），按成人每天6 g（每天612 g）的用量计算铁皮石斛的大鼠临床等效用量，并根据铁皮石斛的提取率和含多糖质量分数，换算为大鼠的DOP 用量，并设置剂量梯度观察其对相关指标的影响。MG 组和药物组均皮下注射40%CCl4 橄榄油混合液，首次 5 mL/kg 体质量（body weight，BW），之后每次 3 mL/kgBW，每 3 d 注射 1 次，共10 周。NG 组给予等量的橄榄油溶液。1.2.2药物干预将秋水仙碱片磨成细粉，将扶正化瘀胶囊倒出药粉。将DOP、秋水仙碱和扶正化瘀药粉分别溶于0.9%生理盐水（NS）配成相应药液。造模第6 周后，各组大鼠开始给予连续灌胃（DOP、扶正化瘀每只10 mL/kg，秋水仙碱每只0.5 mL/kg），每天 1 次，连续 4 周。NG、MG 组分别给予 0.9%NS 10 mL/kg 只进行对照处理。1.2.3肝脏取材各组大鼠末次灌胃后，禁食12 h，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。在无菌条件下开腹行腹主动脉取血 5 10 mL，室温静置40 min，1 006.2 g 离心15 min，置于冰箱内4 下保存备检。采血完毕，用50 mL 0.9%NS 自门静脉快速冲洗肝中血液，剪取肝叶，洗净肝表面并去除被覆的肝包膜和周围残留组织后，滤纸吸干。取肝中叶和外叶置于福尔马林溶液中常温固定48 h以上；取剩余肝叶置于-80冰箱中保存备检。1.2.4肝组织病理学检测取肝叶切块约 1 cm1 cm1.5 cm 大小，脱水，石蜡包埋，以5 m 厚度连续切片，常规脱蜡复水后进行HE、Masson 和Sirius red 染色。用Image J 软件计算肝组织的胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF），CVF-Masson、CVF-Sirius red 分别为呈胶原阳性的蓝色面积或红色面积与组织总面积的百分比。1.2.5肝功能指标检测取大鼠腹主动脉血，按检测试剂盒操作步骤，测定ALT、AST、AKP 含量，并采用爱德士兽医专用全自动生化仪检测总胆红素（total bilirubin，TBil）。1.2.6肝纤四项指标检测按照ELISA 说明书，将大鼠血清以样品稀释液稀释5倍，分别设置标准品孔、空白孔、各组样品孔，每孔设置 3 个复孔。在=450 nm 下依序测量每孔的吸光度，计算 HA、LN、PC-、Col-的血清相对含量。计算算式：CHA=（A测定孔-A空白孔）232.69-26.1954 5，R2=0.9972；CLN=（A测定孔-A空白孔）268.4-40.577 5，R2=0.997；CPC-III=（A测定孔-A空白孔）33.561+0.0953 5，R2=0.9917；CCol-=（A测定孔-A空白孔）60.606-5.7555 5，R2=0.9985。1.2.7基因检测应用总RNA提取试剂盒提取肝组织的总 RNA，应用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测HF 相关基因-SMA、Col-I 及EMT 相关基因 E-cadherin、ZEB1 的表达。按照 SweScript All-in-one RT SuperMix for qPCR 说明书，取 2 g 总RNA 逆转录成cDNA。以-actin 为内参，按照2Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 说明书进行 RT-qPCR。Col-I、-SMA、-actin 的引物由武汉赛维尔生物科技有限公司设计合成，ZEB1、E-cadherin 使用在线软件 Primer Premier 3 Plus 和 Oligo Calc 自行设计，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。引物序列见表 1。扩增条件为95 30 s，95 15 s，60 30 s，40 个循环。扩增产物运用 2-Ct 法分析相对表达量。1.2.8 蛋 白 检 测 采 用 Western blot 法 检 测-SMA、Col-I、E-cadherin、ZEB1 蛋白的表达。每个78第1期杨柳青，等.铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化样本取肝组织 100 mg，依序加入 1 mL RIPA 裂解液、10 L 磷酸酶抑制剂和10 L PMSF，机械匀浆后置于冰上震荡，每10 min 一次，共3 次。组织充分裂解后，13 400 g 离心15 min，取上清液备用。使用BCA 试剂盒测得各组样本总蛋白浓度，并依据样本的最低浓度，将各样本的浓度配平成同一浓度。按比例加入上样缓冲液，置于恒温金属浴中100 下煮沸10 min，常温冷却。根据蛋白分子大小选择 8%或 10%凝胶进行 SDS-PAGE 电泳（200 V，40 min），然后转膜至PVDF 膜上（400 mA，30 min 或 50 min）。随后将附有目的蛋白的电转膜应用5%脱脂牛奶室温封闭1 h，洗膜，分别加入一抗GAPDH（1：1 000）、-SMA（1：5 000）、Col-I（1：1 000）、E-cadherin（1：10 000）、ZEB1（1：500），置于冰箱内4 下孵育过夜。TBST 洗膜3 次去除一抗残留液，加入相应二抗（1：3 000）室温孵育 1 h。TBST 洗膜3 次去除二抗残留液，滴加200 L ECL 显色液，Bio-RAD 凝胶成像系统自动拍照。应用Image J 软件分析条带灰度值并计算目的蛋白的相对表达量（目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值）。1.3统计学分析采用 SPSS 27.0 进行数据处理和统计分析。所有数据均用均值标准差（x s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较分析前行方差齐性检验，方差齐者采用LSD 法检验，方差不齐者采用塔姆黑尼T2（Tambanes T2）法检验。P 0.05 表示差异有统计学意义。2 结 果2.1肝组织病理学改变HE 染色显示（图1A），NG 大鼠肝小叶结构完整，无炎性细胞浸润，无明显纤维组织增生。MG 大鼠较NG 大鼠肝小叶正常结构明显破坏，可见肝细胞广泛空泡样变，大量炎性细胞浸润，汇管区有增生的纤维隔将肝小叶分割成大小不等的假小叶。与MG 相比，各药物组大鼠的HF 均呈不同程度减轻。Masson 和Sirius red 染色结果显示，Masson 染色胶原纤维呈蓝染（图1B），Sirius red 染色胶原纤维呈红染（图1C）。两者显示，NG 大鼠肝小叶结构完整，汇管区和中央静脉区见少量蓝染/红染胶原纤维。与NG 相比，MG 大鼠汇管区和中央静脉见大量蓝染/红染胶原纤维，并向肝小叶内延伸。与MG 相比，各用药组大鼠用药后的蓝染/红染胶原纤维明显变少，变细。对各组数据进行单因素方差分析，CVF-Masson（F=129.942，P 0.001）和 CVF-Sirius red（F=104.858，P 0.001）的组间差异均有统计学意义。经方差齐性检验后，采用LSD 法进行两两比较，与 NG 相比，MG 大鼠的 CVF 显著增加（P 0.01）；与MG 相比，各给药组的CVF 显著减少（P 0.01）；分别与CG 和FG 相比，LDG 大鼠的CVF 显著升高（P 0.05；图2）。Sirius red 染色偏振光显微镜下观察I 型胶原纤维呈强黄色（图1D），与 NG 相比，MG 大鼠的强黄色区域明显增加；与MG 相比，各用药组大鼠强黄色区域明显减少。表1目的基因的引物序列Table 1Primer sequences for target genes Target GeneCol-I-SMAZEB1E-cadherin-actinPrimer Sequence（F：Forward Primer；R：Reverse Primer）F：5-CCCAGCGGTGGTTATGACT T-3R：5-TCGATCCAGTACTCTCCGC T-3F：5-ACCATCGGGAATGAACGCT T-3R：5-CTGTCAGCAATGCCTGGG TA-3F：5-CGCGGCGCAATAACGTTACA AAT-3R：5-GCTCATCATCTGGCACACC A-3F：5-CTGGGGTCATTTCCACTCG G-3R：5-GTGGCAATGGGTGAACCAT CA-3F：5-TGCTATGTTGCCCTAGACT TCG-3R：5-GTTGGCATAGAGGTCTTTAC GG-3Product Length257 bp191 bp141 bp112 bp240 bp79第45卷中山大学学报（医学科学版）2.2肝功能变化血液生化检测结果显示（图 3）。各组数据经单因素方差分析，各组 ALT、AST、AKP、TBIL 水平分别具有统计学差异（F=30.518，P 0.001；F=83.886，P 0.001；F=27.106，P 0.001；F=32.742，P 0.001）。经方差齐性检验后，ALT、AKP、TBIL 方差不齐，采用 Tambanes T2 test 进行两两比较。与NG 相比，MG 大鼠ALT、AST、AKP、TBIL 水平均显著升高（P 0.01）。各药物组与MG 相比，AST、TBIL、AKP 水平均显著降低（P 0.05 或 0.01），除LDG 外ALT 水平均显著降低（P 0.05 或 0.01）。分别与CG 和FG 相比，LDG 大鼠ALT、AST、TBIL、AKP 水平均升高（P 0.01），MDG 仅比FG 大鼠AST、TBIL 水平升高（P 0.05或 0.01）。LDG 较MDG、HDG 大鼠ALT、AST、TBIL、AKP 水平均升高（P 0.05 或 0.01），MDG 较HDG 仅 AST 水平升高（P 0.05）。2.3肝纤维化指标变化ELISA 检测血清表达量结果显示（图4）。各组数据经单因素方差分析，HA、LN、PC-、COL-含量分别具有统计学差异（F=31.387，P 0.001；F=99.092，P 0.001；F=30.611，P 0.001；F=45.012，P 0.001.）。经方差齐性检验后，LN、PC-、COL-方差不齐，采用Tambanes T2 test 进行两两比较。与NG 相比，MG 大鼠HA、LN、PC-、COL-含量均上升（P 0.01）。与MG 相比，各药物组大鼠 HA、LN、PC-、COL-含量均下降（P 0.05 或 0.01）。各药物组两两比较，LDG 较HE(A),Masson(B),Sirius red(C)staining,taken under the white light.Sirius red staining(D),taken under the polarized light.Blue arrows(A):vacuolated lesions;black(B),purple(C),and yellow(D)arrows:collagen fibers.Bar=100 m.图1DOP 对HF 大鼠肝组织病理学的影响Fig.1Effect of DOP on the histopathology of the liver in HF ratsCVF:Collagen volume fraction;NG:normal group;MG:model group;CG:colchicine group;FG:Fuzheng Huayu group;LDG:low-dose DOP group;MDG:middle-dose DOP group;HDG:high-dose DOP group.*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001.图2DOP 对HF 大鼠肝组织CVF 的影响Fig.2Effect of DOP on CVF in hepatic tissues of HF rats80第1期杨柳青，等.铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化CG、FG、MDG、HDG 大鼠HA、LN、PC-、COL-含量均升高（P 0.05 或 0.01），MDG 较 HDG 仅HA 含量升高（P 0.05）。其中，HA 变化呈明显药物剂量依赖性。2.4基因和蛋白表达的变化RT-qPCR 和 Western blot 分别检测大鼠肝组织中目的基因（图 5 A1-A4）及其蛋白（图 5 B1-B4）相对表达量。对各组目的基因和蛋白数据分别进行单因素方差分析，-SMA（F=35.167，P 0.001；F=73.830，P 0.001）、COL-I（F=57.112，P 0.001；F=39.308，P 0.001）、E-cadherin（F=31.534，P 0.001；F=18.994，P 0.001）、ZEB1（F=48.933，P 0.001；F=173.471，P 0.001）的相对表达量均具有统计学差异。经方差齐性检验后，其中-SMA、COL-I、ZEB1 基因和-SMA、COL-I、E-cadherin 蛋白的相对表达量均采用Tambanes T2 test 进行两两比较。与 NG 相比，MG 大鼠肝中-SMA、COL-I、ZEB1 基因及其蛋白的表达均显著升高（P 0.01），而E-cadherin 基因和蛋白则显著降低（P 0.01）。与 MG 相比，各药物组大鼠肝中-SMA、COL-I、ZEB1 基因及其蛋白的表达均明显降低（P 0.05 或 0.01），而 E-cadherin 基因和蛋白则明显升高（P 0.05 或 0.01）。各药物组分别与CG、FG 相比，LDG 大鼠肝中-SMA、COL-I、ZEB1 基因及其蛋白的表达均明显升高（P 0.01），而E-cadherin 基因及其蛋白的表达明显降低（P 0.01）；MDG 大鼠肝中-SMA 基因和蛋白的表达以及COL-I 基因的表达均较FG 明显升高（P 0.05），而E-cadherin 基因和蛋白的表达均明显降低（P 0.05）。各药物组两两比较，LDG 较MDG、HDG 大鼠-SMA、COL-I、ZEB1 的基因及其蛋白表达明显升高（P 0.05 或 0.01），而 E-cadherin 的基因及其蛋白表达明显降低（P 0.05 或 0.01）；与 HDG 比较，MDG 大鼠-SMA、COL-I 的基因明显升高（P 0.05），但只有-SMA 蛋白明显升高（P 0.05）。结果表明，HF 大鼠肝中的 ECM ALT:alanine aminotransferase;AST:aspartate aminotransferase;TBIL:total bilirubin;AKP:alkaline phosphatase.*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001.图3各组大鼠血清中肝功能指标水平的比较Fig.3Comparison of the content of liver function indexes in serum of the groups81第45卷中山大学学报（医学科学版）标记物-SMA、COL-I 及 EMT 标记物 ZEB1、E-cadherin 均具有药物剂量依赖性。3 讨 论在众多HF 动物模型中，CCl4 诱导的模型最为经典常用9。本研究从肝功能指标、肝纤四项、肝组织ECM 成分及组织病理学等方面的变化充分证明了模型制备成功。DOP 干预后，这些HF 变化均得到了明显改善，其中血清HA 水平和纤维化肝组织中-SMA、COL-I的基因和蛋白表达均呈药物剂量依赖性。秋水仙碱可抑制胶原蛋白在肝中沉积，从而达抗HF 效果 10；扶正化瘀胶囊是临床上治疗HF 药物之一 11。以这两种药物作阳性对照，发现高剂量DOP 抗HF的效果与二者之间几乎无明显差异。EMT 最基本的特征是上皮细胞向间质细胞转变，包括极大增加了ECM 成分的产生，明显增强细胞的迁移能力、侵袭性和凋亡抵抗等。近些年来此观点得到进一步修正12，即EMT 驱动细胞从上皮状态转变为混合上皮/间质表型，具有混合表型的细胞同时具有上皮特征（E-cadherin 介导的细胞间黏附）和间质特征（迁移活性），使它们能够集体移动，如在胚胎形态发生、伤口愈合、癌症细胞迁移、侵袭和转移扩散过程中所观察到的。E-cadherin 下调是EMT 过程中的一个关键事件，参与肌动蛋白细胞骨架的连接，它的下调导致细胞与细胞之间的黏附性降低，使单个细胞能够从原发性肿瘤中分离出来，因此是癌症进展的一个重要特征13。有研究表明，miR-200c 可能通过上调E-cadherin，下调ZEB1 抑制 EMT，从而抑制直肠癌的侵袭和转移14。本研究中模型大鼠的肝组织中出现E-cadherin 基因和蛋白的表达下调，表明HF 具有明显的癌变风险。随着DOP 干预浓度的升高，E-cadherin 恢复上调，且存在一定的药物剂量依赖性，尽管中、高剂量DOP 之间差异不显著。ZEB 转录因子在 EMT 早期被激活，包括ZEB1 HA:hyaluronic acid;LN:laminin;PC-III:type III pre-collagen;COL-IV:type IV collagen.*P 0.05,*P 0.01,*P 0.001.图4各组大鼠血清中肝纤维化指标含量的比较Fig.4Comparison of the content of liver fibrosis indexes in serum of each group82第1期杨柳青，等.铁皮石斛多糖通过上皮-间质转化抗肝纤维化和ZEB2，有助于抑制上皮表型并激活间充质表型，在胚胎发育、器官纤维化和癌症进展中发挥着核心作用15-16。ZEB1 也称为转录因子8（TCF8）或 晶体蛋白增强因子1（EF1），是锌指同源结构域转录因子家族的关键成员，也是EMT 过程中的关键转录因子17。ZEB1 和ZEB2 均可以与E-cadherin 基因启动子中的CACCT（G）序列结合，导致EMT18。近期研究表明，ZEB1 核转位可上调存活素，下调E-cadherin，可能通过靶向存活素激活 TGF-1/Smad 信号传导，在果糖诱导HF 的EMT 过程中发挥重要作用19。本研究证明，在CCl4 诱导HF 大鼠模型的肝组织中，ZEB1 出现上调，并导致 E-cadherin 下调，HSC 活化标志物-SMA 以及 ECM 主要成分COL-I 的表达均显著升高，说明且EMT 标志物ZEB1 在HF 过程中发挥了重要作用；在中、高剂量DOP 干预后，ZEB1、-SMA 和COL-I 基因和蛋白的表达均明显下降，而E-cadherin 基因和蛋白的表达均明显上升，提示DOP 可通过增加E-cadherin 的表达来调节 ZEB1 介导的 EMT 进程，从而发挥抗HF 作用，并呈一定的药物剂量依赖性。HSC 活化在HF 发生发展中起着核心作用，而EMT 可加速HSC 增殖并向肌成纤维细胞转化，从而通过ECM 在肝中沉积促进HF20。本研究采用不同剂量的 DOP 干预 HF 大鼠后，肝中的 HSC 活化标志物和ECM 主要成分均明显降低，表明DOP 可能通过 EMT 抑制 HSC 的活化，从而达到抗 HF 作用。另有研究表明，来源于花科蔬菜的 3，3-二吲哚甲烷可缓解CCl4 诱导的小鼠HF，调节EMT 标志物的水平，诱导Nrf2 的核易位及其抗氧化基因的转录，并通过减少细胞内ROS 的产生来抑制线粒体膜电位的丧失，从而抑制TGF-1 诱导的肝细 胞 凋 亡21。和 厚 朴 酚 通 过 激 活 E-cadherin/GSK3/JNK 和 抑 制 AKT/ERK/p38/-catenin/TMPRSS4 信号轴来抑制 EMT 和 HF22。姜黄素可通过激活自噬有效减少肝细胞中EMT 的发生并抑制ECM 的产生从而发挥抗HF 作用23。由此可见，在中医药抗HF 过程中EMT 并非单独发生，它与Wnt/-catenin、TGF-1 信号通路、氧化应激和自噬等过程存在复杂的交联关系，故DOP 发挥抗HF 作用也存在交联机制且值得后续进一步深入研究。综上所述，DOP 具有改善 HF 大鼠肝功能和逆转 HF 过程的作用，且高剂量 DOP 的疗效更显著，这与 EMT 过程受到抑制密切相关。同时，EMT 是一个受多因子调控、涉及多信号通路的复杂过程，它在 DOP 抗 HF 作用中的具体机制仍不十分明确。-SMA：alpha smooth muscle actin（A1，B1）；COL-I：collagen type I（A2，B2）；E-cadherin：cadherin 1（A3，B3）；ZEB1：zinc finger E-box binding homeobox 1（A4，B4）.A1-A4：gene expression.B1-B4：protein expression.*P 0.05，*P 0.01，*P 0.001.图5各组大鼠目的基因和蛋白表达Fig.5Comparison of gen