煤矸石复垦区玉米根际与非根...壤细菌群落对覆土厚度的响应_张变华.pdf

张变华，靳东升，张强，等 煤矸石复垦区玉米根际与非根际土壤细菌群落对覆土厚度的响应 J 江苏农业科学，2023，51(4):226 231doi:10 15889/j issn1002 1302 2023 04033煤矸石复垦区玉米根际与非根际土壤细菌群落对覆土厚度的响应煤矸石复垦区玉米根际与非根际土壤细菌群落对覆土厚度的响应张变华1，靳东升2，张强2，郜春花2，李建华2(1 忻州师范学院，山西忻州 034000;2 山西农业大学，山西太原 030031)摘要:为了解煤矸石填埋区复垦土壤细菌群落对覆土厚度的响应机制，以山西省屯兰矿区不同覆土厚度下(40、80、120 cm)玉米根际与非根际土壤样品为试验材料，对土壤细菌 V3 V4 区进行高通量测序，分析细菌群落群落结构、多样性及其与土壤养分的相关性。研究结果表明，不同覆土厚度下玉米根际细菌扩增序列变体(ASV)数量均高于非根际土壤，80 cm 覆土厚度下根际与非根际土壤中细菌的 ASV 数量最多;放线菌门和变形菌门为该复垦区各覆土厚度下的玉米根际与非根际土壤中的优势细菌门，溶杆菌属、分枝杆菌属、类诺卡式属和 67 14 属为优势细菌属。覆土厚度可以改变玉米根际与非根际土壤中的细菌群落结构及其多样性。覆土 80 cm 为该复垦区较为适宜的覆土厚度，该覆土厚度不仅能够提高玉米根际放线菌门、类诺卡式属的相对丰度，增加非根际土壤中变形菌门 67 14 属的相对丰度，而且可以增加复垦土壤中的细菌群落的物种多样性和均一度指数，土壤速效钾、有效磷和有机质含量是驱动土壤细菌群落物种多样性变化的主要养分因子。关键词:玉米;根际与非根际;细菌群落;多样性;覆土;煤矸石复垦区中图分类号:S154 3;X171 4文献标志码:A文章编号:1002 1302(2023)04 0226 06收稿日期:2022 03 10基金项目:国家重点联合基金课题(编号:U1710255);山西省农业科学院农业科技创新 科企联合研发专项(编号:YGC2019KQ03)。作者简介:张变华(1976)，女，山西偏关县人，博士，副教授，主要从事矿区土地复垦与生态重建研究。E mail:sxdxzbh126 com。通信作者:靳东升，硕士，副研究员，主要从事矿区复垦与生态重建研究。E mail:sxdxjds126 com。煤炭开采过程中排放的煤矸石约占原煤产量的 15%20%1。据不完全统计，目前我国煤矸石累积排放量已达 38 亿 t，并以每年 2 亿 t 的增长量逐年增加2。堆积的煤矸石不仅占用了大量土地，而且对水体、土壤和大气也造成严重污染。采煤矿区通常采用煤矸石回填覆土的方式进行复垦3 4。Lubos 等通过比较露天煤矿废弃地表层覆土与未覆土后的土壤特性变化，发现在采煤废弃地表层覆土后矿区土壤有机碳、腐殖质和有效磷含量显著增加，促进了复垦土壤的发育5。洪坚平等通过研究不同复垦措施对山西阳泉煤矸石山土壤培肥的影响，发现矸石上覆土并种植豆科牧草可显著改善土壤有机质，快速培肥土壤6。郭友红等的研究表明，覆土厚度会影响农作物的长势、外观和产量7。刘会平等的研究表明，煤矸石填埋覆土厚度差异会影响土壤生产力8。刘鑫尧等的研究表明，煤矿复垦地覆土厚度与小麦产量呈正相关9。黄凯的研究表明，覆土厚度会影响充填土壤表层含水量10。张轩等的研究表明，60 cm 覆土厚度相较于 40 cm有利于提高复垦土壤的保水保肥能力，可以增加大豆地下与地上生物量11。张轩研究发现，80 cm 和120 cm 覆土厚度相较于 40 cm 的复垦土壤，容重、沙粒含量明显降低，气相比例增加，虽然覆土厚度对复垦土壤微生物数量、酶活性及土壤呼吸的影响没有明显规律，但 80 cm 和 120 cm 覆土厚度利于改善复垦土壤微生物群落功能多样性12。陈孝杨等的研究表明，煤矸石充填复垦时，覆土较薄(20 40 cm)会降低土壤呼吸速率，对温度敏感性较强，不利于生物活动;覆土较厚(100 cm)会使有利于生物活动的积极因素消失13，且会浪费资源从而加大复垦成本12。因此，适宜的覆土厚度是矿区复垦成功的关键14。土壤微生物多样性是表征土壤肥力水平高低的敏感性指标。然而，综上所述，当前利用现代高通量测序技术对不同覆土厚度下复垦土壤细菌群落结构及其多样性的研究鲜见报道。由于根际是土壤微生物与植物相互作用的重要场所5。所以本研究选择山西屯兰矿区复垦地为研究对象，分析不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤细菌群落622江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期组成及其多样性，以期为矿区生态恢复和重建技术提供一定参考依据。1材料与方法1 1研究区概况试验区位于山西省古交屯兰煤矸石复垦区，年平均气温约 9 5，年平均降水量约 460 mm。本试验设置 3 个覆土厚度，分别为 40、80、120 cm。不同覆土厚度下的试验小区面积均为 20 m2(4 m 5 m)。于2020 年5 月28 日采用人工点播的方式种植玉米，施肥方式为人工撒施肥料，施肥种类为有机肥配施无机肥，施肥量为有机肥 7 500 kg/hm2、无机肥 600 kg/hm2，株距、行距分别为 30、55 cm。1 2样品采集于2020 年7 月9 日(玉米花期)，在不同覆土厚度下(40、80、120 cm)的试验小区，进行根际与非根际土壤样品采集。根际土壤:在各试验小区选择长势差不多的玉米 3 株，利用挖掘法和抖落法15 进行采集，先抖落掉玉米根系大块土，然后将用毛刷轻轻刷下的 0 2 mm 的根际土收集在无菌塑料袋中，密封后放入装有冰袋的保温箱内，带回实验室进行室内分析化验。非根际土壤:利用土钻按照对角线法采集不同覆土厚度下玉米株间深度为 0 20 cm 的土壤样品，放入灭菌袋，密封后放入(4 保温箱)带回室内进行化验。根际与非根际土壤样品，每个处理 3 次重复。未能及时做微生物培养试验的土样放在 80 冰箱冷冻保存。1 3试验方法与数据处理高通量测序由上海派森诺生物科技有限公司对玉米根际与非根际土壤进行微生物组 DNA 提取、目标片段聚合酶链式反应(PCR)扩增、产物回收纯化、荧光定量等，使用 MiSeq 型测序仪测定玉米根际与非根际土壤中细菌 V3 V4 扩增于序列变体区(amplicon sequence variants，ASV)序列单元。土壤全氮含量采用半微量开氏法测定，有机质含量采用重铬酸钾氧化 外加热法测定;有效磷含量采用碳酸氢钠浸提 钼锑抗比色法测定;速效钾含量采用乙酸铵浸提 火焰光度法测定;碱解氮含量利用碱解扩散法进行测定;pH 值采用水土比为2 5 mL 1 g 的方法测定。利用 Origin、Qiime 与 Canoco 软件对土壤中细菌数据进行整理和统计分析。2结果与分析2 1不同覆土厚度下复垦土壤细菌 ASV 分析ASV 指扩增子测序中按照 100%相似水平下聚类形成的序列单元。由图 1 可知，不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中细菌 ASV 数量范围为1 133 3 862 个。覆土厚度为 80cm 处理的复垦地玉米根际土壤中 ASV 数量最多。对于玉米根际土壤，细菌 ASV 数量从大到小为 R80 R40 R120;对于非根际土壤，顺序则为 S80 S120 S40。2 2不同覆土厚度下复垦土壤细菌门和属特征从图 2 可以看出，不同覆土厚度下玉米根际与非根际细菌中相对丰度较高的前十种细菌门包括放 线 菌 门(Actinobacteria)、变 形 菌 门(Proteobacteria)、绿 弯 菌 门(Chloroflexi)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、异常球菌 栖热 菌 门(Deinococcus Thermus)、厚 壁 菌 门(Firmicutes)、Patescibacteria门、蓝藻门(Cyanobacteria)。放线菌门和变形菌门的相对丰度均大于 10%，相对丰度范围分别为 34 71%63.61%和 18 56%32 03%，为该复垦区不同覆土厚度下的优势细菌门。同一覆土厚度下，玉米根际土壤放线菌门的相对丰度均高于非根际土壤，变形菌门的相对丰度均低于非根际土壤，80 cm 厚度处理相较于 40 cm 和 120 cm 处理玉米根际放线菌门的相对丰度有所增加，根际变形菌门的相对丰度有所降低。而 40 cm 厚度处理相较于 80 cm 和722江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期120 cm 处理非根际土壤中放线菌门的相对丰度有所降低;80 cm 厚度处理相较于 40 cm 和 120 cm 厚度处理非根际土壤中变形菌门的相对丰度有所增加。从图 3 可以看出，不同覆土厚度下根际与非根际土壤中相对丰度较高的前 20 种细菌属中，相对丰度均大于 1%的细菌属有溶杆菌属(Lysobacter)、分枝 杆 菌 属(Mycobacterium)、类 诺 卡 式 属(Nocardioides)和 67 14 属;还发现同一覆土厚度下非根际土壤中溶杆菌属、分枝杆菌的相对丰度均高于根际土壤，类诺卡式属的相对丰度则表现为非根际土壤低于根际土壤。在根际土壤中，相较于40、120 cm 厚度处理，80 cm 厚度处理溶杆菌属、分枝杆菌的相对丰度有所降低，类诺卡式属的相对丰度有所提高;在非根际土壤中，80 cm 厚度处理相较于 40 cm 和 120 cm 厚度处理 67 14 属的相对丰度有所增加。总体来看，覆土厚度可以改变根际与非根际土壤中细菌门和属的相对丰度，根际与非根际土壤中的细菌群落有差异。2 3不同覆土厚度下复垦土壤中的细菌 多样性微生物 多样性通常用 Chao1、Shannon、Pielou和 Simpson 指数表征，它们分别表示微生物丰富度、物种多样性、均一度和优势度。从图 4 可以看出，对于根际土壤而言，80 cm 厚度下玉米根际土壤 Chao1 指数显著高于 120 cm 厚度处理，但与 40 cm 厚度处理差异不显著;80 cm 厚度处理 Shannon、Pielou 和 Simpson 指数均最低，但与40 cm 和120 cm 厚度处理差异不显著。对于非根际土壤而言，80 cm 厚度下 Chao1、Shannon、Pielou 均显著高于 40 cm 厚度处理，但与 120 cm 厚度处理差异不显著。各覆土厚度处理间 Simpson 指数无显著差异。从图 4 也可以看出，同一覆土厚度下，根际与非根际土壤间 Simpson 指数无显著差异。80 cm 厚度下，非根际土壤 Shannon 和 Pielou 指数显著高于玉米根际土壤，40 cm 和 120 cm 厚度下根际与非根际土壤间差异不显著。对于 Chao1 指数，80 cm 和120 cm 厚度下均表现为根际土壤低于非根际土壤，但 120 cm 厚度下差异显著;40 cm 厚度下则表现为根际土壤显著高于非根际土壤。总体来看，覆土厚度可以改变复垦土壤细菌多样性，80、120 cm 的覆土厚度相较于 40 cm 有利于提高复垦区非根际土壤细菌多样性。2 4不同覆土厚度下复垦土壤细菌群落结构的 多样性利用 Origion 软件对不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤细菌群落结构进行主坐标分析(Principal coordinates analysis，简称 PCoA)。由图 5可以 看 出，PCo1 和 PCo2 分 别 解 释 24 7%和13.4%。PCoA1 将玉米根际与非根际土壤细菌群落隔开，非根际土壤分布在第一、第四象限，根际土壤基本分布于第二、第三象限。PCoA2 将 40 cm 厚度822江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期与 80、120 cm 厚度分隔开，对于非根际土壤，80 cm和 120 cm 厚度分布于第一象限，40 cm 分布于第四象限，说明 80 cm 与 120 cm 厚度下土壤细菌群落差异不大，但它们与 40 cm 厚度间差异较大。对于根际土壤而言，80 cm 覆土厚度位于第三象限，但与40 cm 和 120 cm 厚度的间距较近，所以不同覆土厚度间根际细菌群落差异不大。2 5玉米根际与非根际土壤细菌群落结构与土壤环境因子相关性的冗余分析(RDA)利用 Canoco 软件对不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中前 20 种细菌属与土壤中全氮含量、有机质(OM)含量、速效钾(AK)含量、有效磷(AP)含量、碱解氮含量和 pH 值进行了 RDA 分析。结果表明，不同覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中细菌群落结构与根际与非根际土壤中速效钾含量、有机质含量显著相关，其中速效钾含量的贡献率最大，达 58 2%，其次为有机质和有效磷，贡献率分别为 13 4%和 5.7%(表 1)。同时，从图 6 也可以看出，不同覆土厚度下根际与非根际差异较大。对于非根际土壤而言，40 cm 厚度处理与 80、120 cm 厚度处理间差异较大;而不同覆土厚度下根际土壤间差异不大。表 1RDA 前选择结果指标解释率(%)贡献率(%)pseudo FP 值AK3935821030 002OM134199430 006AP5785190 0543讨论3 1覆土厚度影响玉米根际与非根际土壤细菌微生物群落结构本研究结果表明，该复垦区各覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中放线菌门和变形菌门的相对丰度最高，是该煤矸石填埋复垦区优势细菌门。该结果与李金融等报道的结果16 类似。因为放线菌922江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期门、变形菌门均为适应环境能力强的细菌。变形菌门多为异养或者兼性营养细菌;放线菌门能降解大量不同种类的有机化合物，对有机物的矿化有着重要功能16，能在矿区恶劣环境中生存17。许多研究表明，植物根际和非根际土壤中微生物群落有差异18 21。本研究表明，同一覆土厚度下，玉米根际土壤放线菌门、类诺卡式属的相对丰度均高于非根际土壤;玉米非根际变形菌门、溶杆菌属、分枝杆菌属的相对丰度均高于根际土壤。这是因为植物 20%50%的光合同化产物转移到地下部，大部分以有机和无机分泌物形式释放到根区22，能够促进或抑制某些特定类群的增殖和丰度的提高。本研究也发现，覆土厚度会改变根际与非根际细菌群落结构，如80 cm 厚度相较于40、120 cm玉米根际放线菌门、类诺卡式属的相对丰度有所增加，根际变形菌门、溶杆菌属、分枝杆菌的相对丰度有所降低。原因是覆土厚度会影响复垦区作物根系的生长8。本研究表明，80 cm 的覆土厚度或可促进玉米根系分泌有利于根际放线菌门、类诺卡式属生长的物质，为其提供充足的基质与能量，进而增加其相对丰度。3 2覆土厚度影响作物根际与非根际土壤细菌微生物多样性覆土可以改变矿区土壤水分、结构及作物根系生长，适宜的覆土厚度在矿区植被恢复和生态重建中有重要的作用。众多研究表明，较高的微生物多样性对于增强生态系统和微生物功能的稳定性较好23 24，且作物根系活动会导致作物根际与非根际土壤间的微生物多样性产生明显差异25 26。Berg等研究发现，根际细菌群落的多样性普遍低于非根际土壤27。本研究也发现，80 cm 厚度下非根际土壤细菌群落 Shannon 和 Pielo Eveness 指数显著高于玉米根际土壤;80 cm 覆土厚度下玉米根际土壤细菌丰富度指数(Chao1)均高于40 cm 和120 cm 厚度处理，且 80 cm 厚度下非根际土壤中物种多样性指数、均一度指数均显著高于 40 cm 厚度处理，但与120 cm 厚度间无显著差异。多样性分析表明，非根际土壤细菌群落结构在 80 cm 厚度处理与 40、120 cm 厚度处理差异显著。加之由于 80 cm 相较于 120 cm 的覆土厚度利于节约成本，所以覆土80 cm 应是该煤矸石填埋复垦区较为适宜的覆土厚度，不仅可以增加复垦土壤细菌多样性，为玉米生长提供良好的土壤环境，而且对于维持煤矸石填埋复垦区生态系统功能有良好的作用。3 3各覆土厚度下作物根际与非根际土壤细菌群落与土壤养分关系Wang 等研究发现，土壤养分在根际与非根际微生物群落多样性中作用有差异，认为土壤养分中全氮含量、有效磷含量、速效钾含量和有机质含量与根际细菌群落多样性显著相关28。本研究表明，各覆土厚度下玉米根际与非根际土壤中细菌群落结构与土壤中速效钾含量、有机质含量显著相关。这是因为矿区复垦土壤由于本身具有有机质含量低、养分贫瘠的特征，土壤中细菌群落特征会因土壤性质不同而有差异29。4结论本研究表明，放线菌门和变形菌门为该复垦区各覆土厚度下的玉米根际与非根际土壤中的优势细菌门，溶杆菌属、分枝杆菌属、类诺卡式属和 67 14 属为优势细菌属。覆土厚度可以改变玉米根际与非根际土壤中的细菌群落结构及其多样性。无论玉米根际还是非根际土壤，80 cm 覆土厚度下土壤中 ASV 数量最多，且玉米根际细菌 ASV 数量均高于非根际。该覆土厚度不仅能够提高玉米根际放线菌门、类诺卡式属的相对丰度，增加非根际土壤中变形菌门、67 14 属的相对丰度;而且可以增加复垦土壤中的细菌群落物种多样性和均一度指数，土壤中的速效钾、有效磷和有机质驱动其变化的主要养分因子。结合经济投入，认为覆土 80 cm为该复垦区较为适宜的覆土厚度。参考文献:1Liu H B，Liu Z L Recycling utilization patterns of coal mining wastein ChinaJResources，Conservation and Recycling，2010，54032江苏农业科学2023 年第 51 卷第 4 期(12):1331 1340 2Gao YJ，HuangHJ，TangWJ，etalPreparationandcharacterization of a novel porous silicate material from coal gangue J Microporous and Mesoporous Materials，2015，217:210 218 3Stracher G B，Taylor T P Coal fires burning out of control around theworld:thermodynamic recipe for environmental catastropheJ International Journal of Coal Geology，2004，59(1/2):7 17 4Fu T L，Wu Y G，Ou L S，et al Effects of thin covers on the releaseof coal gangue contaminantsJ Energy Procedia，2012，16:327 333 5Boru?vka L，Lozk J，Mhlhanselov M，et al Effect of covering withnatural topsoil as a reclamation measure on mining 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