利用昆虫细胞表达猪RANKL蛋白及其生物学活性分析.pdf

中图分类号：S852.42DO1:10.16656-4696.2024.0024文章编号：16 7 3-4696(2024)02-0255-06文献标志码：A网络首发时间：2 0 2 3-10-2 62024,54(02):255-260中国兽医科学2024,54(02)ChineseVeterinaryScience利用昆虫细胞表达猪RANKL蛋白及其生物学活性分析周亚伟，蒋华正，杨宁，付钰广，李宝玉，杨彬，刘光亮（中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室，甘肃兰州730046)摘要：将猪RANKL基因克隆至杆状病毒供体质粒pFastBacHTA中，经酶切鉴定及测序筛选出阳性重组供体载体pFastBacHTA-RANKL，将其转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH1OBac感受态细胞，构建杆状病毒表达载体，获得重组转座子Bacmid-RANKL，在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞，获得含RANKL基因的重组杆状病毒。经 SDS-PAGE分析、Western-blot分析以及IFA试验,证明RANKL基因在 sf9细胞中成功表达。利用表达的RANKL蛋白刺激IPEC-J2细胞，采用qPCR方法检测处理后细胞中M细胞相关标志基因的表达。结果显示,与阴性对照组相比,猪RANKL处理后的细胞中M细胞特异性的标记基因CK-18、Marcksll、Sg e n e l、Sp i b、CCL2 0、U BD、NCF4、T RA F6 表达量都显著上调。这表明本研究表达的猪RANKL具有良好的生物学活性，可成功诱导IPEC-J2细胞向M细胞分化。本研究结果为后续进一步研究猪肠道M细胞的分化,及研制增强猪肠道黏膜免疫应答的M细胞靶向疫苗打下了良好的物质基础。关键词：RANKL，M 细胞，杆状病毒表达系统Expression of porcine RANKL protein using insect cells and analysisof its biological activityZHOU Yawei,JIANG Huazheng,YANG Ning,FU Yuguang,LI Baoyu,YANG Bin,LIU Guangliang(State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academyof Agricultural Sciences,Lanzhou 730000,China)Abstract:The porcine RANKL gene was cloned into the baculovirus donor plasmid pFastBacHTA,andthe positive recombinant donor vector pFastbachTA-RANKL was identified by restriction enzyme diges-tion and sequencing.The recombinant vector pFastbachTA-RANKL was transformed into DH1OBac competentcells containing Bacmid to construct baculovirus expression vector.The recombinant baculovirus con-taining porcine RANKL gene were obtained via sf9 insect cells transfected by recombinant transposonBacmid-RANKL using Liposome.The identification results of SDS-PAGE,Western-blot and IFA showed thatRANKL protein was expressed successfully by recombinant baculovirus in sf9 insect cells.IPEC-J2 cellswere treated with expressed RANKL protein,and M cell-associated gene were tested by PCR assay.The re-sults showed that the expression of M cell-specific marker genes CK-18,Marcksl1,Sgenel,Spib,CCL20,UBD,NCF4,and TRAF6 were significantly up-regulated in cells treated with porcine RANKL,indicating theexpressed porcine RANKL protein has biological activity and could induce IPEC-J2 cells differentia-tion towards M cells.In conclusion,the successfully expressed porcine RANKL protein provides the ma-收稿日期：2 0 2 3-0 9-2 8；修回日期：2 0 2 3-10-2 0基金项目：国家自然科学基金项目（3197 2 6 8 9）作者简介：周亚伟（1993-），男，安徽舒城人，硕士生，研究方向为动物疫苗开发及分子免疫学，E-mai1:，T e l：0 931-8 342 6 8 2。*通讯作者：刘光亮（197 5-），男，四川资中人，研究员，博士，主要从事动物疫苗研制及分子免疫学研究,E-mail:,Tel:[phone]。第54卷256中国兽医科学terial basis for further study of M cell differentiation in porcine intestinal tract and development ofMcell targetedvaccines.Key words:RANKL;M cell;BEVS*o*Corresponding author:LIU Guangliang,Email:RANKL（核因子kB受体致活剂配体）于1997 年首次被发现,是一个全新的肿瘤坏死因子家族成员 ；它由TNFSF11基因编码,是一类同源三聚体二型跨膜蛋白 2-3。RANKL在成骨细胞,基质细胞 4、原始间充质细胞、软骨细胞 5、T淋巴细胞和B淋巴细胞 1,6-7 树突状细胞、前列腺癌细胞和多发性骨髓瘤细胞中表达 6 8 。RANKL/RANK系统与淋巴结的发育、淋巴细胞的分化、树突状细胞的存活和T细胞的活化以及耐受诱导有关 9微皱褶细胞（microfold cells,M细胞）是覆盖于黏膜相关淋巴组织的一类上皮细胞 10 。M细胞具有独特的形态学特征，与普通的肠道上皮细胞相比,M细胞表面的微绒毛短而不规则，基底部细胞膜向顶部突起形成特殊的“口袋”，使得M细胞可以容纳抗原递呈细胞 11。M细胞具有非常强大的抗原转运能力，能将抗原快速转运到M细胞下的“口袋”，被抗原递呈细胞捕获加工处理继而激活T细胞和B细胞,最终产生抗原特异性IgA抗体 12 。由此可见,M细胞介导的抗原转运在黏膜免疫应答过程中发挥着重要作用。RANKL基因缺失的小鼠无法形成淋巴结，RANKL在淋巴结器官发育过程中是必不可少的。此外,RANKL对于早期T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育具有重要的调节作用 13。有研究表明,M细胞可以通过RANKL的诱导在小鼠体外肠样培养模型中产生，并且RANKL诱导表达的SpiB是Lgr5+干细胞来源的上皮细胞前体向M细胞发育的必要条件 14。谱系追踪研究表明,M细胞来源于Lgr5+肠道干细胞（ISCs），经RANKL诱导SpiB后形成；采用RANKL刺激SpiB缺失小鼠的LGR5+隐窝未能产生M细胞,表明SpiB表达是M细胞发育所必需的 14。2015年美国北卡罗莱纳州立大学的Rouch等研究发现，人肠隐窝的ISCs通过RANKL的刺激可以分化为具有功能性的M细胞,分化的M细胞上调表达了M细胞特征性的标记分子，并且具有转运微粒和细菌(如鼠伤寒沙门菌)的能力 15。该研究建立的M细胞培养模型，首次证明了人肠道M细胞可以从肠上皮细胞诱导生成，对进一步研究M细胞在肠道免疫中发挥的功能具有重要意义。目前M细胞的研究集中于人和小鼠,猪肠道M细胞的相关研究尚待深人研究。本研究利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了诱导M细胞分化的猪RANKL蛋白，并验证了该蛋白的生物学活性。本研究结果将为进一步研究猪肠道M细胞的功能奠定了基础，也将为猪机体黏膜免疫应答的研究和肠道疫病的防控提供理论依据。1材料与方法1.1细胞系、菌株及质粒Sf-9昆虫细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所黄立平副研究员惠赠。IPEC-J2细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所吕闯惠赠。DH5感受态细胞购自南京诺唯赞生物技术有限公司。DH1OBAC感受态细胞购自北京博迈德生物技术有限公司。真核表达载体pFastBacHTA质粒由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所孙恩成副研究员惠赠1.2主要试剂与仪器2XPhanta?MasterMix、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自南京诺唯赞生物技术有限公司。CellfectinTM II Reagent和Graces昆虫培养基均购自Gibco公司。SalI和HindI限制性内切酶购自宝生物工程（大连)有限公司。His标签小鼠源单克隆体抗购自赛默飞世尔科技有限公司。RANKL家兔多克隆抗体由本实验室制备。TRIzolLSReagent,Goatanti-Rabbit IgG(H+L)、Su p e r c l o n a l IM Re c o m b i n a n tSecondary Antibody、A l e x a Fl u o r 48 8 和 Goat anti-Mouse IgG(H+L)-AF488均购自Invitrogen公司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体和HRP标记的山羊抗家兔IgG抗体均购自北京中杉金桥公司。实时荧光定量PCR仪（CFX96)购自美国伯乐公司。低温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司1.3pFastBacHTA-RANKL重组质粒的构建猪RANKL基因经PCR扩增（上游引物序列RANKL-F1:5-ACGCGTCGACGAATGCGCCGCG-CCAGCCGAGACTAC-3，下游引物序列RANKL-R1:5-CCCAAGCTTCCTCAGTCTATATCTCGAA-CTTTAAAAGC-3）、纯化后,将其与空载体pFast-BacHTA分别用Sal I和HindIII进行双酶切。之后，使用PCR产物纯化试剂盒纯化回收酶切后的RAN-257周亚伟等：利用昆虫细胞表达猪RANKL蛋白及其生物学活性分析第2 期KL基因片段和载体并测定浓度。然后利用T4DNA连接酶将酶切后载体和片段在2 2 条件下作用30min。最后将连接产物转化至DH5感受态细胞中，37倒置过夜培养。挑取单克隆菌斑扩大培养并进行PCR鉴定。将PCR鉴定为阳性的样品送擎科生物技术有限公司测序1.4重组杆状病毒转移载体的构建将测序正确的重组质粒pFastBacHTA-RANKL转化至DH1OBAC感受态细胞中，构建杆状病毒表达载体。通过两轮蓝白斑筛选，利用RANKL-F1和RANKL-R1特异性引物以及M13通用引物对提取的Bacmid-RANKL进行PCR鉴定,提取杆状病毒重组转座子Bacmid-RANKL,即重组杆粒1.5重组杆状病毒的制备事先准备好接种于6 孔板细胞密度为90%左右的sf9昆虫细胞,弃掉培养基，每孔加人1mL无血清的Graces昆虫培养基；准备2 个无菌1.5mL的离心管,A管加人10 0 LGraces昆虫培养基和2g杆粒，向B管中加人10 0 LGraces昆虫培养基和5Lcellfectin转染试剂，将A管和B管混合室温静置30 min，加人到sf9昆虫细胞中,2 7 培养5h后弃去培养基,加人新鲜的Graces昆虫培养基培养7 2 h。7 2 h 后收集病变的细胞悬液，于4条件下50 0 0 r/min离心5min后保留上清，上清里含有P1代重组杆状病毒,将收集的P1代毒4避光保存。1.6猪RANKL重组蛋白的SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在7 5T细胞培养瓶中扩大培养sf9昆虫细胞，待细胞密度达到90%左右时接种50 0 L的P1代重组杆状病毒。在感染后第96 小时收集细胞样品并超声裂解细胞，于4条件下50 0 0 r/min离心5min后收集沉淀和上清，分别在沉淀和上清样品加人适量的蛋白10 Loadingbuffer于10 0 煮样品10min，处理后的样品进行SDS-PAGE分析和West-ern-blot鉴定。Western-blot鉴定中分别使用His标签抗体（1：2 0 0 0 稀释）和家兔抗RANKL多抗（1：100稀释）作为一抗室温孵育1h，之后分别使用HRP标记的抗小鼠IgG抗体（1：30 0 0 稀释）和HRP标记的抗家兔IgG抗体（1：30 0 0 稀释）作为二抗于室温孵育1h，之后用ECL显色检测目的蛋白1.7重组蛋白的间接免疫荧光(IFA）鉴定将P1代重组杆状病毒感染接种于6 孔板中的sf9昆虫细胞，在感染后第48 小时弃去培养基,用灭菌PBS洗3次，加人4%的多聚甲醛溶液室温固定细胞30 min,0.25%TritonX-100透膜15min后加人5%BSA室温封闭1h，然后分别加人His单抗(1：2 0 0 0)和RANKL多抗（1：10 0)作为一抗室温孵育1h,用PBS洗涤后分别加人抗小鼠IgG和抗家兔IgG荧光二抗室温孵育1h，用PBS洗涤后加DAPI室温孵育5min，之后在荧光显微镜下观察荧光信号。1.8重组猪RANKL蛋白的纯化重组杆状病毒感染昆虫细胞后第7 2 小时，收集细胞样品,并将昆虫细胞超声裂解,超声4min,整个过程都在冰上进行。随后，将超声后的细胞样品4、12 0 0 0 r/m i n 离心10 min，分为沉淀和上清，随后将上清样品加人镍柱纯化RANKL蛋白。1.9重组猪RANKL蛋白的生物学活性鉴定用纯化后的RANKL蛋白作用于IPEC-J2细胞，分别于RANKL蛋白刺激后第2 4、48、7 2 小时收集细胞样品。利用Trizol法提取细胞样品RNA,并反转录成cDNA，利用PCR方法检测猪M细胞相关标志物mRNA水平。2结果2.1重组质粒pFASTBacHTA-RANKL的构建用RANKL-F1和RANKL-R1两条引物扩增RANKL基因得到大小约为10 0 0 bp的条带,与预期相符,结果如图1所示。将RANKL基因与pFast-BacHTA载体连接后，经过菌液PCR扩增出与预期相符的目的条带,PCR阳性菌液测序结果显示与参考序列完全一致。TYNVY2.000bp1 000 bp750bp500bp250 bp100 bp图1RANKL基因的PCR扩增Figure 1PCR amplification of RANKL gene2.2重组Bacmid-RANKL的构建将成功构建的重组质粒pFastBacHTA-RANKL258第54卷中国兽医科学转化至DH10BAC细胞，经过两轮蓝白斑筛选后，挑选出白色单克隆进行扩大培养。将扩大培养后的菌液用于提取杆粒Bacmid-RANKL,并对其进行核酸电泳鉴定，结果与预期相符，如图2 A所示。随后分别用RANKL特异性引物RANKL-F1和RANKL-R1对提取的杆粒进行PCR鉴定，能扩增出约10 0 0 bp的目的条带,与预期相符,结果如图2 B所示。d I-pruorABMM1234565.000bp5.000 bp3.000 bp3.000 bp2.000 bp2.000 bp1500bp1500 bp1000 bp1000bp750bp750 bp500.bp500 bp图2 重组杆粒的鉴定Figure 2Identification of recombinant Bacmid-RANKLA：提取的杆粒电泳结果;B：提取的杆粒PCR鉴定。A:Electrophoresis analysis of extracted Bacmid-RANKL;B:PCR iden-tification ofextracted Bacmid-RANKL.2.3重组杆状病毒的获得将重组Bacmid-RANKL转染sf9昆虫细胞于27无CO2低温培养箱中培养96 h后，可以看到转染组的细胞与对照组 sf9昆虫细胞相比,出现了明显病变，细胞脱落，出现颗粒体，且停止生长，细胞的界限变得模糊，如图3所示，说明转染后成功获得重组杆状病毒2.4茶猪RANKL重组蛋白表达的Western-blot鉴定将重组杆状病毒感染sf9细胞，于感染后第96 小时收集样品，超声裂解后进行SDS-PAGE鉴定，如图4A所示，目标蛋白大小在40 ku左右。通过His抗体（图4B）和RANKL抗体（图4C）的Western-blot正常sf9昆虫细胞病变sf9昆虫细胞图3工正常sf9昆虫细胞与病变sf9昆虫细胞图Figure 3 Normal sf9 insect cells versus cytopathic sf9 insectcells鉴定结果可知，RANKL蛋白在上清和沉淀中都有表达，均能被两种抗体检测到2.5猪RANKL重组蛋白表达的IFA鉴定为进一步验证RANKL蛋白的表达,将重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞后第48 小时,分别用抗His单克隆抗体和RANKL多克隆抗体鉴定RANKL蛋白的表达。与阴性对照相比，抗His单克隆抗体和RANKL多克隆抗体都能成功检测到荧光信号，如图5所示2.6RANKL蛋白诱导IPEC-J2细胞分化为M细胞的鉴定RANKL刺激IPEC-J2细胞2 4h和48 h后收集细胞，提取RNA,反转录成cDNA后进行qPCR检测。M细胞的标志基因CCL20、CCL2 3、CK 18、marcksl1、NCF、Sg n e l、Sp i B、T R A F6 和 UBD 在mRNA水平显著上调（图5A-I)，其中CCL20、CK 18、Sp i B和TRAF6基因上调3到5倍，如图5A、5C、5G 和5H所示。而marcksll和UBD的基因上升最为显著,分别上调16 倍和2 5倍，如图5D和51所示。结果说明,猪RANKL刺激IPEC-J2细胞能够上调M细胞相关基因的表达量,表明猪RANKL刺激后的IPEC-J2细胞向M细胞分化ABCM123456M123456M12345655ku55ku55ku40ku40ku40ku35ku35ku35ku图4昆虫细胞表达猪RANKL蛋白的Western-blot鉴定Figure 4 Identification of recombinant porcine RANKL expression in insect cells via Western-blotA：蛋白表达的SDS-PAGE鉴定;B:His单抗鉴定RANKL蛋白的表达；C:RANKL多抗鉴定RANKL蛋白的表达。M：预染蛋白分子量标准；1、3：细胞裂解后上清；2、4：细胞裂解后沉淀5：sf9昆虫细胞对照上清；6 sf9昆虫细胞对照况淀。A:Identification of porcine RANKL expression via SDS-PAGE;B:Identification of porcine RANKL expression via Western-blot using His monoclonalantibody;C:Identification of porcine RANKL expression via Western-blot using RANKL polyclonal antibody.M:Protein Marker;1,3:Supernatant oflysed sf9 insect cells infected with recombinant baculovirus;2,4:Precipitation oflysed sf9 insect cells infected with recombinant baculovirus;5:Supernatans of lysed sf9 insect cells;6:Precipitation of lysed sf9 insect cells.259周亚伟等：利用昆虫细胞表达猪RANKL蛋白及其生物学活性分析第2 期阴性对照组重组杆状病毒感染组阴性对照组重组杆状病毒感染组DAPI染色DAPI染色His抗体RANKL抗体MergeMerge图5重组RANKL蛋白表达的IFA鉴定Figure 5Identification of recombinant RANKL expression via IFAA：抗His单克隆抗体对重组RANKL蛋白表达的IFA鉴定；B：R A NK L多克隆抗体对重组RANKL蛋白表达的IFA鉴定。A:Identification of recombinant RANKL expression via IFA using His monoclonal antibody;B:Identification of recombinant RANKL expression via I-FA using RANKL polyclonal antibody.CK18SpiB2.5*57*4对照组对照组*对照组*2.0432*RANKL处理组RANKL处理组3RANKL处理组1.5ns2*1.00.500.024h48h24h48h24h48hTRAF6UBDMarcksll6*30*25-对照组对照组*对照组RANKL处理组RANKL处理组20-RANKL处理组42015-10-2*105ns00024h48h24h48h24h48hCCL20CCL2347NCF2.5*对照组*对照组8对照组2.0RANKL处理组*RANKL处理组3RANKL处理组61.5ns241.0ns20.500.0024h48h24h48h24h48h图6 qPCR检测RANKL刺激IPEC-J2后的M细胞相关基因的表达Figure 6 Detection of M cell-related genes expression in IPEC-J2 cells treated with RANKL using PCR assay*：P 0.0 5;*：P 0.0 1;*：P 0.0 5.3讨论德国科学家WolfgangBocker利用原核表达系统首次成功表达出猪的RANKL可溶性蛋白，并证明了重组RANKL蛋白能够刺激猪破骨细胞的分化16 本研究利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了猪RANKL蛋白。有关RANKL的研究目前主要集中在人和小鼠上，而在猪等大动物上相关研究甚少。杆状病毒表达系统表达的蛋白的生物活性与天然蛋白相似,能容纳较大片段的外源DNA，能高（责任编辑张文举）260第54卷中国兽医科学效表达外源蛋白。目前关于RANKL的研究主要是采用原核表达系统，缺少蛋白翻译后修饰功能，而我们采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达出的可溶性RANKL蛋白，经表达后修饰能更好地发挥生物学活性。本研究中,His单克隆抗体和RANKL蛋白的多克隆抗体都能与表达的猪RANKL蛋白反应，说明猪RANKL蛋白被成功表达。结合IFA的鉴定结果，进一步证明猪RANKL蛋白通过杆状病毒表达系统成功表达，且主要在细胞质中表达。本研究结果表明，本研究表达的猪RANKL蛋白具有良好的生物学活性，能够刺激IPEC-J2细胞朝着M细胞的分化。对于几个M细胞标识分子无显著上调，或许受到了M细胞在不同物种上基因表达的差异影响,或者还需要其他细胞因子辅助RANKL蛋白发挥协同作用,这有待进一步探究。RANKL蛋白曾经被一致认为起始肠道上皮M细胞的分化7 。下一步我们将利用RANKL蛋白刺激猪肠道类器官,研究肠道类器官的分化趋势,继而深人研究M细胞的特性和功能。M细胞是猪肠道黏膜免疫的明星细胞，能够转运肠道内微生物抗原，将其递送给肠道抗原继而诱导相应的免疫应答，对其进一步的研究有助于我们深人了解猪M细胞的分化机制，以及为将来M细胞靶向疫苗的研制奠定基础。参考文献(References)1WONG BR,RHO J,ARRON J,et al.TRANCE is a novel lig-and of the tumor necrosis factor receptor familythat activates c-Jun N-terminal kinase in T cellsJ.Journal of Biological Chemistry,1997,272(40):25190-25194.2HIKITA A,YANA I,WAKEYAMA H,et al.Negative regula-tion of osteoclastogenesis by ectodomain sheddingof receptor activator of NF-kappaB ligand J.Journal of Biological Chemistry,2006,281(48):36846-36855.3LYNCH C C,HIKOSAKA A,ACUFF H B,et al.MMP-7 pro-motes prostate cancer-induced osteolysis via thesolubilization of RANKLJJ.Cancer Cell,2005,7(5):485-496.4YASUDA H,SHIMA N,NAKAGAWA N,et al.Osteoclast dif-ferentiation factor is a ligand for osteoprote-gerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor andis identical to TRANCE/RANKLJJ.Proceedings of theNational Academy of Sciences,1998,95(7):3597-3602.5LACEY D L,TIMMS E,TAN H L,et al.Osteoprotegerinligand is a cytokine that regulates osteoclastdifferentiation and activation J.Cell,1998,93(2):165-176.6ANDERSON D M,MARASKOVSKY E,BILLINGSLEY W L,et al.A homologue of the TNF receptor and its ligand en-hance T-cell growth and dendritic-cell functionJ.Nature,1997,390(6656):175-179.7DOUGALL W C,GLACCUM M,CHARRIER K,et al.RANK is es-sential for osteoclast and lymph node developmentJ.Genes&Development,1999,13(18):2412-2424.8BROwN J M,COREY E,LEE Z D,et al.Osteoprotegerinand rank ligand expression in prostate cancerJ.Urology,2001,57(4):611-616.9CHENG M L,FONG L.Effects of RANKL-targeted thera-py in immunity and cancerJ.Frontiers in Oncolo-gy,2014,3:329.10OWEN R L,JONES A L.Epithelial cell specializa-tion within human Peyer s patches:An ultrastruc-tural study of intestinal lymphoid folliclesJ.Gastroenterology,1974,66(2):189-203.11TAKASHI K,HIROSHI O.The mechanisms of M-celldifferentiationJ.Bioscience of Microbiota,Foodand Health,2014,33(3):91-97.12HASE K.Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+)bacteria by M cells initiates mucosal immune re-sponseJ.Nature,2009,462(7270):226-230.13KONG Y Y,YOSHIDA H,SAROSI I,et al.OPGL is a keyregulator of osteoclastogenesis,lymphocyte de-velopment and lymph-node organogenesis J.Na-ture,1999,397(6717):315-323.14DE LAU W,KUJALA P,SCHNEEBERGER K,et al.Peyerspatch M cells derived from Lgr5+stem cells re-quire SpiB and are induced by RANKL in cultured“minigutsJ.Molecular and Cellular Biology,2012,32(18):3639-3647.15ROUCH J D,SCOTT A,LEI N Y,et al.Development offunctional microfold(M)cells from intestinalstem cells in primary human enteroidsJ.PLoS One,2016,11(1):e0148216.16BOCKER W,RADIC T,SCHONITZER V,et al.Molecularcloning and functional characterization of theporcine extracellular domain of receptor activa-tor of NF-kappa B ligand(sRANKL)J.Gene,2012,492(1):296-304.17KNOOP K A,KUMAR N,BUTLER B R,et al.RANKL is nec-essary and sufficient to initiate development ofantigen-sampling M cells in the intestinal epithe-liumJ.The Journal of Immunology,2009,183(9):5738-5747.