焦亡相关基因在膀胱癌中的作用鉴定与预后分析研究.pdf

中日友好医院学报2024年第38卷第1期 Journal of China-Japan Friendship Hospital，2024，Vol.38，No.1临床研究焦亡相关基因在膀胱癌中的作用鉴定与预后分析研究徐 鑫1*，矫宾宾2，李晓琦1，方自林1，张 冠1（1.中日友好医院 泌尿外科，北京 100029；2首都医科大学附属朝阳医院 泌尿外科，北京 100020）摘要 目的：通过生物信息学的方法分析并确定膀胱癌患者的关键焦亡相关基因（PRGs）表达谱，并阐明其潜在功能。方法：从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中下载了对应膀胱样本的mRNA表达谱和临床数据，进行功能富集分析，包括基因本体论分析（GO）和京都基因与基因组百科全书的分析（KEGG）。构建评估预后的基因模型，计算风险评分，分高、低风险组评估膀胱癌的预后。评估PRGs与肿瘤免疫浸润的相关性，并构建基于它们的共表达和预测目标的竞争性内源性RNA（ceRNA）调控轴。结果：我们选择了33个PRGs，功能富集分析显示，它们主要参与细胞因子产生、炎症小体复合物、凋亡过程和NOD样受体信号通路的正调控。我们用LASSO Cox回归分析筛选6个基因（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）构建PRGs模型，KM曲线提示高风险评分的膀胱癌患者的总生存时间概率低于低风险评分患者，差异有统计学意义（P0.001），列线图表明该模型对预后预测较准确。AIM2、CASP6与免疫细胞浸润显著相关（P0.05）。通过构建ceRNA网络，确定了膀胱癌中的CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG调控轴。结论：预后相关的PRGs与膀胱癌患者免疫细胞浸润显著相关。膀胱癌的CeRNA调控轴尚需进一步验证。关 键 词：焦亡相关基因；预后；免疫微浸润；调控轴；膀胱癌中图分类号：R737.14 文献标识码：A 文章编号：1001-0025（2024）01-0016-05doi：10.3969/j.issn.1001-0025.2024.01.004Identification of the role of the pyroptosis related gene for bladder cancer：A study based on TCGA database/XU Xin，JIAO Bin-bin，LI Xiao-qi，et al/Journal of China-Japan Friendship Hospital，2024 Feb，38（1）：16-20Abstract Objective：To identify key pyroptosis-related genes（PRGs）in patients with bladder cancer（BLCA）by performing bioinformatics analysis and to clarify their potential value.Methods：We downloaded the mRNA expression profiles and clinical data corresponding to bladder samples from The Cancer Genome Atlas（TCGA）database.Next，we performed functional enrichment analyses，including both Gene Ontology（GO）and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）and analyses，to evaluate the mechanism underlying the signature.In addition，a comprehensive bioinformatics analysis was performed，and we constructed a prognostic gene model.The correlations between PRGs and tumor immune infiltration and microsatellite instability were evaluated.Moreover，we constructed a competing endogenous RNA（ceRNA）regulatory axis based on their coexpression and predicted targets.Results：We selected 33 PRGs，and functional enrichment analyses revealed these PRGs are mainly involved in the positive regulation of cytokine production，inflammasome complexes，apoptotic processes，and NOD-like receptor signaling pathways.A prognostic PRG model constructed using the 6 prognostic genes predicted the overall survival（OS）of BLCA patients with medium-to-high accuracy.The genetic mutation landscape of the PRGs in BLCA was also summarized.A significant correlation was observed between prognostic PRGs（AIM2 and CASP6）and immune cell infiltration and microsatellite instability.A ceRNA network was constructed and identified the CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG regulatory axis in BLCA.Conclusion：The prognostic PRGs were significantly correlated with immune cell infiltration and microsatellite instability in BLCA patients.A CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG regulatory axis for the BLCA are needed to verify.Key words pyroptosis related gene；prognostic；immune infiltration；regulatory axis；bladder cancerAuthor s address Department of Urology Surgery，China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China膀胱癌是一种起源于尿路上皮的常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率均较高，严重威胁了人们的健康。细胞焦亡，也被称为细胞炎性坏死，是一1*本文通讯作者，E-mail：作者简介：徐 鑫（1981），男，主治医师，医学硕士。收稿日期：2023-11-30 修回日期：2023-12-1916Journal of China-Japan Friendship Hospital，2024，Vol.38，No.1 中日友好医院学报2024年第38卷第1期种新形式的程序性细胞死亡形式1，焦亡被认为是对抗感染的重要机制，它在肿瘤的发展中起着重要作用2。炎性囊泡、气皮蛋白和促炎细胞因子是焦亡的重要组成部分，在肿瘤发生、侵袭和转移过程中起着重要作用35。因此，焦亡可能是肿瘤发展的潜在生物标志物或基因标记，也可能对发现膀胱癌的预后相关基因标记具有重要意义。焦亡与肿瘤进展之间的关系是复杂的。一方面，焦亡抑制肿瘤的发生和发展；另一方面，焦亡也会形成一种可以将营养物质运送到癌细胞并促进其生长的微环境6。由于焦亡对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移有显著影响，因此影响肿瘤的预后6。当焦亡发生时，一系列信号分子和细胞因子被激活和释放，同时强烈的炎症反应和免疫系统反应被激活7，焦亡的强促炎作用与肿瘤免疫微环境的调节有关，但具体过程尚不清楚。已有研究表明，焦亡在肿瘤的发生和抗肿瘤过程中起着重要作用；然而，焦亡相关基因（pyroptosis-related genes，PRGs）在膀胱癌中的价值尚未被阐明，因此，我们研究了PRGs的表达谱及其与预后相关的意义，以及相关的调控轴，并探讨膀胱癌中焦亡与肿瘤免疫微环境的相关性。1 资料与方法1.1 数据收集通过 CSC 癌症浏览器下载癌症基因组图谱（TCGA）数据库，其中包含 406 个膀胱癌样本数据、437 份膀胱癌样本的 miRNA 测序数据和 410份临床资料。本研究的所有过程均遵循TCGA数据库的相关指导方针和政策。1.2 焦亡相关基因（PRGs）的获取我们从此前的综述6，810中共获得33个PRGs（表 1），使用“limma”和“reshape2”软件包检测膀胱癌与正常组织之间的PRGs表达差异。1.3 功能富集分析应用 R 软件中的 cluster-Profiler 软件包进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）2种途径分析。获得了GO通路（生物过程、分子功能和细胞成分）和KEGG通路。1.4 预后相关分析及统计学方法在单变量Cox回归分析的基础上，通过LASSO Cox回归分析建立预后基因模型，使用R软件中的“glmnet”软件包和LASSO Cox回归进行相关基因的选择和删除。为了评估PRGs的预后价值，我们进一步采用多因素 cox回归分析来评估 PRGs与生存率之间的相关性，最后保留6个基因及其系数，根据最小准则确定惩罚参数。根据中位风险评分将TCGA数据库中406例膀胱癌患者分为低危亚组和高危亚组，通过 Kaplan-Meier 分析比较 2组的总生 存 时 间（OS）。采 用 R 软 件 中 的“survival”“survminer”和“timeROC”软件包生成 1、3、5年生存率的受试者特征曲线（ROC），每个变量的P值、风险比（HR）和 95%置信区间（CI）显示在基于“forestplot”软件包的森林图中。采用网络工具TIMER来分析预后PRGs与免疫浸润的相关性，包括目标PRGs表达、目标PRGs表达与大量免疫细胞（B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞和单核细胞）浸润的相关性，以及基因表达与肿瘤纯度的关系。我们构建了竞争性内源性 RNA（ceRNA）网表1 33个细胞焦亡相关基因名称（PRGs）基因简称AIM2CASP1CASP3CASP4CASP5CASP6CASP8CASP9ELANEGPX4GSDMAGSDMBGSDMCGSDMDGSDMEIL18IL1BIL6NLRC4NLRP1NLRP2NLRP3NLRP6NLRP7NOD1NOD2PJVKPLCG1PRKACAPYCARDSCAF11TIRAPTNF英文全称absent in melanoma 2cysteine-aspartic acid protease-1cysteine-aspartic acid protease-3cysteine-aspartic acid protease-4cysteine-aspartic acid protease-5cysteine-aspartic acid protease-6cysteine-aspartic acid protease-8cysteine-aspartic acid protease-9elastase，neutrophil expressedglutathione peroxidase 4gasdermin Agasdermin Bgasdermin Cgasdermin Dgasdermin Einterleukin 18interleukin 1 betainterleukin 6NLR family CARD domain containing 4NLR family pyrin domain containing 1NLR family pyrin domain containing 2NLR family pyrin domain containing 3NLR family pyrin domain containing 6NLR family pyrin domain containing 7nucleotide binding oligomerization domain containing 1nucleotide binding oligomerization domain containing 2pejvakin/deafness，autosomal recessive 59phospholipase C gamma 1protein kinase cAMP-activated catalytic subunit alphaPYD and CARD domain containingSR-related CTD associated factor 11TIR domain containing adaptor proteintumor necrosis factor17 中日友好医院学报2024年第38卷第1期 Journal of China-Japan Friendship Hospital，2024，Vol.38，No.1络，以阐明PRGs在膀胱癌中的潜在功能。ceRNA网络由 starBase、TargetScan、miRDB、miRWalk 和RNA22构建而成，用于预测与 PRGs结合的 miRNA 靶点，用 StarBase 预测与 miRNA 相互作用的lncRNA靶点。P0.05认为差异有统计学意义。2 结果2.1 膀胱癌组织和正常组织中DEGs的鉴别在TCGA数据库中比较19个正常组织和406个肿瘤组织的差异表达基因（DEGs），这些DEGs与 33 个 PRGs 的交集包括 IL6、PYCARD、CASP6和 AIM2基因，其中 1个基因（IL6）在肿瘤组织中下调，其余 3 个基因（CASP6、AIM2、PYCARD）在肿瘤组织中上调。2.2 功能富集分析为了明确 PRGs 的功能，我们使用 GO 和KEGG 数据库进行分析。GO 分析表明，这 33 种PRGs主要涉及参与凋亡过程的细胞因子的产生、炎性小体复合物和半胱氨酸型内肽酶的活性（图1A、1B、1C，见封二）；KEGG分析表明，33个PRGs主要参与了 NOD 样受体信号通路（图 1D，见封二）。而33个PRGs在肿瘤和非肿瘤样本之间的详细表达模式如图1E（见封二）所示。2.3 预后相关基因模型的构建与分析将上述33个基因进行LASSO Cox回归分析并构建预后模型，并对每个PRGs与OS进行单因素Cox回归分析，显示CASP8、CASP9、AIM2、GSDMB、CASP6的高表达与良性预后相关（图2，见封二）。LASSO Cox回归和多变量Cox分析成功鉴定出6个基因的特征，具体计算公式为：风险评分=（-0.318CASP9 表达值+0.331PRKACA 表达值-0.279CASP6 表 达 值-0.186TNF 表 达 值-0.110AIM2 表达值-0.313GSDMB 表达值）。根据风险评分公式计算的中位数评分，将406例患者平均分为高风险组和低风险组，6个基因的风险评分分布、生存状态及表达水平如图2A所示。Kaplan-Meier曲线显示，高风险评分的膀胱癌患者的OS概率低于低风险评分的患者，差异有统计学意义（P0.001，图2B），1年、3年和5年生存率的曲线下面积（AUC）分别为0.695、0.687和0.697（图2C）。同时，预测列线图显示与理想模型相比，1年、3年和5年OS的预测性能尚可（图2D）。校准曲线图显示3年实际生存率与预测生存率一致（图2E），说明该列线图有一定的临床应用价值。2.4 肿瘤免疫微环境分析细胞焦亡在肿瘤免疫微环境的形成中起着至关重要的作用。多变量COX分析和DEGs中涉及的 PRGs 的 交 集 包 括 2 个 PRGs，即 AIM2 和CASP6，我们进一步使用TIMER数据库来明确膀胱癌中预后相关PRGs（AIM2和CASP6）与免疫浸润的相关性。数据显示AIM2的表达与CD8+T细胞（图 3A，P=3.26e-6）和 B 细胞（图 3C，P=2.76e-4）的丰度呈正相关，而与巨噬细胞（图 3D，P=1.68e-5）和单核细胞（图 3E，P=2.57e-13）呈负相关。此外，CASP6 的表达与 B 细胞（图 3H，P=6.26e-4）和巨噬细胞（图3I，P=2.97e-3）的免疫浸润水平呈正相关。2.5 mRNA-miRNA-lncRNA网络的构建为了阐明PRGs在膀胱癌中的分子机制，我们构建了mRNA-miRNA-lncRNA相互作用的网络。RNA22、TargetScan、miRDB 和 miRWalk 发现 hsa-let-7c-5p 是结合 CASP6 的靶向 mRNA。进一步分析显示，hsa-let-7c-5p在膀胱癌中下调（图4A，P=1e-11），而低hsa-let-7c-5p水平的膀胱癌患者有更好的OS（图4B，P1，P0.05）。我们采用LASSO Cox回归分析，基于6种预后PRGs（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）构建了一个预后基因模型，与理想模型相比，预测18Journal of China-Japan Friendship Hospital，2024，Vol.38，No.1 中日友好医院学报2024年第38卷第1期图显示1年、3年和5年的OS均预测较为准确，这表明焦亡相关基因可以用于膀胱癌生存期的预测，具有一定的临床意义。在将 DEGs 和相关基因纳入列线图之后，我们的分析显示AIM2和CASP6可以对预后产生较好的预测。AIM2是一种细胞质的先天性免疫受体，可以识别在致病性攻击期间释放的双链DNA，能够导致多种多蛋白寡聚复合物的组装，而这些复合物被称为炎症小体10，11。AIM2能够激活CASP-1，并通过ASC介导的紧密连接蛋白刺激IL-1和IL-18的成熟和释放，而这一过程也可能促进焦亡的发生12。然而AIM2在各种癌症中的作用可能也不同，AIM2在结肠癌和肝癌中具有抑瘤功能，但在皮肤鳞癌中却具有促瘤功能8，13，AIM2基因具有微卫星不稳定位点，这导致了结直肠癌中频繁的基因突变14，15。此外，Patsos 等学者16发现AIM2通过诱导细胞周期（G2/M期）阻滞来降低结肠癌细胞的增殖；Hu等17指出AIM2的缺失可以通过标靶肝脏中的纤维连接蛋白-1（FN1）来促进了上皮-间质的转化（EMT）；他们的研究表明，新发现的 HBx/AIM2/FN1 轴是肝细胞癌转移的一个新的潜在治疗靶点。AIM2的下调可以使侵袭蛋白酶 MMP1 和 MMP13 的表达下调13，从而导致皮肤鳞癌细胞侵袭能力的降低，AIM2的下调也能导致体内皮肤鳞癌异种移植物的生长和血管化受到抑制13。这些研究结果为AIM2 在肿瘤进展中的作用提供了证据，并提示AIM2炎性小体有可能作为这些侵袭性和转移性肿瘤的潜在治疗靶点，因此，AIM2可能在不同的癌症类型中发挥独特的作用。而 CASP6 则在促进细胞凋亡和坏死性凋亡中起着重要作用，并且已被证明可以调节炎性小体的激活，包括NLRP3、ASC和CASP1的激活，从而促进 GSDMD 诱导的焦亡18，19。在本研究中，图3 PRGs与免疫浸润的关系注：免疫细胞（A.CD8+T细胞，B.CD4+T细胞，C.B细胞，D.巨噬细胞，E.单核细胞）丰度与膀胱癌中AIM2表达的关系；免疫细胞（F.CD8+T细胞，G.CD4+T细胞，H.B细胞，I.巨噬细胞，J.单核细胞）丰度与膀胱癌中CASP6表达的关系。图4 ceRNA网络中MiRNA及lncRNA的差异表达与生存率分析注：A.hsa-let-7c-5p在肿瘤组织和正常组织中的表达；B.hsa-let-7c-5p的表达与OS的关系；C.MIR29B2CHG在肿瘤组织和正常组织中的表达；D.MIR29B2CH的表达高低与OS的关系。19 中日友好医院学报2024年第38卷第1期 Journal of China-Japan Friendship Hospital，2024，Vol.38，No.1CASP6与膀胱癌患者的 OS负相关，因此，CASP6可能作为促癌基因在膀胱肿瘤组织中富集。重要的是，Yao等20提出的证据表明，CASP6可以通过调节4T1肿瘤相关巨噬细胞中MMP-2和MMP-9的表达来调节乳腺癌细胞的侵袭；体外研究中，CASP6蛋白水平或活性的降低抑制了肿瘤细胞的侵袭。对于卵巢癌细胞，CASP6的过表达和细胞质局限化可能与层粘连蛋白 A 的降解和缺乏有关21。对于胃癌和结直肠癌，Lee 等发现 CASP6在 60%的胃癌和 90%的结直肠癌中表达，表明CASP6基因偶尔会发生突变22，这些数据还表明CASP6 缺乏可能与胃癌的发病机制有关。虽然CASP6可能是影响癌症患者生存的重要基因，但其提高膀胱癌患者生存率的具体机制仍需进一步探索。鉴于膀胱的数据有限，不同肿瘤的结果往往相互矛盾，我们关于 AIM2和 CASP6的研究结果为进一步的研究提供了一些见解，我们的研究发现 2 个基因（AIM2、CASP6）可能是 BLCA 中焦亡的执行者，6个基因（CASP9、PRKACA、CASP6、TNF、AIM2、GSDMB）可能对焦亡起了调节作用，而另一个重要发现是上述2个PEGs与免疫浸润显著相关，进一步证实了焦亡在肿瘤免疫微环境中起着至关重要的作用。我们还构建了 mRNA-miRNA-lncRNA 网络和 CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG 调 控 轴。hsa-let-7c-5p属于保守的let-7家族，是已被充分研究的与许多癌症类型有关的miRNA之一2325。Hsa-let-7c-5p在多种癌症类型中下调，如非小细胞肺癌26、胰腺癌27和前列腺癌28。而 Pudova等29利用生物信息学和实验工具研究发现，在三阴性乳腺癌中，与 PFS 相关的 C1orf132（也称为MIR29B2CHG）和 MIR29B2CHG（rs=0.31）lncRNA的表达显著下调。在本研究中，我们发现 hsa-let-7c-5p和MIR29B2CHG lncRNA与膀胱癌患者的预后显著相关。这些证据表明CASP6/hsa-let-7c-5p/MIR29B2CHG lncRNA 调控轴也可能在膀胱癌的进展中发挥重要作用，可进行进一步研究来验证。当然，我们的研究也有一定的局限性。首先，我们的样本是来自TCGA数据库的回顾性公开数据，需要进一步的前瞻性队列数据来验证。其次，我们构建的预后模型中只包含6个PRGs，许多与焦亡无关的有价值的基因可能被排除在外。综上，我们研究表明细胞焦亡与膀胱癌密切相关，全面的生物信息学分析为预测膀胱癌患者的预后提供了新的基因标记，并为进一步研究膀胱癌中PRGs与免疫之间的关系提供了重要的基础。4 参考文献1 Yao L，Song J，Meng XW，et al.Periostin aggravates NLRP3 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