核黄素处理对葡萄果实中苯丙烷类代谢调控机理研究.doc

重庆三峡学院毕业论文核黄素处理对葡萄果实中苯丙烷类代谢调控机理研究学 院 生命科学与工程学院 专 业 食品科学与工程 年 级 2012级 姓 名 学 号 指导教师 职称 完成毕业设计（论文）时间 2016 年 5 月目 录1 文献综述21.1 国内外研究现状21.2 研究的目的与意义21.3 研究内容22 实验材料与方法22.1 材料与处理22.1.1 材料22.1.2 材料处理32.2 数据测定32.2.1 TSS、TA和pH值测定32.2.2 总酚、总花色苷、总黄酮和总胡萝卜素含量测定32.2.3 PAL、C4H的测定32.3 数据处理33 结果与分析43.1 核黄素处理对采后葡萄果实总酚、总花色苷、总黄酮和总胡萝卜素含量的影响43.2 核黄素处理对采后葡萄果实苯丙烷类代谢相关酶活性的影响43.3 核黄素处理对葡萄果实贮藏期间落果率和腐烂率的影响53.4 葡萄果实总酚含量与苯丙烷类代谢酶活性之间的相关性分析64 讨论75 结论8参考文献9致谢10核黄素处理对葡萄果实苯丙烷类代谢调控机理研究摘要：实验是为了研究采后核黄素处理对葡萄果实在贮藏期间的抗氧化能力以及腐烂率的影响。通过PH差异法、福林试剂法等方法测出葡萄果实的PH值、总酚含量等数据。通过数据分析得出，10mol/L 核黄素处理能对采后葡萄果实在1贮藏期间的总酚、总黄酮和总花色苷含量的下降进行有效的抑制。同时对果实清除自由基能力和总还原力进行提高，进而对果实的抗氧化能力进行维持。苯丙烷类的代谢对葡萄果实中的多酚类物质的合成有密切影响，尤其是相关度最高的PAL和C4H。因此得出结论：10mol/L 核黄素处理能对葡萄果实苯丙烷类代谢酶活性的提高进行有效诱导，从而完成对果实多酚类物质合成的促进工作。关键词：葡萄，核黄素，苯丙烷类代谢 2012BachelorsGraduateofDepartmentofFoodScience&Technology,CollegeofLifeScience&EngineeringofChongqingThreeGorgesUniversity,Wanzhou,Chongqing,404000Abstract:TheexperimentistocleareffectofPostharvestTreatmentonantioxidantabilityofriboflavingrapefruitduringstorageanddecayrate.ThePHdifferencemethod,FolinreagentmethodtomeasurethepHofgrapefruit,totalphenoliccontentdata.Throughthedataanalysis,10mol/LriboflavintreatmentonPostharvestgrapefruitduringstorageof1DEGCtotalphenolics,totalflavonoidsandtotalanthocyanincontentdecreasedtorestrain.Atthesametime,thefreeradicalscavengingabilityandtotalreducingpowerwereimproved,andtheantioxidantabilitywasmaintained.Closelyaffectthesynthesisofphenylpropanoidmetabolismofgrapepolyphenolsinfruit,especiallyrelatedtothehighestdegreeofPALandC4H.Itisthereforeconcluded:10umol/Lriboflavintreatmentofgrapefruitphenylpropanoidmetabolismenzymeactivitytoimproveeffectivelyinduced,thuscompletingthefruitpolyphenolssynthesistopromotetheworkof.Key words: Grape berries, Methyl jasmonate (Vitamin B2),phenylpropnaoid1 文献综述葡萄果实不仅是全球产量最大的浆果类水果，而且还具有“水果之神”的称号，其原产于地中海沿岸及美洲大陆，主要分布产于我国的新疆、河北、山东、四川等地。葡萄果实食用起来不仅有果鲜汁旺、风味独特的独特口感，从另一个角度营养学的角度来讲，其还具有富含花色苷、酚类及黄酮类等天然抗氧化成分等优质特点，这些物质对清除人体内的自由基，防止和减少心血管、肿瘤和糖尿病等疾病的发生有很大的作用。葡萄果实品质评价的重要参数就包括了抗氧化物质的含量和活性。但是，葡萄果实水分高、营养丰富并且组织柔软，采摘以后很容易遭受到病菌的侵染而导致大量腐烂。常温下葡萄果实的贮藏期只有1-2天。所以寻找能够抑制腐烂并维持抗氧化能力的绿色安全的保鲜方法已成为葡萄保鲜研究中的新热点。核黄素（Vitamin B2）不仅是植物中的天然化学物质，而且既可作氢供体，又可作氢递体，还能充当信号分子对植物的生长发育、抗逆性反应和次生代谢产物的合成进行有效的调节。研究报道核黄素处理可以抑制一些浆果类果实例如葡萄、草莓、黑莓和悬钩子（raspberry）的腐烂，并提高它们在贮藏期间的抗氧化能力。但核黄素处理对葡萄果实果实采后腐烂、品质以及抗氧化能力的影响尚未见报道。为此，本试验研究了核黄素处理对葡萄果实在贮藏期间腐烂及抗氧化系统的影响，并探讨核黄素对葡萄果实抗氧化物质合成的可能作用机理，为核黄素在葡萄果实采后保鲜的应用提供理论基础。酚酸类多酚的生物合成是通过苯丙烷类代谢途径实现的。经莽草酸途径行成的分支酸，首先形成预苯丙酸，后经转氨作用行成苯丙氨酸，从而进入苯丙烷类代谢途径。在大多数植物体内，苯丙烷类代谢存在三个关键酶（PAL、C4H、4CL）。 苯丙烷类化合物或其衍生物在约广泛分布于250000种维管植物中，其结构相同，种类纷繁，它的作用是对抗生物和非生物的威胁，如感染、伤害等，研究表明的分子基础是抗氧化作用和清除自由基作用。 1.1 国内外研究现状近年来国内外研究发现，采用使用物理化学多种激发子处理均能够显著诱导果蔬中苯丙烷类代谢途径相关酶活性的上升从而提高次生代谢产物的合成。这其中作为高等植物中信号分子的核黄素在植物对外界生物或非生物胁迫中扮演着重要的角色1； 研究同样证实核黄素也提升了果蔬内部苯丙烷类代谢活动，从而促进果蔬生物活性物质的合成并且提高抗逆性。例如，核黄素处理的番木瓜后，果实内PAL酶的活性在贮藏期间显著提高同时其酚类物质合成增加，从而增强了果实的抗冷性和抗病性2；核黄素也能够诱导黑莓果实中黄酮类物质合成从而提高了果实抗氧化能力，另外也提高了抗肿瘤能力3；核黄素也能够提高草莓和黑莓果实抗氧化能力从而平衡了其组织内部的活性氧代谢4。我们先期的研究也发现1或10mol L-1核黄素能够显著诱导葡萄、枇杷和桃果实PAL活性和总酚含量的增加，并且均减少了果实腐烂的发生5-7。1.2 研究的目的与意义本研究有三个明确目的：（1）明确核黄素对葡萄果实苯丙烷类代谢途径的调控机理。（2）研究核黄素对葡萄果实中主要抗氧化物质多酚类物质合成的影响。（3）研究采后核黄素处理对葡萄果实在贮藏期间的抗氧化能力以及腐烂率的影响。迄今为止，对于核黄素处理对葡萄果实整个苯丙烷类代谢途径和详细抗氧化物质的影响尚了解不足。所以本实验计划在先前实验的基础上5，以万州产巨峰葡萄果实为试材，研究核黄素处理对采后葡萄果实苯丙烷类代谢酶系（C4H、PAL、4-CL、CHI、CHS）活性和果实中酚类单体物质含量的影响，旨在通过了解酚类物质、苯丙烷类代谢酶系、核黄素三者之间的关系，揭示核黄素作为信号分子对葡萄果实主要抗氧化物质生物合成的调控机理，并进一步探讨核黄素对果实贮藏期间抗氧化能力和抗病性的影响，为核黄素在实际生产生活中的应用提供理论基础。1.3 研究内容从万州采摘新鲜的巨峰葡萄（VitisviniferaL.V.cv.Kyoho ），将有机械伤、腐烂和未成熟果实剔除掉，并且挑选大小一致的葡萄果实，经过10mol L-1核黄素熏蒸处理6 h后，测定在20C下贮藏3d（每1d取样）或1C下贮藏12d（每3d取样）期间果实内部苯丙烷类代谢酶类活性；HPLC测定主要酚类单体物质的含量；测定果实在贮藏期间抗氧化参数；测定果实腐烂率以及品质参数。以上指标测定均重复3次，整个实验重复3次。通过数据收集统计以及详尽分析来做出结论。2 实验材料与方法21 材料与处理211 材料供试用的八分熟葡萄果实品质为“巨峰”（VitisviniferaL.V.cv.Kyoho），采自于重庆万州，并在3至4h内运回实验室，剔除未成熟、病虫害和机械损伤的果实，将大小和颜色基本一致的果实挑选出来，摊开用自然风将其预冷后，当天即用核黄素处理。212 材料处理 第一批实验：浓度筛选。葡萄果实放入密闭的熏蒸室中用1、10、100和1000mol/L 核黄素处理6h，熏蒸温度为15C，同时对照组也在熏蒸室中密闭6h（对照，0mol/L）。处理结束后，把果实放在通风初1h后用塑料盒分装，并在11(C环境中贮藏8天后观察果实腐烂率，并对果实TSS、TA和果实pH值等品质指标进行测定。每个处理100个葡萄果实，并且重复3次，整个实验重复2次。第二批实验：抗氧化能力研究。在第一部分实验的基础上选用10mol/L的核黄素处理葡萄果实，处理方法同上。处理结束后，将果实放在通风处1h后进行分装，在11C环境中贮藏8天，每隔2天测定以下指标。每个处理每个时间点40颗葡萄果实，并且重复3次，整个实验重复2次。22 数据测定221 TSS、TA和pH值测定取10颗葡萄果实，混合均匀后取汁液，用WYT型手持折光仪对TSS含量进行测定。TA含量的测定用碱滴定法进行，最后结果以柠檬酸百分数来表示。用pH计（PHS-25B）测定果汁的pH值。222 总酚、总花色苷、总黄酮和总胡萝卜素含量的测定称取5g果肉用10ml预冷的含有0.2%甲酸的80%丙酮匀浆。匀浆后在4C下12,000g离心15min，收集上清液。沉淀用另外10ml预冷的80%丙酮提取2次，再次在12,000g离心10min。将上清液进行合并，最后定容至25ml供下述分析。花色苷含量的测定采用pH差异法；总酚含量的测定采用福林试剂法；总黄酮含量的测定参照Toor和Savage的方法。总胡萝卜素含量的测定参照Kichtenthaler和Wellburn的方法测定。以上结果以mg/100gFW来表示。223 苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羟化酶（C4H）的测定称取10g果肉，加入50mL的200mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33mmol/L 的EDTA和0.05%的巯基乙醇（pH8.7），加入少量石英砂在冰浴中匀浆，随后在冷冻离心机以10000g离心20 min，取上清液用于测定酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量按Bradford的方法，以牛血清蛋白做标准。PAL活性的测定参照Zucker2的方法进行，将反应液每小时在290nm处吸光度0.001的变化作为一个酶单位；C4H活性参照Lamb和Rubery的方法进行测定，酶活性以反应液在340nm处光吸收值每分钟变化0.01吸光度值为一个酶活性单位。23 数据处理对于以上指标的测定腐烂率重复10次，其余指标均只重复3次。数据的处理分析采用SPSS12.0进行，差异显著性分析采用Tukey多重比较方法进行。运用SPSS12.0进行多项式回归分析。3结果与分析31 核黄素处理对采后葡萄果实总酚、总花色苷、总黄酮和总胡萝卜素含量的影响如图1所示，葡萄果实在1C的贮藏环境中，总酚和总黄酮的含量随着时间的延长而渐渐下降，总花色苷含量却先上升再缓慢下降，总胡萝卜素含量则呈缓慢上升趋势。10mol/L的核黄素处理显著（P0.05）抑制了葡萄果实总酚和总黄酮含量的下降，在整个贮藏期间处理组果实的总酚和总黄酮含量都显著（P0.05）高于对照组水平。同时，10mol/L的核黄素显著（P0.05）诱导了葡萄花色苷的合成，处理组花色苷含量在贮藏第2和4天达到峰值，分别比对照组水平高出20.9%和22.1%。10mol/L的核黄素还维持了葡萄果实贮藏过程中高水平的总胡萝卜素含量。贮藏结束时，处理组总胡萝卜素含量比对照组高27.6%。 贮藏天数图1 10mol/L对葡萄果实在1C下贮藏8天期间总酚（A）、总花色苷（B）、总黄酮（C）和总胡萝卜素含量（D）的影响32 核黄素处理对采后葡萄果实苯丙烷类代谢相关酶活性的影响植物中合成酚类和花色苷类物质主要是通过苯丙烷类代谢途径来合成的，而PAL，4-CL，C4H，CHS是限制该途径的关键酶。如图2所示，对照组果实中的PAL活性在1C贮藏期间总体呈缓慢上升趋势，C4H活性较为稳定，核黄素处理显著（P0.05）诱导了PAL的活性的提高，并在贮藏第2天达到峰值；同时经过核黄素处理，果实中C4H的活性也均显著（P0.05）高于对照组水平。 图2 10mol/L 核黄素处理对葡萄果实在1C贮藏8天期间C4H（C）、PAL（A）活性的影响33 核黄素处理对葡萄果实贮藏期间落果率和腐烂率的影响如图3所示，对照葡萄果实在1C贮藏环境期间，其腐烂率和落粒率都随贮藏时间的延长而快速上升，在贮藏28d后，对照果实的腐烂率和落粒率都已经达到48.25和55.67，这表示果实的品质急剧下降。10umol/L核黄素处理对葡萄果实在储藏期间腐烂和落粒等不良症状的发展进行了有效的抑制；用核黄素处理后的果实的腐烂率和落粒率在贮藏28d后分别仅为对照果实的30.1和25.2，其差异均极显著（P0.01）。图3核黄素处理对葡萄果实贮藏期间腐烂率和落果率的影响34 葡萄果实总酚含量与苯丙烷类代谢酶活性之间的相关性分析通过对葡萄果实果实在1C贮藏期间总酚含量与PAL，4-CL，C4H，CHS活性做回归分析，发现果实总酚含量与这四种酶活性都有一定的相关性，其相关系数分别为0.8654，0.6079，0.2275，0.4344（图4）。由此可见，PAL与总酚含量的相关度最高，4-CL也具有相当的相关性。图4 葡萄果实总酚含量与PAL（A），4-CL（B），C4H（C），CHS（D）间的回归分析4 讨论核黄素作为一种信号分子能够调节植物一系列生理和生化反应，这其中包括调节众多次生代谢产物的合成。近年来的研究发现，核黄素处理能够促进葡萄果实和叶片中茋类化合物的积累7，诱导草莓、黑莓和悬钩子果实酚类物质和花色苷类等抗氧化物质的合成8，并且提高苹果皮中-胡萝卜素的含量。在本试验中，核黄素处理显著诱导葡萄果实总酚、总花色苷、总黄酮和总胡萝卜素的合成，减少了它们在贮藏期间的损失。进一步的HPLC分析发现，10mol/L 核黄素对葡萄果实中一些活性单体物质如没食子酸、原儿茶酸、葡萄黄酮、槲皮素-3-O-芸香苷和矢车菊-3-葡萄糖苷在贮藏期间的含量有了一定的提高。同时随着这些抗氧化性物质含量的逐渐提高，经过核黄素处理的葡萄果实的超氧阴离子、羟基和DPPH自由基清除力以及还原力都明显高于对照组。许多酚类、黄酮类和花色苷类物质被证实具有强烈的抗氧化能力，能够清除活性氧自由基的累积，这一方面可以有效减少果实内部的氧化伤害9；另一方面可以减少心血管病、肿瘤和过敏等疾病的发生率10，所以提高这些次生代谢产物的含量能够有效提升果实的防御力和营养价值。果实多酚类化合物的合成均是通过次生物质代谢的一条重要途径苯丙烷类代谢途径进行的。近年来的研究证实，PAL、C4H、4-CL、CHS是植物苯丙烷类代谢途径的关键酶，这其中PAL是PPP第一步的限速酶，C4H和4-CL是催化合成酚类物质前体4-香豆酸-CoA的关键酶，CHS催化合成的查尔酮是合成类黄酮的重要前体物质11。在多种水果果实中的研究表明这些酶的活性与果实中苯丙烷类代谢物质合成有着密切关系8。本试验中首次研究了葡萄果实在贮藏1C期间果实中PAL、C4H、4-CL、CHS的活性变化，结果说明这些酶活性的变化和采后葡萄果实总酚或总花色苷含量的变化有一定的相关性，这其中PAL活性与果实总酚含量相关度最高（R2=0.86），与4-CL也有一定的相关度（4-CL R2=0.60），但C4H和CHS则相关度较低（C4H R2=0.2275，CHS R2=0.4344），这说明PAL是葡萄果实酚类物质合成的关键酶。核黄素处理能够显著诱导采后葡萄果实中PAL、C4H、4-CL、CHS活性的提高，同时也伴随着酚类物质含量的提高。这些说明核黄素可以通过诱导提高苯丙烷类代谢相关酶的活性从而促进了葡萄果实酚类、花色苷与其他次生代谢产物的合成。这成为核黄素处理维持采后葡萄果实采后抗氧化能力的可能机理。5 总结采摘后的“巨峰”葡萄果实的总酚、总黄酮和总花色苷含量随着贮藏时间的延长而渐渐下降，并且抗氧化能力逐渐丧失。10mol/L 核黄素处理可以有效的抑制采后葡萄果实在1C贮藏环境期间总酚、总黄酮和总花色苷含量的下降，同时10mol/L 核黄素也可以促进果实主要酚类单体物质如没食子酸、原儿茶酸、葡萄黄酮、何槲皮素-3-O-芸香苷和花色苷类主要单体矢车菊-3-葡萄糖苷含量的累积，从而提高其清除自由基的能力和总还原力，对果实的抗氧化能力进行有效的维持。苯丙烷类的代谢对葡萄果实中的多酚类物质的合成有密切影响，尤其是相关度最高的PAL和C4H。10mol/L 核黄素处理能对葡萄果实苯丙烷类代谢酶活性的提高进行有效诱导，从而完成对果实多酚类物质合成的促进工作。 参考文献：1 Heller W, Forkmann G. 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