剑麻超氧化物歧化酶基因鉴定及低温胁迫表达分析.pdf

23科研进展ResearchProgress2024.1总第116期陈莉莎1 李玉波2,3 胡晓丽2,4 杨欣丽5 易克贤2 黄兴2*（1农业农村部剑麻及制品质量检验测试中心 广东湛江 5240002中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室 海南海口 5711013海南大学热带农林学院 海南海口 5702284华中农业大学植物科学技术学院 湖北武汉 4300705琼台师范学院信息科学技术学院 海南海口 571127）摘 要：剑麻是热带地区重要的纤维作物，生产中易受到寒害威胁而造成减产。超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的保护酶，在植物应答低温等逆境条件胁迫过程中起重要作用。前人研究已初步明确超氧化物歧化酶在剑麻低温处理后起重要作用，但其在剑麻中的基因序列及分子调控机制尚未明确。在已发表的剑麻转录组数据库中鉴定出5个SOD基因，遗传进化分析显示其在不同植物物种中进化较保守。实时定量PCR结果显示低温胁迫后5个基因表达模式均呈先上升后下降趋势，且均与SOD活性变化显著正相关（P0.05）。其中2个CSD基因和1个FSD基因与SOD活性极显著正相关（P0.01），表明这3个基因在应答低温胁迫过程中起重要作用。研究鉴定了剑麻SOD基因并初步明确其应答低温胁迫表达模式，为深入开展剑麻抗寒机制研究提供了重要基础。关键词：剑麻；超氧化物歧化酶基因；低温胁迫；基因表达Identification of Superoxide Dismutase Genes and Expression Analysis Under Cold Stress in Sisal剑麻超氧化物歧化酶基因鉴定及低温胁迫表达分析基金项目：财政部和农业农村部：国家现代农业产业技术体系（CARS-16）；中央级公益性科研院所基本科研业务费（1630042022005）；广东省级乡村振兴战略专项种业振兴项目（2022-NBH-00-025）；海南省自然科学基金（322MS112）。作者简介：陈莉莎（1986），女，农艺师，硕士，主要从事热带作物检验检测、种质资源保护等研究。Email：*通信作者：黄兴（1988），男，副研究员，博士，研究方向为剑麻逆境生理及分子机制。E-mail：24科研进展ResearchProgress剑麻是热带亚热带地区广泛种植的硬质纤维作物，在我国主要种植于广西、广东、海南等地1。剑麻纤维具有强度高、质地坚韧、耐腐蚀等特性，在航海、渔业、造纸等行业用途广泛2。此外，剑麻纤维复合材料的高强度、耐腐蚀等特性在环保再生型建筑材料方面存在巨大的应用前景3。近年来随着全球气候的变化，极端温度（高温和低温）出现频次日益增多，已成为制约全球农业进一步发展的重要因素4。低温作为一种非生物胁迫，可造成植物组织冻伤，引起芽萎缩、叶片发黄萎蔫、组织死亡等寒害症状5。剑麻作为典型的热带作物之一，对低温寒害耐受力较差。我国大部分剑麻种植区处于热带亚热带地区，在早春易受“倒春寒”影响，严重时可造成大面积减产6。目前拟南芥、水稻等模式植物中已开展了大量的低温胁迫调控机制相关研究，而剑麻相关研究报道较少。张学财等7测定了低温胁迫后剑麻叶片中保护酶等生理指标的变化规律，黄显雅等和田夏红等分别开展了剑麻种质资源抗寒性田间调查4,8。杨欣丽开展了剑麻应答低温胁迫机制研究，明确了8种生理生化指标及CBF、psaA和psaB等基因的变化规律6。超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase,SOD）作为一种重要的保护酶，可有效清除植物体内过量的活性氧，在植物生长发育、逆境胁迫应答等过程中起重要作用9。剑麻中已初步明确低温胁迫后SOD活性变化，但相关基因及表达模式尚未报道6,7。本研究根据已发表的剑麻转录组，通过同源序列比对鉴定SOD基因，并开展系统进化及表达分析，阐明剑麻SOD基因的遗传进化规律及其应答低温胁迫表达模式，为探明其生物学功能及作用机制提供基础。1 材料与方法1.1 材料种植与处理本 研 究 选 取 的 试 验 材 料 为 剑 麻 主 栽 品 种H11648株芽苗，在中国热带农业科学院环境与植物保护研究所（19.99 N，110.33 E）盆栽种Abstract:The sisal is an important fiber crop in tropical areas,which is easily threatened by cold stress,resulting in reduced production.Superoxide dismutase(SOD)is an important protective enzyme that plays an important role in plant response to stress conditions including cold stress.Previous studies have preliminarily confirmed the important role of SOD under cold stress in sisal,but few are known about their gene sequences and molecular regulatory mechanisms in sisal.In this study,five SOD genes according to the published sisal transcriptome database,and genetic evolution analysis showed the relatively conserved evolution of SOD genes in different plant species.The real-time quantitative PCR results indicated that the expression of five genes increased and then decreased under cold stress.Their expression patterns were also positively correlated with SOD activity(P 0.05).Among these,two CSD genes and one FSD gene were significantly positive correlated with SOD activity(P 0.01),which indicated their important roles in response to cold stress.This study identified the SOD genes in sisal and preliminarily clarified their expression patterns in response to cold stress,providing an important basis for further researches related to the mechanisms of cold stress response in sisal.Keywords:sisal;superoxide dismutase gene;cold stress;gene expressionCHEN Lisha1,LI Yubo2,3,HU Xiaoli2,4,YANG Xinli5,YI Kexian2,HUANG Xing2*(1QualityInspectionandTestingCenterforSisalProducts,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,Zhanjiang524000,Guangdong;2EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonTropicalCrops,MinistryofAgricultureandRuralAffairs/HainanKeyLaboratoryforMonitoringandControlofTropicalAgriculturalPests,Haikou571101,Hainan;3CollegeofTropicalAgricultureandForestry,HainanUniversity,Haikou570228,Hainan;4CollegeofPlantScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,Hubei;5CollegeofInformationScienceandTechnology,QiongtaiNormalUniversity,Haikou571127,Hainan)25科研进展ResearchProgress2024.1总第116期表1 实时定量PCR引物基因正向引物(5-3)反向引物(5-3)产物长度/bpAhCSD1TCATCGGTCTGCAGGCTTAAAGAGGCCGAAACATCACTCA234AhCSD2TTCTCCTCGGGTAATCTCGCCCGTTGGTAGTATCCCCGAA224AhMSD1ATCCACCACCAGAAGCATCACTGTGTCAATTGCCCAACCA235AhFSD1ATCGATGTTTGGGAGCATGCCATCACTTTCGCTGTCCAGG226AhFSD2TAGAGCTGCACTGGGGAAAACCCAAGGCAATTTTCCACCA216AhPP2ACCTCCTCCTCCTTCGGTTTGGCCATGAATGTCACCGCAGA235植2个月后放置于智能人工气候培养箱（DRXM-150-2，上海川昱）进行低温处理。6 C处理0h、6h、12h、18h、24h时剪取叶片取样6，每个处理均在不同植株重复取样3次，随后置于液氮速冻，放置于-80 C超低温冰箱保存备用。1.2 剑麻SOD基因鉴定与分析以7个拟南芥和7个水稻SOD基因为参考序列，通过TBlastx方法在剑麻转录组数据库检索SOD基因同源序列10-13。通过ORF-FINDER软件分析检索获得的剑麻基因序列，将包含完整编码序列的SOD基因进行后续分析14。通过ProtParam软件在线预测剑麻SOD蛋白长度、分子量和理论等电点等理化性质15。选取拟南芥（7个）、水稻（7个）、芦笋（9个）和剑麻（5个）SOD蛋白序列在ClustalX2.0软件中进行多重序列比对，进而构建Neighbor-Joining系统进化树，Bootstrap分析重复1000次16。1.3 剑麻SOD基因表达分析及SOD活性测定采用天根植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技，中国）提取样品中的总RNA，并通过GoScriptReverseTranscriptionSystem（Promega,美国）反转录为cDNA备用。通过QuantStudio6实时荧光定量PCR系统（赛默飞，美国）进行实时定量PCR分析。PCR反应程序为94反应30s；94反应3min，94反应10s，58反应30s，共重复40个循环；溶解曲线循环。PCR扩增体系最终体积为20L，其中包含1LcDNA模板、10LTransStartTipGreenqPCRSupermix（全式金，中国）、0.4LPassiveReferenceDye（全式金，中国）、0.5L正向引物、0.5L反向引物和7.6双蒸水。根据5个剑麻SOD基因及内参基因PP2A（proteinphosphatase2A）的编码序列，在Primer3软件中设计定量PCR引物，其序列见表117。每个样品重复3次作为技术重复，通过2-Ct法计算每个基因的相对表达量18。采用羟胺法测定剑麻样品中SOD活性6。2 结果与分析2.1 剑麻SOD基因的鉴定在剑麻转录组中进行同源序列检索共获得5个含完整编码序列的SOD基因（表2），将其命名为AhCSD1、AhCSD2、AhMSD1、AhFSD1和AhFSD2，其序列长度为8341397bp，编码的蛋白质长度为152300aa。蛋白质分子量为15225.8433921.87Da，理论等电点为5.078.84。表2 剑麻SOD基因及其蛋白理化性质基因序列号碱基长度/bp蛋白长度/aa蛋白分子量/Da理论等电点AhCSD1CL15346.Contig383415215225.845.43AhCSD2CL17499.Contig1139722222598.585.94AhMSD1CL6873.Contig1108522625156.818.84AhFSD1Unigene29968110230033921.875.07AhFSD2CL3251.Contig2130526229979.376.7626科研进展ResearchProgress2.2 剑麻SOD基因系统进化分析以拟南芥、水稻SOD基因为参照，选取天门冬目作物芦笋、剑麻SOD基因进行遗传进化分析。利用ClustalX2.0软件进行氨基酸序列的多重比对并构建Neighbor-Joining进化树（Bootstrap分析采用1000次重复），结果如图1所示。28个蛋白序列被分成3个分支，即FSD、MSD和CSD分支。FSD和MSD分支中各物种序列数相近，拟南芥和芦笋序列数分别在两分支多于其他物种。CSD分支中水稻和芦笋序列数多于拟南芥和剑麻，其中CSD3亚分支中未聚类到剑麻序列。此外，剑麻和芦笋序列均聚类在相同分支。2.3 剑麻SOD基因应答低温胁迫表达分析通过实时定量PCR检测低温胁迫后剑麻SOD基因表达模式，结果显示5个基因表达水平均呈先上升后下降趋势，但未达到显著水平（图2）。其中AhFSD2表达水平在处理后12h和24h时分别较6h和18h时略有下降，其余4个基因表达水平仅在处理后24h略有下降。2.4 剑麻低温胁迫SOD活性与基因表达相关性分析进一步测定了低温胁迫后剑麻叶片中SOD活AoFSD2AhFSD2OsFSD2AtFSD3AoFSD1AhFSD1AtFSD1AtFSD2OsFSD1AoMSD2AhMSD1AoMSD1OsMSD1AtMSD1AoCSD3OsCSD1 AtCSD3OsCSD4AhCSD2AoCSD5AoCSD2 AtCSD2 AtCSD1OsCSD3OsCSD2AoCSD4AoCSD1AhCSD1998874100069410001000776994552999992999886100010007086728769736979998737426069040.05图1 拟南芥、水稻、芦笋及剑麻SOD基因遗传进化分析注：At表示拟南芥；Ah表示剑麻；Ao表示芦笋；Os表示水稻?图2 剑麻SOD基因低温胁迫表达模式27科研进展ResearchProgress2024.1总第116期性，结果显示其呈先上升后下降趋势，处理后18h时SOD活性达到峰值后下降（图3A）。将SOD活性与5个基因的表达模式进行相关性分析（图3B），结果显示AhFSD1、AhFSD2和AhCSD1表达模式与SOD活性呈极显著正相关（P0.01），其余2个基因呈显著正相关（P0.05）。3 讨论SOD在植物抗氧化防御系统中起重要作用，可将超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2以清除活性氧19。剑麻中已初步明确SOD在应答低温胁迫过程中起重要作用，但其蛋白类型及基因序列尚未明确6。植物中主要存在3种类型SOD，即CSD（Cu/Zn-SOD）、MSD（Mn-SOD）和FSD（Fe-SOD），高等植物中以CSD为主20。根据同源序列检索发现剑麻中存在上述3种类型SOD基因，在不同植物物种中进化较保守，与模式植物相比CSD基因数量较少，可能与SOD基因的组织特异性表达有关11。目前剑麻基因组序列尚未公布，叶片转录组数据中可能并未完全反映基因组水平SOD基因家族的表达模式。实时定量PCR结果显示低温处理后5个剑麻SOD基因表达水平均上升，在24h时开始下降，与SOD活性变化规律一致，且均呈显著正相关，表明5个基因均参与应答低温胁迫。其中2个CSD基因和1个FSD基因与SOD活性极显著正相关，表明这3个基因在应答低温胁迫过程中起重要作用。后续将进一步探究剑麻CSD基因应答低温胁迫机制，提升对剑麻抗寒机制的理解，对选育抗寒剑麻新品种具有重要意义。参考文献1 陈莉莎.我国剑麻种质资源纤维强力性能研究J.中国麻 业科学,2023,45(1):33-40,48.2 黄兴,习金根,陈涛,等.剑麻苯丙氨酸裂解酶基因的鉴定及 表达分析J.作物学报,2021,47(6):1082-1089.3 杨芳,于淑娟,朱永飞,等.剑麻纤维/聚合物复合材料研究 进展J.化工技术与开发,2015,44(4):28-31.4 田夏红,刘青,刘建荣,等.剑麻种质资源表型多样性分析与 抗寒性调查J.中国麻业科学,2020,42(3):97-103.5 GuoX,LiuD,ChongK.Coldsignalinginplants:insights intomechanismsandregulationJ.JIntegrPlantBiol,2018,60:745-756.6 杨欣丽.剑麻应答低温胁迫机制及抗寒性比较研究D.海 口:海南大学,2023.7 张学财,周文钊,李俊峰.低温胁迫下4个剑麻品种的SOD、?A：样品叶片中SOD活性图 B：SOD与基因表达相关性分析图图3 低温胁迫下剑麻SOD活性与基因表达相关性分析注：B中R为相关系数，*和*分别表示显著（P0.05）和极显著（P0.01）（下转第22页）SOD活性/(u/g)处理时间/h SOD基因相对表达量22文献综述LiteratureReview POD、CAT变化J.中国热带农业,2009(4):47-50.8 黄显雅,陈涛,金刚,等.2017年南宁龙舌兰种质寒害调查及 养护J.热带农业科学,2018,38(9):65-68,90.9 杨林林,韩敏琦,高嘉,等.小麦超氧化物歧化酶基因家族 鉴定及盐胁迫下响应锌钾的表达分析J.山东农业科学,2023,55(8):11-20.10 AltschulSF,GishW,MillerW,etal.Basiclocalalignment searchtoolJ.JMolBiol,1990,215:403-410.11 HuangX,XiaoM,XiJ,etal.Denovotranscriptome assemblyofAgaveH11648byIlluminasequencingand identificationofcellulosesynthasegenesinAgavespeciesJ.Genes,2019,10:103.12 KaminakaH,MoritaS,TokumotoM,etal.Differential geneexpressionsofricesuperoxidedismutaseisoforms tooxidativeandenvironmentalstressesJ.FreeRadic Res,1999,31:219-225.13 ZhangG,DingQ,WeiB.Genome-wideidentificationof superoxidedismutasegenefamiliesandtheirexpression patternsunderlow-temperature,saltandosmoticstressesin watermelonandmelonJ.3Biotech,2021,11(4):194.14 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