LncRNA_XIST靶向...细胞增殖凋亡的作用机制研究_兰伟途.pdf

DOI:103969/j issn1672-7770 2023 02008胶质瘤基础LncRNA XIST 靶向 miR-543 对胶质瘤细胞增殖凋亡的作用机制研究兰伟途，王万宏，武峰，兰文达，何建昌【摘要】目的探讨长链非编码 RNA(LncRNA)XIST 通过 miR-543 对胶质瘤细胞增殖凋亡的作用及机制。方法RT-PCR 检测胶质瘤细胞株 U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783 中 XIST 表达水平及 si-XIST 转染U251 细胞后 XIST 与 miR-543 表达;在胶质瘤细胞 U251 中敲低 XIST 后，MTT 法、流式细胞术检测胶质瘤细胞的增殖和凋亡情况;用双荧光素酶报告基因验证 LncRNA XIST 与 miR-543 的靶向关系。结果XIST 在 U251细胞中表达水平(0 79 0 08)最高，故以 U251 细胞进行后续实验;与 XIST 组(2 35 0 17)、(0 37 0 05)相比，si-XIST 组 U251 细胞 XIST 表达水平(0 25 0 19)较低，miR-543 表达水平(3 15 0 36)较高(P 0 05);与 XIST 组(0 57 0 09)、(0 81 0 01)、(1 15 0 04)相比，si-XIST 组胶质瘤 U251 细胞A570 在24、48、72 h(0 22 0 02)、(0 31 0 03)、(0 55 0 04)明显降低(P 0 05)。与 XIST 组(1 12 0 56)%相比，si-XIST 组细胞凋亡率(35 64 4 31)%较高(P 0 05)。共转染 XIST-wt 和 miR-543 处理组中相对荧光素酶活性显著下降(1 15 0 22)vs(0 22 0 03)(P 0 05)。结论干扰 LncRNA XIST 可通过靶向负调控 miR-543 表达，抑制胶质瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡。【关键词】LncRNA XIST;miR-543;胶质瘤细胞;增殖;凋亡【中图分类号】R734 2【文献标志码】A【文章编号】1672-7770(2023)02-0158-05Mechanism of LncRNA XIST on proliferation and apoptosis of glioma cells through miR-543LAN Wei-tu，WANG Wan-hong，WU Feng，et al Department of Neurosurgery，Cangzhou PeoplesHospital of Hebei Province，Cangzhou 061000，ChinaAbstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of long non coding RNA(LncRNA)XIST on proliferation and apoptosis of glioma cells through miR-543 MethodsRT-PCR was used to detect the expression of XIST in U251，T98G，U87-MG，A172 and SW1783glioma cell lines and the expression of XIST and miR-543 in U251 cells transfected with si-XISTAfter knocking down XIST in U251 glioma cells，MTT assay and flow cytometry were used to detectthe effects on proliferation and apoptosis of glioma cells Double luciferase reporter gene was used toverify the targeting relationship between LncRNA XIST and miR-543 ResultsThe expression levelof XIST in U251 cells was(0 79 0 08)，so U251 cells were used for follow-up experimentsCompared with XIST group(2 35 0 17)，(0 37 0 05)，the expression level of XIST in U251cells in si-XIST group(0 25 0 19)was lower，miR-543(3 15 0 36)is highly expressed(P 0 05)Compared with XIST group(0 57 0 09)，(0 81 0 01)，(1 15 0 04)，A570 ofglioma U251 cells in si-XIST group decreased significantly at 24，48 and 72 h(0 22 0 02)，(0 31 0 03)，(0 55 0 04)(P 0 05)Compared with XIST group(1 12 0 56)%，theapoptosis rate of si-XIST group was(35 64 4 31)%(P 0 05)The relative luciferase activitywas significantly decreased in the co-transfected XIST-wt and mir-543 groups(1 15 0 22)vs(0 22 0 03)(P 0 05)，these results suggested that there was a targeted relationship betweenXIST and miR-543 and XIST negatively regulates the expression of miR-543ConclusionSilencing LncRNA XIST can negatively regulate the expression of miR-543 inhibit the proliferationand induce apoptosis of glioma cells，which may be a molecular target of glioma基金项目:河北省 2020 年度医学科学研究课题计划(20200172)作者单位:061000 沧州，河北省沧州市人民医院医专院区神经外科(兰伟途，武峰，兰文达，何建昌);唐山市丰南区医院神经外科(王万宏)851J Clin Neurosurg，April 2023，Vol 20，No 2Key words:LncRNA XIST;miR-543;glioma cell;proliferation;apoptosis胶质瘤为中枢系统最常见恶性肿瘤，因其浸润性生长方式造成致残率、死亡率较高，患者经常规治疗后中位生存时间仅 15 个月1。故研究抑制胶质瘤的分子机制，探索潜在的精准治疗靶点已成为相关领域研究热点。研究发现长链非编码 RNA(longnon-codingRNA，LncRNA)可 能 与microRNA(miRNA)互相作用，影响胶质瘤进展2。LncRNAXIST 为染色 体 失 活 特 异 转 录 物(X-inactivation-specific transcript X，XIST)基因产物，被证实是有生物学功能的 LncRNA3。研究表明，LncRNA XIST在胶质瘤细胞中呈高表达，可促进胶质瘤细胞生长、侵袭，且与患者生存时间及预后相关，可作为胶质瘤生物标记物4。miRNA 与肿瘤之间的关系已成为肿瘤学研究热点之一，miR-543 是一种促癌基因，Zhang 等5 报道，miR-543 在胶质瘤发展中发挥关键作用。然而，关于 LncRNA XIST、miR-543 在胶质瘤中的相互作用机制尚不清楚。本研究通过敲低XIST 表达，探讨 XIST 对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及机制。现报告如下。1资料与方法1 1细胞株与主要试剂人胶质瘤细胞株 U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783 购自美国典型培养物保藏中心。XIST 干扰剂(si-XIST)及其阴性对照(si-XIST-NC)、miR-543 模拟物及其阴性对照(miR-543-NC)(海吉玛制药技术有限公司)，实时定量PCR 试剂盒、逆转录试剂盒、Lipofectamine 2 000 转染试 剂 盒、荧 光 素 酶 报 告 检 测 试 剂 盒(美 国ThermoFisher 公司)，实验所用引物由上海科华生物工程股份有限公司合成。1 2细胞培养用含有 10%胎牛血清和 0 1%的青霉素和链霉素的 DMEM 培养基培养 U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783，培 养 环 境 为 5%CO2、37，隔天换液 1 次，细胞融合率达到 85%以上时传代，传代浓度 1 104个/mL。1 3RT-PCR 检测不同胶质瘤细胞株中 XIST 表达水平用 Trizol 试剂提取胶质瘤细胞株 U251、T98G、U87-MG、A172、SW1783 及用 si-XIST 转染后的 U251 细胞总 RNA，定量分析后，每组取等量RNA，根据逆转录试剂盒说明书合成 cDNA，用 PCR仪扩增，用实时定量 PCR 试剂盒进行定量分析。反应程序:95 60 s、95 15 s、60 60 s、72 30 s，循环 40 次。用 2 Ct法定量分析各细胞系中XIST 相对表达量。1 4细胞分组与转染将细胞分组为对照组、XIST 组、XIST-NC 组、si-XIST 组、si-XIST-NC 组，接种于 6 孔板，培养 24 h 后，参考转染试剂盒说明书用 XIST、XIST-NC、si-XIST、si-XIST-NC 分 别 转 染XIST 组、XIST-NC 组、si-XIST 组、si-XIST-NC 组细胞，对照组加入等量载体处理。转染 6 h 后更换为正常细胞培养液培养，待后续检测使用。1 5MTT 法检测胶质瘤细胞增殖活性取 si-XIST转染 U251 细胞 48 h 后的对数生长期细胞制成单细胞悬液，2 103/孔接种于 96 孔板，每组设置 8 个平行孔。转染培养后 24、48、72 h 取出培养板，加入20 L MTT 液培养 4 h，吸出上清液加入 150 L 二甲基亚砜振荡溶解，酶联免疫检测仪在 570 nm 波长检测各细胞的吸光度值。1 6流式细胞术检测胶质瘤细胞凋亡率取各组转染后对数生长期的 U251 细胞接种于 6 孔板内，继续培养48 h，收集细胞洗涤2 次，根据凋亡试剂盒说明书操作，用 400 L 标记缓冲液重悬细胞，加入5 L Annexin V-FITC、10 L 碘化丙啶(propidiumiodide，PI)，用流式细胞仪检验细胞凋亡率。1 7RT-PCR 检测 XIST 与 miR-543 表达水平收集转染后 U251 细胞，提取细胞总 RNA，反转录合成cDNA，以 cDNA 为模板进行 Real-time PCR 反应合成 XIST 与 miR-543，XIST 以 GAPDH 为内参，miR-543 以 U6 为内参。反应程序:95 5 min、94 40 s、59 40 s、72 40 s，35 个循环。引物见表1。用 2 Ct法定量分析 U251 细胞中 XIST、miR-543 相对表达量。表 1基因引物序列基因引物序列XIST上游5-caaGACTGTCACTTGGAATGTTc-3下游5-TGGTTTCCTGGTTCTGTGCCTT-3miR-543上游5-AAACATTCGCGGTGCACTTCTT-3下游5-CTCTGGGAATCGTCCTGAATCC-3U6上游5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3下游5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3GAPDH上游5-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3下游5-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-31 8双荧光素酶报告基因验证 XIST 与 miR-543 靶向关系经生物信息预测 XIST 与 miR-543 的结合片段，用 PCR 扩增，插入荧光素酶报告酶载体，构建XIST 野生型(wild type，wt)质粒。用基因突变技术951临床神经外科杂志 2023 年第 20 卷第 2 期对 XIST 序列上与 miR-543 结合位点上个别核苷酸进行突变，构建 XIST 突变型(mutant type，mut)质粒。用 miR-543 模拟物及阴性对照与 XIST-wt 或XIST-mut 共同转染 U251 细胞，24 h 后检验荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性作为内参，计算相对萤火虫荧光素酶活性。1 3统计学分析采用 SPSS 22 0 统计软件分析本次实验数据，XIST、miR-543 相对表达量等计量资料以均数 标准差(x s)表示，多组间比较进行单因素方差分析，进一步两两比较进行 LSD-t 分析。以 P 0 05 认为差异有统计学意义。2结果2 1各胶质瘤细胞株中 XIST 表达水平如图 1 所示，XIST 在多种胶质瘤细胞株中表达水平以 U251细胞最高，故选择 U251 细胞进行后续实验。图 1各胶质瘤细胞株中 XIST 表达水平2 2U251 细胞 XIST 与 miR-543 表达情况与对照组及各自 NC 组相比，XIST 组 U251 细胞 XIST 表达水平较高，miR-543 表达水平较低，si-XIST 组U251 细胞 XIST 表达水平较低，miR-543 表达水平较高(P 0 05);与 XIST 组相比，si-XIST 组 U251细胞 XIST 表达水平较低，miR-543 表达水平较高(P 0 05)。见图 2。与对照组相比，*P 0 05;与 XIST 组相比，#P 0 05;与各自 NC 组相比，P 0 05;与 24 h 相比，aP 0 05;与 48 h 相比，bP 0 05图 2si-XIST 对 U251 细胞 XIST 与 miR-543 表达的影响2 3敲低 XIST 抑制胶质瘤细胞增殖活性敲低XIST 表达后，各组胶质瘤 U251 细胞 A570 随时间延长而升高。与对照组及各自 NC 组相比，XIST 组胶质瘤 U251 细胞 A570 在24、48、72 h 较高(P 005)，si-XIST 组胶质瘤 U251 细胞 A570 在 24、48、72 h 较低(P 005);与 XIST 组相比，si-XIST 组胶质瘤 U251细胞 A570 在24、48、72 h 明显降低(P 0 05)，表明敲低 XIST 可抑制胶质瘤 U251 细胞增殖。见图3。与对照组相比，*P 0 05;与 XIST 组相比，#P 0 05;与各自 NC 组相比，P 0 05;与 24 h 相比，aP 0 05;与 48 h 相比，bP 0 05图 3si-XIST 转染后对 U251 细胞增殖活性的影响2 4敲低 XIST 促进胶质瘤细胞凋亡敲低 XIST表达后，与对照组及各自 NC 组相比，XIST 组细胞凋亡率较低(P 0 05)，si-XIST 组细胞凋亡率较高(P 0 05)，与 XIST 组相比，si-XIST 组细胞凋亡率较高(P 0 05)，表明敲低 XIST 可诱导 U251 细胞凋亡。见表 2、图 4。表 2敲低 XIST 后胶质瘤细胞凋亡率(x s，n=3，%)组别凋亡率对照组434 102XIST 组112 056*XIST-NC 组435 099si-XIST 组35 64 431*#si-XIST-NC 组437 101F 值142254P 值0 001注:与对照组相比，*P 0 05;与 XIST 组相比，#P 0 05;与各自 NC 组相比，P 0 05;与 24 h 相比，aP 0 05;与 48 h 相比，bP 00525XIST 与 miR-543 的靶向关系生物信息预测结果显示，XIST 序列中含有与 miR-543 互补的序列(图3A 所示)。双荧光素酶报告实验显示(图3B 所示)，共转染 XIST-wt 和 miR-543 处理组中相对荧光素酶活性显著下降(P 0 05)，表明 XIST 与 miR-543 有结合关系;转染 XIST-MUT 和 miR-543 的处理组中相对荧光素酶活性未受影响，差异无统计学意义(P 0 05)。见图 5。061J Clin Neurosurg，April 2023，Vol 20，No 2图 4敲低 XIST 后胶质瘤细胞凋亡率与 miR-543-NC 相比，*P 0 05图 5XIST 与 miR-543 的靶向关系3讨论肿瘤发生发展是多通路活化或抑制、多因子参与、多步骤的生物学过程，基因异常表达与失调在肿瘤微环境创建及其发生发展中占据重要地位。据 了 解，人 类 基 因 组 基 本 上 都 可 转 录LncRNA，与编码基因相比，LncRNA 的转录方式不同6。据报道，LncRNA 有干扰转录、诱导染色体重塑、改变细胞结构等功能，可通过与 miRNA、蛋白质分子或其组合相互作用，发挥着抑癌或促癌作用7。最近，LncRNAs 和 miRNAs 之间的相互作用引起了很多关注。多项研究报道，LncRNA 异常表达不但会影响真核细胞基因表达，还可通过调控细胞增殖使其获得无限增殖能力，提升癌症发生率，并诱导癌症转移与恶化8 9。Luo 等10发现LncRNA CASC11 可通过 miRNA-150 促进膀胱癌细胞的增殖。Liu 等2报道，LncRNA 参与了胶质瘤血管生成过程。因此研究 LncRNA 在胶质瘤中分子作用机制十分必要，可为胶质瘤临床治疗提供新思路。XIST 最早在 1991 年被发现，后续研究表明其在多种癌症病理进程中呈异常表达。Salama 等11 报道，XIST 在乳腺癌中表达明显上调。Liu 等12 发现，XIST 下调可抑制非小细胞肺癌发展。XIST 参与了 X 染色体灭活启动阶段，同时参与了细胞全部过程，影响癌症增殖与凋亡13;可见，XIST 在胶质瘤中也发挥了相同作用。为此，本研究首先检验了XIST 在几种胶质瘤细胞株中的表达水平，结果发现U251 细胞中 XIST 表达水平最高，故选择 U251 细胞行后续实验。细胞无限增殖为癌症基本特征之一，抑制癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡是临床治疗癌症的主要途径。经 MTT 与流式细胞术检验发现，敲低XIST 表达后，胶质瘤 U251 细胞 A570 在24、48、72 h均明显降低，细胞凋亡率明显升高，提示敲低 XIST可抑制胶质瘤 U251 细胞增殖活性，并诱导其凋亡。Luo 等14 发现 XIST 在胶质瘤中也发挥癌基因功能，对胶质瘤增殖、迁移等生物学行为均有影响，本研究与其结果存在一致性。这些结果证明了 XIST在胶质瘤中所扮演的癌基因角色以及对胶质瘤生物学行为的影响情况，而这一项研究结果为加深本研究对 XIST 在胶质瘤细胞生物学行为中潜在机制的理解提供了新的思路。miR-543 在人类 14 号染色体 DLK1-DIO3 区域，含有较大的非编码 RNA 群，可通过调控各种靶基因影响癌症的发生与转移。Fan 等15 发现，miR-543可通过靶向 KRAS、MTA1 和 HMGA2 抑制结直肠癌的生长和转移，因此认为 miR-543 是一种候选肿瘤抑制分子。但近几年报道发现，miR-543 也可发挥促癌基因的作用;Chen 等16报道 miR-543 对肾细胞癌的增殖与转移有促进作用;Wang 等17表明miR-543 可在口腔鳞状细胞癌中充当新型致癌基因。由此可知，miR-543 在不同肿瘤类型中发挥的作用不同，在胶质瘤细胞中发挥何种作用尚不明确。本研究通过 RT-PCR 检测发现，敲低 XIST 后，U251 细胞中 XIST 表达下调、miR-543 表达上调，结合敲低 XIST 对 U251 细胞增殖、凋亡的影响研究结果可知，miR-543 在胶质瘤中扮演促癌基因的161临床神经外科杂志 2023 年第 20 卷第 2 期角色。由此可见，miR-543 表达上调对胶质瘤发生发展有促进作用，应高度重视胶质瘤诊断中 miR-543 的检测，且在胶质瘤治疗期间可通过干扰miR-543 表达从而达到治疗目的，但上述想法在临床上是否可行，有待进一步研究证明。根据 XIST与 miR-543 可能存在的结合位点构建包含 miR-543 在内的 XIST-wt、XIST-mut 基因报告载体，经双荧光素酶报告基因实验发现，XIST 与 miR-543 存在靶向关系，由此可见，XIST 可能是胶质瘤的分子靶点。综上所述，XIST 在胶质瘤发展中发挥了致癌作用，敲低胶质瘤细胞 U251 细胞株中 XIST 表达，可抑制胶质瘤细胞增殖，并诱导其凋亡，XIST 可通过靶向负调控 miR-543 影响胶质瘤细胞的生物学行为，可能是胶质瘤分子靶点，靶向 XIST/miR-543 可能是治疗胶质瘤的新兴方法，这对临床治疗胶质瘤而言是有意义的发现。但本研究亦存在一些缺陷，比如仅从敲低 XIST 了解其对胶质瘤细胞生物学行为的影响，未能从过表达 XIST 方面验证本研究的结论，且单纯观察了胶质瘤细胞增殖活性、凋亡率，未能观察敲低 XIST 对胶质瘤细胞侵袭、迁移等生物学行为的影响，这些未来会进一步完善。利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献 1王雅宁，王月坤，孔梓任，等 老年高级别胶质瘤的临床特点和治疗 J 中华神经外科杂志，2020，36(2):146 150 2Liu ZZ，Tian YF，Wu H，et al LncRNA H19 promotes gliomaangiogenesisthroughmiR-138/HIF-1/VEGFaxis J Neoplasma，2020，67(1):111 118 3Chen YK，Yen Y The ambivalent role of lncRNA Xist incarcinogenesis J Stem Cell Rev Rep，2019，15(2):314 323 4Cheng ZH，Luo C，Guo ZL LncRNA-XIST/microRNA-126 spongemediates cell proliferation and glucose metabolism through theIRS1/PI3K/Akt pathway in gliomaJ J Cell Biochem，2020，121(3):2170 2183 5Zhang Y，An JY，Pei YC LncRNA SNHG6 promotes LMO3expression by sponging miR-543 in glioma J Mol Cell Biochem，2020，472(1 2):9 17 6赵念念，冯榕，张丽，等 LncRNA/hnRNP 在调控基因表达中的机制及功能J 生命的化学，2020，40(10):1815 1824 7Xu LG，Huan L，Guo TA，et al LncRNA SNHG11 facilitates tumormetastasis by interacting withand stabilizing HIF-1 JOncogene，2020，39(46):7005 7018 8Yang X，ZhangS，HeCY，etalMETTL14suppressesproliferation andmetastasisofcolorectalcancerbydown-regulating oncogenic long non-coding RNA XIST J MolCancer，2020，19(1):46 9Huang RL，Zhu LJ，Zhang YL XIST lost induces ovarian cancerstem cells to acquire taxol resistance via a KMT2C-dependent way J Cancer Cell Int，2020，20(9):436 10 Luo HR，Xu CD，Le W，et al lncRNA CASC11 promotes cancercell proliferation in bladder cancer through miRNA-150 J J CellBiochem，2019，120(8):13487 13493 11 Salama EA，Adbeltawab RE，El Tayebi HM XIST and TSIX:novelcancer immune biomarkers in PD-L1-overexpressing breast cancerpatients J Front Oncol，2020，9(1):1459 12 Liu JL，Yao L，Zhang MY，et al Downregulation of LncRNA-XISTinhibited development of non-small cell lung cancer by activatingmiR-335/SOD2/ROS signal pathway mediated pyroptotic celldeathJ Aging(Albany NY)，2019，11(18):7830 7846 13 Deng CK，Hu XL，Wu K，et al Long non-coding RNA XISTpredicting advanced clinical parameters in cancer:a meta-analysisand case series study in a single institution J Oncol Lett，2019，18(3):2192 2202 14 Luo CX，Quan ZP，Zhong B，et al lncRNA XIST promotes gliomaproliferation and metastasis through miR-133a/SOX4J ExpTher Med，2020，19(3):1641 1648 15 Fan CN，Lin YC，Mao YB，et al MicroRNA-543 suppressescolorectal cancer growth and metastasis by targeting KRAS，MTA1andHMGA2 JOncotarget，2016，7(16):21825 21839 16 Chen ZY，Du Y，Wang L，et al MiR-543 promotes cell proliferationand metastasis of renal cell carcinoma by targeting Dickkopf 1through the Wnt/-catenin signaling pathway J J Cancer，2018，9(20):3660 3668 17 Wang LP，Chen WH，Zha J，et al miR-543 acts as a noveloncogene in oral squamous cell carcinoma by targeting CYP3A5 J Oncol Rep，2019，42(3):973 990(收稿 20211228修回 20220414櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵櫵)(上接第 157 页)25 Scarpelli DB，Jaboin JJ Exploring the role of resection post-radiation therapy in gliomasJ Int J Radiat Oncol Biol Phys，2022，113(1):11 26 Mladenovsk M，Valkov 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