Real-time-PCR及产品介绍.ppt

Real-time PCRReal-time PCRPCR发展展历程程v第一代第一代PCR终点点PCRv第二代第二代PCR实时PCR（Real-time PCR）v第三代第三代PCR数字数字PCR（Digital PCR）实时荧光光PCR的基本原理的基本原理v通通过对PCR扩增反增反应中每一个循中每一个循环产物物荧光信号的光信号的实时检测从而从而实现对起始模板起始模板定量（标准曲准曲线）及）及定性的分析。的分析。PCR动力学曲力学曲线和四个和四个阶段段三个重要的概念三个重要的概念v基基线（Baseline)Baseline)v阈值(Threshold)Threshold)vCtCt基基线（Baseline)Baseline)v是背景曲是背景曲线的一段，从反的一段，从反应开始不久开始不久荧光光值开始开始变得得稳定，直到所有反定，直到所有反应管的管的荧光都将要，但是光都将要，但是还未超出未超出背景。背景。阈值(Threshold)Threshold)阈值 （threshold threshold）：q荧光超过本底时的临界数值。q 荧光域值的默认设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要保证在指数增长期。CtCt值Ct值的定义：PCRPCR扩增增过程中，程中，扩增增产物的物的荧光信号达到光信号达到设定的定的阈值时所所经过的的扩增增循循环次数次数C(t)value PCR扩增的数学模型增的数学模型荧光定量光定量PCR技技术的主要的主要优点点各种各种荧光光PCR仪器器Real-time PCRReal-time PCR过程程检测模式模式vSYBR Green SYBR Green v水解探水解探针v Taqman探针（最常见）v Taqman MGB探针（凯普）v杂交探交探针v 分子信分子信标（Molecular BeaconMolecular Beacon）v 双双杂交探交探针（FRETFRET探探针）v SYBR Green SYBR Green SYBR GreenSYBR Green染料法的特点染料法的特点TaqmanTaqman探探针Taqman MGBTaqman MGB探探针HPV Real-time PCRHPV Real-time PCR产品主要厂家品主要厂家复星复星科科华上海上海之江之江达安达安凯普普凯杰杰港港龙罗氏氏复星复星科科华上海上海之江之江达安达安凯普普凯杰杰港港龙雅培雅培市市场主要主要荧光光PCR HPVPCR HPV检测产品品凯普普 12+2 12+2 High-risk HPVHigh-risk HPV适用的主要适用的主要适用的主要适用的主要荧荧光光光光PCRPCR仪仪：LineGene 9660LineGene 9660、ABI 7500ABI 7500、Rotor-Rotor-Gene 6000Gene 6000、Mx3005PMx3005P、LightCycler 480LightCycler 480、ABI ViiA 7ABI ViiA 7PCR中常中常见问题分析分析v标本的采集与本的采集与储存存v标本的制本的制备核酸核酸纯化化v试剂准准备、加、加样v扩增、增、检测v结果分析果分析v报告解告解释标本的采集与本的采集与储存存v1、标本的采集本的采集v 严格按照要求采格按照要求采样，尽可能减少粘液和血液，采，尽可能减少粘液和血液，采集到尽可能多的集到尽可能多的宫颈脱落脱落细胞胞标本的采集与本的采集与储存存v2、储存条件存条件v提取前的原始提取前的原始标本本 v 一周内提取一周内提取 4 v 一周后提取一周后提取 -20 v 提取后的提取后的HPV DNAv 检测前前 一周内一周内检测 4 v 一周后一周后检测 -20 v 检测后后 -20 标本的制本的制备核酸核酸纯化化v原理：原理：v 煮沸法：表面活性煮沸法：表面活性剂（如（如Triton X-100、SDS等）等）煮沸煮沸v 1、优点点v 简单、快捷、方便、快捷、方便v 2、缺点、缺点v HPV DNA纯度度较差，含有血差，含有血红素、蛋白、素、蛋白、脂脂类等等PCR抑制抑制剂。试剂准准备、加、加样v1、试剂配制的均一性、分装的均一性配制的均一性、分装的均一性v2、常用、常用试剂的分装和的分装和储存存v -20，避免反复，避免反复冻融融v3、加、加样的准确性和重复性的准确性和重复性扩增、增、检测v影响因素：引物、探影响因素：引物、探针、仪器器设备状状态v阳性阳性对照照监控系控系统故障故障v阴性阴性对照照监控控污染染结果分析果分析vABI 仪器器v1、设置基置基线：2、设置置阈值线：基线和阴性对照的上方，同时保证在指数增长期。结果分析果分析v1、整体、整体扩增曲增曲线的的观察察v2、阴性、阴性对照分析照分析v3、阳性、阳性对照分析照分析报告解告解释v结果可能出果可能出现：v 1、假阳性：交叉、假阳性：交叉污染、染、扩增子增子污染染v 2、假阴性：低于、假阴性：低于检测下限、抑制物未去除、下限、抑制物未去除、检测体系有缺陷体系有缺陷 谢谢!