荧光定量实验方法操作基础手册.doc

Stratagene定量PCR仪原则曲线制作办法定量PCR定量基本原理就是用已知拷贝数梯度稀释样品作出原则曲线，未知样品和原则曲线相比较从而得到未知样品量。无论是在基因表达分析实验还是在病原微生物检测应用中均有也许要做原则曲线，分别用于绝对定量和相对定量。原则样品准备1、绝对定量。绝对定量就是要拟定未知样品拷贝数。对于此类实验原则品是通过某种办法制备得到已知拷贝数具有目的片段核苷酸序列。最常用是插入有目的序列质粒，由于质粒是环状DNA有较强稳定性，并且分子量比较大定量时候比较精确。也有用线状PCR产物作为原则品，普通要比扩增目的片段要大某些，这也是为了获得分子量比较大片段，提高拷贝数精确性。原则品拷贝数是通过紫外定量办法来拟定，先得到原则品浓度C(ng/uL)，由于无论是质粒还是PCR产物它们序列都是已知，这样通过核苷酸相对分子量和原则品序列信息估算出原则品分子量B，则原则品拷贝数A(copy/uL) 为：A=C/B6.02E+142、相对定量。重要是针对基因表达分析实验而来，由于要懂得都是相对数值（对照样品和实验样品中基因表达比值），这样就不需要懂得精准拷贝数，因此原则品也就不必懂得精准拷贝数，只需懂得稀释倍数就可以了。实验中原则品可以是来源比较丰富细胞或组织RNA转录得到cDNA。将这种cDNA进行梯度稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（详细实验要依照详细状况来调节稀释倍数。最佳能作一种预实验来看看什么样稀释倍数比较适合这种基因扩增）。而对于各个稀释倍数要对它拷贝数进行赋值，这个值固然不是原则品中真实具有基因数量，固然在基因表达分析中也不需要，而是规定依照稀释倍数给每一种稀释度人为赋予拷贝数，这只是为了以便实验最后成果计算而已。例如可以把前面稀释十倍样品赋值为10000个拷贝，100倍赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍赋为10等。要注意，赋值数目倍数差别和稀释倍数应当是同样，例如前面是10稀释，背面赋值也是10倍变化。如何做原则曲线在定量实验中原则品是要和未知样品一起进行定量实验，这样在实验结束，无论是原则品还是未知样品都将跑出曲线，获得了Ct值。那么先可以把未知样品放到一边，对于原则品来说，既获得了Ct值，还懂得她们拷贝数（虽然对于相对定量来说这个拷贝数是咱们自己赋予）。这样可以通过原则品Ct值和拷贝数做一条原则曲线（以拷贝数为横坐标，而Ct值为纵坐标）。一旦作出了原则曲线，而未知样品Ct值懂得（通过实验求得），这时候就在原则曲线上进行定位，就可以得到未知样品拷贝数了。事实上，操作起来没有那么复杂，只需要告诉软件哪个孔是原则品，哪个是未知样品，以及原则品拷贝数等必要信息，软件会自动帮把原则曲线和未知样品拷贝数计算出来了。举例来说如何进行设立1、先进入软件，在板设立中选取所放样品位置，并标上unknow或standard等信息。2、选取要使用荧光染料。3、设立复孔。如果有些孔有重复就用用样数字标明，这样仪器就懂得哪些是重复，最后成果解决话也可以取平均等操作。有相似标号系统就以为是同样样品重复。4、原则品赋值接下来要给原则品赋上值，系统要懂得按照什么去计算原则品赋值要先选上要赋值原则品，然后在工具面板中输入相应值。自动增长稀释倍数填入原则品量为了以便设立系统有一种自动增长稀释倍数设立，点开后就可以选取你稀释倍数，然后用鼠标去选取孔时候会自动增长选取稀释倍数每次选取不同孔，在里面赋值会自动按照倍数增长5、设立温度在这里提供一种对于SYBR染料惯用温度控制模板，可以参照。注意最后溶解曲线制作过程在升温过程中选取标有all放大镜，代表从55到95逐渐升温过程中不断检测荧光信号。6、设好了之后可以运营程序了，最后原则曲线和扩增曲线系统会自动给出，也会算出未知样品拷贝数。Stratagene荧光定量PCR仪基因表达分析解决方案Stratagene荧光定量PCR仪和配套Mxpro软件在解决基因表达分析方面功能比较强大，下面简要阐明如何使用该软件来进行基因表达分析。例如要分析IL1基因表达状况，用看家基因GAPDH作为内参，采用是SYBR GreenI染料法。1、板设立1.1、专门基因表达分析实验模式。打开Mxpro程序操作窗口，一方面弹出对话框是要顾客选取要进行实验类型，做基因表达分析可以选取第二项Comparative Quantitation (Calibrator)。1.2、以便类型选取和孔设定。在板设立中选取样品类型，可以将样品名称写成GAPDH和IL1，并将GAPDH设为看家基因（NORM），这样设立非常清晰，有助于分析成果。如果实验中使用了复孔，则在复孔上标上相似数字，代表这些样品是重复，下图中每个样品重复三次。 基因表达分析实验同一种cDNA既要做目基因，也要做看家基因。看家基因和目基因来自同同样本用相似字母来标记，如果是对照样品则标上Calibrator。1.3、以便而快捷反映条件设定。可以很容易设定扩增反映条件和熔解曲线条件。2、成果分析2.1、各种分析成果可供选取扩增曲线，其中红色表达目基因，绿色表达看家基因（和板设立中选取颜色相似）原则曲线，看家基因和待测基因原则曲线都能被作出来，并显示出分别扩增效率。如果不做原则曲线，顾客也可以依照经验写入扩增效率值，这样最后计算成果也可以依照顾客写入扩增效率进行计算。扩增效率引入办法是点软件操作界面上方Term settings键，打开Analysis term settings对话框，点里面Efficiency Settings，在efficiency框中输入不同基因扩增效率。熔解曲线，其中红色表达目基因，绿色表达看家基因，峰位置代表产物Tm值温度，图中可以看到看家基因和待测基因产物基本具备相似Tm值。基因表达差别柱壮图显示，程序可以自动计算出基因表达差别，并用柱壮图显示出来，每一种柱表达一种样本，基因表达趋势清晰可见，对照样本被算为1。柱壮图还可以表达到Log形式，这样可以清晰分开上调和下调样本。数据文本显示，实验得到数据可以以文本形式显示出来，顾客可以很直观看到用于计算详细数据，自己也可以运用这些数据进行记录计算。2.2、数据导出实验产生成果都可以以便地导出，图片可以导成图片格式、Excel图片或Powerpoint等，数据也可以导入Excel或文本文献中。各种数据导出形式。基因表达分析板设立办法Stratagene荧光定量PCR仪应用软件MxPro提供了比较强大基因表达差别分析功能，要较好运用这些功能前提是要告诉仪器某些必要板设立信息。下面举例子来阐明如何来进行板设立。在这里举一种例子，用SYBRGreenI染料法，用GAPDH作内参，检测不同样品中LI1基因表达差别，在这里要设立各自原则品样品和阴性对照等信息。一方面打开分析软件，选取基因表达分析一项基本信息设立：软件一方面浮现界面就是板信息设立界面。先选中要放置反映管位置A-D四行，接下来就是在程序界面右边设立命令面板上给选中孔上填入信息。信息输入顺序普通是从上到下。设立命令面板一方面要选取孔类型（Well type）。在孔类型中可以选取Unknow(未知样品)，Standard（原则品），NTC（阴性对照）等。为了以便起见，我先将所有孔都设立成Unknow。然后再选取使用荧光染料，这里由于只用到了SYBR GreenI一种荧光染料，因此就选上SYBR。如果实验当中用了几种荧光染料，就可以将这几种荧光染料都选中。当选中了荧光染料之后，板设立基本信息已经输入电脑了，实验可以运营了。如下信息可以在实验进行之前设立，也可以在实验结束之后再设立。不同基因设立：由于做基因表达分析实验普通要做目基因和看家基因，因此接下来要告诉软件目基因和看家基因名字，软件才干加以区别。点Assign assay name打开如下对话框写看家基因和目基因名 由于用SYBR染料做两种基因，因此应当在SYBR背面Assay栏中写入看家基因和目基因名称。假设前两排是GAPDH，后两排是IL1，则可以在assign assays within selected wells中选取SYBR并输入GAPDH和IL1名称，同步你可以选取一种颜色代表不同基因。这样系统就可以辨别哪个孔是什么基因了。用红色代表IL1这时候软件只懂得在这个实验中检测了两个基因，而哪个基因是看家基因并不懂得，下一步是要告诉系统哪一种是看家基因，在Normalizing assay中选取GAPDH就可以了这时候本来图上GAPDH就变成了NORM重复设立：接下来设立重复，每一种样品设立了三个重复。如果一种样品重复三次，这些相似重复样品可以标上同样一种数字，这时系统就懂得标有同样数字孔是重复样品，将来在分析数据时候可以对这些样品进行取平均等操作。原则品设立：先将原则品和未知样品分开，在本实验中A行为看家基因原则品，C行为目基因原则品。分别选取A行和C行，在Well type下拉菜单中选取Standard将其设立成原则品类型。在设立命令面板Standard quantity中写入原则品量。可以运用Auto-Increment来自动设立稀释倍数。样品组织分类：看家基因和目基因未知样品应当相应起来，即同一种cDNA样品应当既作了目基因也作了看家基因。再接下来把来自同一种cDNA样品目基因和看家基因扩增标出来。可以在Identify associations中Assoc.symbol下拉菜单中选取一种字母来标记用同一种cDNA模板分别扩增目基因和看家基因孔。上图中ABCD表达标号相似是来自同一份组织，这样就把同一份组织中看家基因和目基因相应了起来。选取对照样本：在基因表达实验中总要选取一种cDNA样本作为基因表达基准，例如实验中会有一种正常样本，最后表达到果作为1，所有其她样本基因表达量都和它相比较，这个作为基准样品称为Calibrator。在板上选中这个cDNA样品相应目基因和看家基因，在well type中选取calibrator。这样板设立就完毕了。熔解曲线设立办法熔解曲线原理定量PCR荧光标记办法普通有两种，一种是探针法，一种是染料法。染料法普通指是用SYBR GreenI染料作为荧光标记。SYBR GreenI这种染料之因此可以用来定量，是由于它特殊性质决定。第一，它可以非特异性地结合到双链DNA小沟处，和单链DNA以及蛋白都不结合。第二，SYBR GreenI这种染料游离存在状况下它没有荧光，一旦它和双链DNA结合了，再用一定波长光激发它时就可以发出很强荧光（大概是游离状态1000倍）。咱们再想PCR过程，PCR最后产物正是双链DNA，随着每次循环双链DNA产物数量成指数增长。如果把SYBR GreenI这种染料加入到反映体系中，就可以随着每次循环结合到双链DNA产物上。产物量越多，结合染料就越多，染料发出荧光就和产物量成正比，因而通过检测SYBR GreenI荧光就可以时实监控PCR反映产物变化。SYBR GreenI染色法优越性是使用以便，不用专门设计探针。想检测不同基因只用在PCR体系中加入同一种荧光物质就可以。并且价格非常便宜，因而在科研领域里还是非常惯用。但它重要缺陷是敏捷度不够。由于SYBR GreenI可以和DNA双链非特异性结合，那么如果PCR反映有非特异性扩增产物或引物二聚体话也会结合这种染料，因而实验成果往往就会受到某些因素干扰。当采用SYBR GreenI染料法做定量PCR实验时为了拟定实验产物中有无引物二聚体或非特异性引起，普通要在反映结束之后做一种熔解曲线。熔解曲线原理是依照SYBR GreenI染料只和双链DNA结合特性，设计一种从55到95逐渐升温过程，随着温度升高，双链DNA在不断解链，SYBR GreenI染料结合数量也在减少，发出荧光也越来越少，当到达产物Tm值时候，荧光信号突然下降，然后趋于平缓，这时双链完全解开，不发荧光。一种典型熔解曲线如下（纵坐标是荧光信号强度，横坐标是温度）：通过数学换算，荧光信号变化最快温度就可以换算出一种峰，这个峰位置就代表产物Tm值。如果产物当中有各种组分例如引物二聚体（如下图），这样就会浮现各种峰，这样就可以判断出与否有引物二聚体或其她组分，反映条件与否需要优化。Stratagene软件如何进行熔解曲线设定Stratagene软件熔解曲线实验办法设定有两种拖到温度曲线上1、运用All point检测。Stratagene软件具备两种检测荧光检测方式，一种是End point另一种是All point，End point是在整个反映环节末尾检测荧光信号，All point是在整个反映环节中尽量多检测荧光信号。因此就可以运用All point在55到95升温过程中检测荧光信号。设立办法是将All point标志从设立命令面板上拖到温度曲线上。2、运用循环升温设立。这是运用PCR仪每个循环温度可以升高一定温度特性来做。先设计出如下温度曲线形式： 在40个循环反映结束后，又设计了两个Segment，3和4。Segment3是升温到95，1个循环。接着设立Segment4中温度，可以双击55温度平台打开如下对话框：在Cycle increments中设立循环温度升高幅度。如果设计每个循环升高0.2，则在Temperature中输入0.2，如果从55升温，每次增高0.2则需要进行201个循环才干到达95，因此循环数应为201。在Data collection中选取Type为End point，#of endpoints设定为1（只采集一次荧光信号），设定成果如下：最后得到温度曲线设立图是：SNP检测应用荧光定量做SNP检测原理SNP（single nucleotide polymorphisms）即单核苷酸多态性，是人类基因组中最简朴一种多态性形式，是指在不同基因样本中，某一位点只有一种碱基不同。虽然DNA构成中有4种碱基，但在SNP中普通只有两个碱基互换，因此它是一种二态性标记。正由于SNP这些特点，要用荧光定量PCR技术检测某一未知样品与否有某一位点SNP，就只需要设计两条探针分别用不同荧光标记，这两条探针只在这个SNP位点有一种碱基不同。最后用定量PCR反映检测是哪一种荧光被释放出来了，就可以阐明该位点应当是如何SNP。最后简介如何用定量PCR办法来检测未知样品SNP位点。如图，例如咱们已知某一位点也许发生A到CSNP变化，因而咱们可以设计两种探针在该位点分别设成T，G。只有一种碱基差别，分别把这两种探针标记成不同荧光。这样在PCR反映过程中，探针只有和模板完全匹配荧光才干被释放出来，因此依照检测到是哪种荧光就可以拟定与否有相应SNP位点。这是检测成果，左边检测到一种荧光，阐明这个样本该位点只具有一种碱基。而右边图中两种荧光都被检出，阐明这些样本中两种碱基SNP均有。Mx3000P 中SNP分析功能Mx3000P定量PCR软件中提供了专门强大SNP分析功能。当顾客打开软件后一方面看到是实验类型选取涉及：普通定量，相对定量，SNP分析，只读板实验等，依照顾客需要可以选取不同实验，就可以进入不同实验模式开展实验了。如果要进行SNP分析可以有两种选取，可以选取第四项Allele Discrimination/SNPs Real-Time，就进入专业定量SNP分析程序界面，也可以选取最后一项Plate Read/Allele Discrimination进行专业SNP终点鉴别。定量SNP分析是指运用定量PCR扩增办法检测SNP，可以选取实验类型对话框中第四项Allele Discrimination/SNPs Real-Time在板设立框中顾客可以轻松设立样品类型、名称、所用荧光素等必要信息。由于SNP分析中需要进行类型鉴定，因此必要设立可靠对照，普通实验当中要设立两种荧光阴性对照和阳性对照，还要有空白对照才干进行成果鉴定。成果运营后有强大分析功能，涉及扩增曲线分析、双点图分析、板数据计算、板成果显示和成果文本显示等功能。非常以便易用顾客可轻松掌握。顾客如果只想通过终点判读办法分析SNP也可以选取最后一项Plate Read/Allele Mx3000P只读板定量分析是指在PCR反映结束之后，运用定量PCR荧光读取功能，对反映终点进行检测，再通过软件来判断SNP分型办法。Mx3000P软件提供了Plate Read/Allele Discrimination功能，进入只读板模式来分析SNP，Mx3000P同样提供强大分析功能。普通实验当中也要设立两种荧光阴性对照和阳性对照，还要有空白对照才干进行成果鉴定。荧光定量PCR在基因表达分析中常用问题所谓基因表达就是指在特定期刻某种感兴趣基因在组织或细胞中mRNA表达数量。众所周知，诸多疾病（如肿瘤）发生发展，诸多药物作用机理，诸多生物代谢调控作用等都和基因表达变化关于，因而对基因表达进行精准定量是十分重要。过去为了对mRNA进行定量有了各种各样办法，如Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交、老式PCR等，但是咱们也都懂得这些技术敏捷性较差，重复性不好，操作比较啰嗦，已经无法满足当前科研和检测需要，于是荧光定量PCR技术也就应运而生了。荧光定量PCR技术能对核酸进行精准定量，因而大大提高了在基因表达精确性和敏捷度，广泛应用于肿瘤研究、药物筛选、功能基因组研究等各个领域，当前已经成了诸多科研文章刊登重要实验内容。基因表达分析中常用到问题1、采用什么样荧光标记办法？荧光标记办法普通有两种，一种是探针法，另一种是染料法，虽然用SYBR Green染料。由于探针合成成本比较高，探针设计也有一定难度，因此在基因表达分析中经常采用SYBR Green染料法进行荧光定量检测。检测原理是SYBR GreenI游离状态下不发荧光，但当反映体系中有双链DNA存在状况下SYBR GreenI就可以非特异性结合到DNA双螺旋小沟处，发出很强荧光。这样随着PCR反映进行，产物也在不断积累，结合到双链PCR产物上荧光也就越来越多。通过检测荧光信号强度就可以反映出反映体系中产物积累变化状况。这种SYBR GreenI染色法优越性是使用以便，不需要针对不同基因专门设计探针。想检测不同基因只用在PCR体系中加入同一种荧光物质就可以。并且价格非常便宜。但它重要缺陷是敏捷度不够，如果PCR反映中产生了引物二聚体也同样会导致荧光信号积累，因而在做实验前去往需要对实验条件进行摸索。2、要检测基因有哪些？ 基因表达分析目就是检测某种咱们感兴趣基因在不同组织或细胞中表达差别。荧光定量PCR技术可以对核酸物质含量进行精准定量，也就成了研究基因表达差别一把利器。在基因表达分析实验中要检测两个基因，一种是目基因另一种是看家基因。之因此要引入看家基因最重要是由于不能拟定要比较样品所用组织起始量相似。就是说例如提取正常样品基因时用了100个细胞，而提取病变样品时只用了10个细胞，这时候基因表达差别也许是由于提取时候样品细胞数不同引起。为了纠正这种误差，选用以为在两个样本中表达量不变看家基因作为内参照，来去除样品细胞数不同而带来干扰。例如，要研究某个基因在肿瘤样品和正常样品中基因表达差别。在实验中发现要研究正常样品中看家基因表达量是肿瘤样品中10倍，就以为正常样品细胞数就是肿瘤样品细胞数10倍，那么在肿瘤样品中目基因基因表达量应当乘以10倍，才干和正常样品进行比较。3、什么是扩增效率？ 从理论上来说PCR扩增应当按照2倍数向上递增，这样扩增效率咱们以为是100%，但是事实上实验不能保证扩增效率是100%，甚至有时由于实验条件、选用试剂、稀释等存在问题扩增效率尚有也许高过100%。扩增效率可以通过原则曲线来计算出来，它只和原则曲线斜率关于。PCR扩增效率 = 10(-1/slope) 14、基因表达差别如何计算？基因表达差别计算是通过所得到Ct值来计算，要计算两个样品（待测样品和对照样品）目基因表达差别必要检测得到4个Ct值：待测样品和对照样品中目基因和看家基因Ct值。对照样品待测样品 Ct1目基因Ct2看家基因那么基因表达差别应当计算为 基因表达差别=2（Ct1-Ct2）这是公式推导过程是依照PCR基本原理而来。PCR每次循环产物量积累过程应当是以2倍数进行增长，即下一次循环是上一次循环产物量2倍。如果正常样本起始模板数是X，待测样本起始模板数是Y，那么当两个样本都达到域值时，它们产物量应当是同样，如果这个时候两个样本Ct值分别为Ct1和Ct2，则有：X2Ct1=Y2Ct2待测样本和对照样本起始模板数之比应为：Y/X=2 Ct1/2 Ct2=2Ct1同理待测样品和对照样品中看家基因起始模板比就应当是：Y/X=2 Ct1/2 Ct2=2Ct2这样通过看家基因纠正基因表达差别应当是：基因表达差别=2（Ct1-Ct2）这个公式前提是看家基因和目基因扩增效率相似并且都为100%，由于只有这个时候产物增长速度才有2倍关系，否则就要引入目基因和看家基因扩增效率E1和E2来修正这个公式。基因表达差别=Ct1Ct2(1+E1)(1+E2)5、原则品如何准备？从理论上说基因表达分析实验是不需要原则品，由于无需精准定出研究组织或细胞中某种基因真实拷贝数，感兴趣只是目的实验组和对照组某种基因表达量比值，也就是说想要得到只是一种相对数值和真实拷贝数没有直接关系。那么在某些实验中为什么还要做原则曲线呢？这是为了纠正扩增效率不同问题。从理论上来说PCR扩增应当按照2倍数向上递增，这样扩增效率咱们以为是100%，但是事实上实验不能保证扩增效率是100%，特别在不同基因扩增中间。由于基因表达分析实验用到了目基因和看家基因两种基因，这样这两种基因扩增效率会有所不同。那么如果用看家基因来校正目基因就会带来误差，刚才公式也就不再合用了。这样考虑到看家基因和目基因不同扩增效率，就需要做原则曲线来精准反映样品管中基因相对含量。基因表达分析原则品准备相对比较简朴，由于要懂得都是相对数值（对照样品和实验样品中基因表达比值），这样就不需要懂得精准拷贝数，因此原则品也就不必懂得精准拷贝数，只需懂得稀释倍数就可以了。实验中原则品可以是来源比较丰富细胞或组织RNA转录得到cDNA。将这种cDNA进行梯度稀释，可以是稀释10倍，100，1000，10000等倍（详细到你实验要依照详细状况来调节稀释倍数。最佳能作一种预实验来看看什么样稀释倍数比较适合你这种基因扩增）。而对于各个稀释倍数咱们要对它拷贝数进行赋值，这个值固然不是原则品中真实具有基因数量（在基因表达分析中也不需要），而是依照稀释倍数给每一种稀释度人为赋予拷贝数，这只是为了以便实验最后成果计算而已。例如把前面稀释十倍样品赋值为10000个拷贝，100倍赋值为1000个拷贝依次类推把10000倍赋为10等。要注意，赋值数目倍数差别和稀释倍数是同样，例如前面是10倍稀释，背面赋值也是10倍变化。最后实验成果可以得到样品拷贝数，再通过拷贝数来分析不同样品中基因表达倍数差别。需不需要作原则曲线要依照实验详细状况来定，如果通过实验验证，发现目基因和看家基因扩增效率基本一致并都接近1，并且对实验精度规定不高状况下就可以不用做原则曲线，直接通过公式来计算基因表达差别。但是如果研究样本自身基因表达差别就不大，如果进行忽视就也许导致较大误差，这样就需要做原则曲线来纠正这种误差了，作到较为精准定量。