姜黄素对葡萄膜黑色素瘤细胞恶性生物学行为及Wnt_β-catenin通路的抑制作用.pdf

实验研究29Chin JExp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期姜黄素对葡萄膜黑色素瘤细胞恶性生物学行为及Wnt/-catenin通路的抑制作用盛小红王利明赵鑫辛向阳内蒙古包钢医院眼科，包头0 140 10通信作者：辛向阳,Email:【摘要】目的探究姜黄素对葡萄膜黑色素瘤（UM）恶性生物学行为的抑制作用及机制。方法应用含不同浓度（0、2 0、40 和8 0 mol/L）姜黄素培养液培养M23细胞48 h，于倒置显微镜下观察细胞形态学改变；采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率；分别采用平板克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell实验检测M23细胞集落形成、调亡、迁移及侵袭情况；采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Wnt/-catenin通路相关基因c-Myc、细胞周期蛋白D1（Cy c l i n D 1）、Su r v i v i n 及基质金属蛋白酶9（MMP-9）mRNA相对表达情况；采用Westernblot法检测Wnt/-catenin通路相关蛋白c-Myc、Cy c l i n D 1、Su r v i v i n、M M P-9、-连环蛋白（-catenin）、糖原合成酶激酶3（G SK-3）、磷酸化GSK-3（p-G SK-3）及轴抑制蛋白2（Axin2）蛋白相对表达量。另取2 0 只6 周龄雌性BALB/c小鼠，左后腹皮下脂肪垫注射M23细胞悬浮液建立小鼠M23体内移植肿瘤模型，将造模成功小鼠按照随机数字表法随机平均分为模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组，每组5只，分别腹腔内注射0、10、2 0 和40 mg/kg姜黄素生理盐水溶液，连续注射30 d后剥离皮下瘤体并称质量。结果0 mol/L姜黄素组、2 0 mol/L姜黄素组、40 mol/L姜黄素组和80mol/L姜黄素组细胞存活率分别为（10 0.0 0 0.0 0）%、（8 3.7 8 4.59）%、（6 6.0 9 3.9 2）%和（47.16 3.63）%，细胞集落形成数分别为12 8.6 7 9.18、10 0.338.7 3、58.6 7 6.55和31.6 7 4.9 2，细胞调亡率分别为（1.330.2 9）%、（14.532.0 4）%、（2 7.2 33.56）%和（44.7 34.36）%，细胞迁移率分别为（8 9.7 6 4.57）%、（6 5.433.7 0）%、（34.8 32.19）%和（18.8 2 1.9 9)%，细胞侵袭数分别为148.338.18、12 5.337.41、7 3.6 7 6.34、45.6 7 5.31,各组M23细胞存活率、集落形成数、细胞调亡率、细胞迁移率、细胞侵袭数总体比较差异均有统计学意义（F=125.321、9 7.9 41、7 2.516、2 7 7.0 9 7、139.0 0 6，均P0.001）。随姜黄素作用浓度的增大，细胞存活率、集落形成数、细胞迁移率、细胞侵袭数均明显降低，细胞调亡率均明显增加，组间两两比较差异均有统计学意义（均P0.05）。随姜黄素浓度的增大，细胞中c-Myc、Cy c l i n D 1、Su r v i v i n 和MMP-9mRNA和蛋白及-catenin和p-CSK-3蛋白相对表达水平均明显降低，Axin2蛋白相对表达水平明显升高，组间比较差异均有统计学意义（均P0.05）。小鼠荷瘤质量随姜黄素作用剂量的增加而降低，组间比较差异均有统计学意义（均P0.05）。结论姜黄素可抑制UM细胞M23增生、迁移、侵袭等恶性生物学行为，抑制肿瘤生长，促进细胞调亡，其作用机制可能与阻断Wnt/-catenin通路激活有关。【关键词】姜黄素；葡萄膜黑色素瘤；生物学行为；Wnt/-catenin通路基金项目：内蒙古自治区自然科学基金（2 0 2 0 MS0 8 0 9 4)D0I:10.3760/115989-20220419-00170Inhibitory effect of curcumin on malignant biological behavior and Wnt/-catenin pathway of uvealmelanoma cellsSheng Xiaohong,Wang Liming,Zhao Xin,Xin XiangyangDepartment of Ophthalmology,Inner Mongolia Baotou Steel Hospital,Baotou O14010,ChinaCorresponding author:Xin Xiangyang,Email:AbstractObjective To explore the inhibitory effect of curcumin on the malignant biological behavior ofuveal melanoma（U M)a n d i t s p o s s i b l e m e c h a n i s m.MethodsM23 cells were cultured in curcumin medium withdifferent concentrations(0,20,40 and 80 mol/L)for 48 hours,respectively.The morphological changes of cellswere observed under an inverted microscope.The cell survival rate was detected by the cell counting kit-8(CCK-8)method.The apoptosis,colony formation,migration and invasion of cells were detected by flow cytometry,plate cloneformation experiment,cell scratch experiment and Transwell assay,respectively.The relative expressions of genesChin J Exp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期related to Wnt/-catenin pathway,c-Myc,Cyclin DI,Survivin and matrix metallo proteinase 9(MMP-9)mRNA incells were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The relative expressions of proteins related to Wnt/-catenin pathway,c-Myc,Cyclin DI,Survivin,MMP-9 and-catenin,glycogen synthase kinase 3（G SK-3),phosphorylated GSK-3(p-GSK-3)and axis inhibition protein 2(Axin2)proteins were detected by Western blot.Another 20 female BALB/c mice were selected and injected with M23 cell suspension under the subcutaneous fat padin the left posterior abdomen to establish the in vivo M23 transplanted tumor model.The mice successfully modeledwere randomly divided into model group,low-dose curcumin group,medium-dose curcumin group and high-dosecurcumin group according to the random number table method,which was intraperitoneally injected with O,10,20 and40 mg/kg curcumin physiological saline solution respectively.After a continuous injection for 30 days,thesubcutaneous tumor was stripped and weighed.The animal experiment process followed the 3Rs principle of animalresearch and was approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of Inner Mongolia Baotou Steel Hospital(No.2021MER-023).Results The cell survival rate,the number of colony formation,the apoptosis rate,the cellinvasion rate and the cell migration rate were(100.000.00)%,128.679.18,(1.330.29)%,(89.764.57)%and148.338.18 in0mol/Lcurcumingroup,(83.784.59)%,100.338.73,(14.532.04)%,(65.433.70)%and 125.337.41 in 20 mol/L curcumin group,(66.093.92)%,58.676.55,(27.233.56)%,(34.832.19)%and 73.676.34 in 40 mol/L curcumin group,and(47.163.63)%,31.674.92,(44.734.36)%,(18.821.99)%and 45.67 5.31 in 80 mol/L curcumin group.There were statistically significantdifferences in the survival rate,colony formation number,cell apoptosis rate,migration rate and invasion rate of M23cells among the four groups(F=125.321,97.941,72.516,277.097,139.006;all at P0.001).With the increase ofcurcumin concentration,the cell survival rate,colony formation number,cell migration rate and cell invasion numberdecreased obviously,and the cell apoptosis rate increased obviously,and the pairwise comparisons showed significantdifferences(all at P0.05).With the increase of curcumin concentration,the relative expression levels of c-Myc,Cyclin D1,Survivin,MMP-9 mRNA and proteins,-catenin and p-GSK-3 proteins decreased significantly,while therelative expression level of Axin2 protein increased significantly,showing significant differences in pairwisecomparisons(all at P0.05).The tumor tissue weight of mice decreased with the increase of curcumin dosage,andthe pairwise comparisons were statistically significant(all at P0.05).Conclusions Curcumin can inhibit theproliferation,migration,invasion and other malignant biological behaviors of UM M23 cells,inhibit tumor growth andpromote cell apoptosis.Its mechanism may be related to blocking the activation of Wnt/-catenin pathway.Key wordsCurcumin;Uveal melanoma;Biological behavior;Wnt/-catenin pathwayFund program:Natural Science Fund Project of Inner Mongolia Autonomous Region(2020MS08094)D0I:10.3760/115989-20220419-00170葡萄膜黑色素瘤（uvealmelanoma，U M）是成人常见的原发性眼内肿瘤，起源于脉络膜、睫状体或虹膜内的黑色素细胞。目前，针对该肿瘤的临床一线治疗方法包括手术切除、放射治疗和眼球摘除；然而，高达50%的UM会发生转移，1年生存率仅为15%2-3。因此，积极探索UM潜在转移机制并开发有效方法对于提高患者生存率至关重要。Wnt/-连环蛋白（-catenin）通路是调节胚胎发育和细胞干性的关键级联反应之一4;其在肿瘤增生和发展中发挥关键作用，在结肠瘤、乳腺瘤等多种癌症中均已证实被激活5-6 。O对不同病理类型的UM进行微小RNA差异表达谱分析发现，差异微小RNA靶基因广泛参与Wnt通路，且该通路参与了肿瘤的生长与转移7 。阻断Wnt/-catenin通路可抑制UM细胞的生长、迁移和侵袭等恶性表型】。以上研究结果提示，Wnt/-catenin通路可能是干预UM转移及发展的有效分子机制靶点。姜黄素是一种从姜黄的根茎中提取的天然活性酚类化合物。研究发现，其可抑制黑色素瘤肺转移9 ,还可通过线粒体途径诱导人UM细胞死亡10 ,提示姜黄素对UM可能具有一定治疗潜力。M23细胞是实验研究中常用的人UM细胞系、细胞株之一,本研究拟探讨姜黄素对体外培养M23细胞增生、调亡、迁移及侵袭等生物学行为的作用及Wnt/-catenin通路相关蛋白表达的影响，以期为UM的预防转移、治疗及预后提供一定参考。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞系及实验动物人UM细胞系M23购自上海细胞库（美国菌种保藏中心）。6 周龄SPF级雌性BALB/c小鼠2 0 只，体质量（16 2）g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司许可证号：SCXK（鲁）2 0 19-31中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期Chin JExp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.10003。所有小鼠于相同环境恒温（2 2 2）、恒湿（555）%下普通饲养，自由进食饮水，12 h光-暗交替，适应性培养1周。动物实验过程遵循动物福利3R原则，经内蒙古包钢医院实验动物伦理委员会审核批准（批文号：2 0 2 1MER-023）。1.1.2主要试剂及仪器姜黄素（纯度9 8%）（458-37-7，四川维克奇生物科技有限公司）；Matrigel基质胶（356 2 34，美国BD公司）；细胞计数试剂盒8（cellcountingkit-8,CCK8）（s c k 0 10 5，上海生博生物医药科技有限公司）；AnnexinV-FITC/PI流式细胞调亡检测试剂盒（KGA106，南京凯基生物科技公司）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（PC0020，北京索莱宝科技有限公司）；兔抗-catenin（a b 2 2 30 7 5）、兔抗轴抑制蛋白2（a x i s i n h i b i t i o n p r o t e i n 2,A x i n 2）（a b 10 9 30 7）、兔抗细胞周期蛋白D1（Cy c l i n D 1）（a b 16 6 6 3）、兔抗Survivin（a b 7 6 42 4）、兔抗c-Myc（a b 32 0 7 2）单克隆抗体，兔免抗基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase9,MMP-9）（a b 38 8 9 8）多克隆抗体，辣根过氧化物酶偶联的二抗（a b 150 0 7 7，美国Abcam公司）；兔抗糖原合成酶激酶3（g l y c o g e n s y n t h a s e k i n a s e 3,CSK-3）单克隆抗体（YT 7 8 2,北京百奥莱德科技有限公司）；兔抗磷酸化GSK-3（p-G SK-3）多克隆抗体（PL0303230，加拿大PLLaboratories公司）。IX70型倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司）；Allegra64R低温高速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；ABI7300型实时荧光定量PCR系统（美国ABI公司）；GelDocXR+凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD公司）。1.22方法1.2.1细胞复苏、培养及培养液配制用含10%胎牛血清的DMEM完全培养液复苏M23细胞，于37、5%CO，的培养箱中培养，传代2 3次。采用8 48.32 ml含10%胎牛血清的DMEM完全培养液溶解2 0 mg姜黄素以制备原始浓度为8 0 mol/L姜黄素的条件培养液，后取适量8 0 mol/L姜黄素的条件培养液进行倍比稀释以制备含2 0、40 mol/L姜黄素的条件培养液。1.2.2CCK8法检测细胞存活率收集对数生长期M23细胞，分别采用含0、2 0、40 及8 0 mol/L姜黄素培养液重悬细胞，调整细胞密度为2 10*4个/ml。细胞以每孔2 10 3个密度接种于9 6 孔板中，每个浓度各设置5个复孔。培养48 h后，各孔加人10 lCCK8溶液,37 下孵育2 h，采用酶标仪于450 nm处测定吸光度（absorbance,A）值，细胞存活率（%）=各浓度姜黄素组A值/0 mol/L姜黄素组A值10 0%。实验重复3次。1.2.3平板克隆形成实验检测细胞集落数收集对数生长期M23细胞，采用含0、2 0、40 和8 0 mol/L姜黄素的DMEM完全培养液重悬，以每孔110 3个细胞密度接种至6 孔板内，每3天更换1次培养液；培养2周后，PBS洗涤2 次，4%多聚甲醛溶液室温固定15min，0.1%结晶紫溶液染色2 0 min，PBS洗涤2 次，晾干，观察集落形成情况并计数。光学显微镜下观察细胞形态，ImageJ软件统计细胞克隆形成的集落数目，超过50 个细胞的集落被认为1个集落形成。实验重复3次。1.2.4流式细胞仪检测细胞调亡率收集对数生长期M23细胞，采用含0、2 0、40 和8 0 mol/L姜黄素的DMEM完全培养液重悬，以每孔110 个细胞接种至6孔板内并连续培养48 h。胰蛋白酶消化,PBS洗涤2次，10 0 0 r/min（离心半径10 cm）离心5min，收集细胞，加人结合缓冲液重悬并调整细胞密度为110 个/ml,连续加人5lAnnexinV-FITC溶液、5lPI溶液，室温避光染色15min，采用流式细胞仪检测细胞调亡率。实验重复3次。1.2.5细胞划痕实验检测细胞迁移率收集对数期M23细胞，以每孔510 个接种至2 4孔板内培养，直至细胞融合，利用无菌10 l移液枪头尖端划线，PBS洗涤，更换不含胎牛血清的含0、2 0、40 和8 0 mol/L姜黄素的DMEM培养液继续培养48 h；在划痕后0 h和48 h拍照，采用ImageJ软件测量划痕宽度。计算细胞迁移率,细胞迁移率（%）=（0 h 划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度10 0%。实验重复3次。1.2.6Transwell实验检测细胞侵袭数采用Matrigel基质胶涂布Transwell上室，4下干燥，将不同浓度姜黄素处理48 h后的各组细胞用胰蛋白酶消化，采用不含胎牛血清的对应培养液重悬；调整细胞密度为2 10个/ml，以10 0 l/孔接种至Transwell24孔板上室，下室加人50 0 l含2 0%胎牛血清的DMEM培养液，48 h后用9 5%乙醇固定Transwell下侧侵人的细胞30min，0.1%结晶紫染色15min，40 0 倍光学显微镜下随机选取5个视野进行观察并拍照，统计细胞数目，重复计数3次，取平均值。实验重复3次。1.2.7实时荧光定量PCR法检测Wnt/-catenin通路相关基因表达采用含0、2 0、40、8 0 mol/L姜黄素的DMEM完全培养液重悬对数生长期M23细胞，以110个/孔接种至6 孔板内并连续培养48 h。采用Trizol试剂提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度后，通过琼脂糖凝胶电泳技术检测RNA完整性，利用逆转录试剂盒将RNA反转录为32.ChinJExp Ophthalmol,January2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期cDNA。c-M y c 基因引物序列：正向为5-GGCAAAAGGTCAGAGTCTGG-3,反向为5-GTGCATTTTCGGTTGTTGC-3;CyclinD1基因引物序列：正向为5-CCGCCTCACACGCTFCCTCTC-3，反向为5-TCCTCCTCGGCGGCCTTGGCG-3；Su r v i v i n 基因引物序列：正向为5-TGGACAAACAAAGAGCCAAGAA-3，反向为5-TAGAGCAAAGCCACAAAACCAA-3;MMP-9基因引物序列：正向为5-TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3,反向为5-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3；G A PD H 基因引物序列：正向为5-ATTTGGTCGTATTGGGCG-3,反向为5-TGGAAGATGGGTGATGGGATT-3。各基因引物由上海生工生物工程有限公司合成。以cDNA为模板，对各基因引物于ABI7300系统上进行实时荧光定量PCR分析，反应条件：9 5预变性3min；9 5变性5s,58退火及延伸1min,共39 个循环。以GAPDH为内参，采用2-ACI法计算各目的基因相对表达量。实验重复3次。1.2.88Westernblot法检测Wnt/-catenin通路相关蛋白表达水平采用含0、2 0、40、8 0 mol/L姜黄素的DMEM完全培养液重悬对数生长期M23细胞，以110个孔密度接种至6 孔板内并连续培养48 h。1000r/min离心5min收集细胞，PBS清洗3次，RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。采用BCA法测定总蛋白浓度，上样2 0 g总蛋白进行SDS-PACE凝胶电泳分离，湿法转印至PVDF膜；取PVDF膜于含0.05g/ml脱脂奶粉的三乙醇胺缓冲盐水溶液（trisbuffered saline,TBS）中室温封闭1h，置于相应一抗（均1:10 0 0 稀释）中4孵育过夜，TBS洗膜3次；辣根过氧化物酶偶联的二抗（1：10 0 0 0 稀释）室温孵育1h,TBS洗膜3次；ECL发光液显色，全自动凝胶成像系统拍照。采用ImageJ软件分析条带灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示各蛋白相对表达量。1.2.9UM荷瘤小鼠模型的建立及分组处理于2 0只小鼠左后腹皮下脂肪垫注射M23细胞悬浮液100l（110 7 个细胞），接种5d后接种部位可触摸到结节为造模成功。将造模成功小鼠按照随机数字表法随机分为模型组、姜黄素低、中和高剂量组，每组各5只，分别于腹腔内注射含0、10、2 0 和40 mg/kg姜黄素的生理盐水溶液，每日注射1次，连续注射30 d。1.2.10肿瘤质量检测各组小鼠末次给药后禁食24h，颈椎脱白法处死后，剥离小鼠左后腹皮下瘤体并称取肿瘤质量，比较各组小鼠肿瘤质量。1.3统计学方法采用SPSS26.0统计学软件进行统计分析。各计量资料数据经Shapiro-Wilk检验证实呈正态分布，以xs表示。各组间计量资料差异总体比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义2结果2.1各组细胞形态及存活率比较倒置显微镜下观察可见，M23细胞相互连接紧密，呈融合状纺锤形；经不同浓度姜黄素作用后细胞逐渐变得扁平、狭长，假足状突起逐渐增多，细胞密度逐渐减小（图1）。不同浓度姜黄素组间M23细胞存活率总体比较差异有统计学意义（F=125.321,P0.001）；M23细胞存活率随姜黄素浓度升高而降低，组间两两比较差异均有统计学意义（均P0.05）（表1）。2.2不同浓度姜黄素组细胞集落形成数比较随着姜黄素作用浓度增大，细胞集落数逐渐减少（图2）。不同浓度姜黄素组M23细胞集落形成数总体比较差异有统计学意义（F=97.941，P0.001）；M 2 3细胞集落形成数随姜黄素浓度增大而减少，组间两两比较差异均有统计学意义（均P0.05)(表2)。0mol/L姜黄素组20mol/L姜黄素组40mol/L姜黄素组80mol/L姜黄素组200um200Mm200um00图1光学显微镜下不同浓度姜黄素组M23细胞形态图（10 0，标尺=2 0 0 m）随着姜黄素浓度的增加，细胞密度逐渐降低，其中0 mol/L姜黄素组细胞呈融合状纺锤形，不同浓度姜黄素组处理后细胞逐渐变得扁平、狭长Figure 1 Observation of M23 cells after 48-hour treatment in different concentrations of curcumin groups(x100,scale=200 m)The cell densitywas gradually reduced with the increase of curcumin concentration.The cells in O mol/L curcumin group were fused and spindle-shaped,and the cellsgradually became flattenedlong and narrow after treatment with different concentrations of curcumin33：Chin J Exp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期表1不同浓度姜黄素组M23细胞存活率比较（xs，%）Table 1Comparison of survival rate of M23 cells amongdifferent concentrations of curcumin groups(x+s,%)组别样本量细胞存活率0mol/L姜黄素组3100.000.0020mol/L姜黄素组383.784.59a40mol/L姜黄素组366.09 3.92ab80mol/L姜黄素组347.16 3.63 abeF值125.321P值0.001注：与0 mol/L姜黄素组比较，P0.05;与2 0 mol/L姜黄素组比较，P0.05；与40 mol/L姜黄素组比较，P0.05（单因素方差分析，LSD-t 检验)Note:Compared with 0mol/L curcumin group,P0.05;compared with20mol/Lcurcumin group,p0.05;compared with 40mol/L curcumingroup,P0.05(One-way ANOVA,LSD-t test)0 mol/L姜黄素组20mol/L姜黄素组40 mol/L姜黄素组80mol/L姜黄素组图2 各浓度姜黄素组M23细胞集落形成情况细胞集落数随着姜黄素浓度的增加而逐渐减少Figure 2 Colony formation of M23 cells in different concentrations of curcumin groupsThecolony formation number was gradually decreased with the increase of curcumin concentration2.3不同浓度姜黄素组细胞调亡率比较流式细胞术检测结果显示，随姜黄素浓度增大，早期凋亡及晚期调亡细胞逐渐增多（图3）。不同浓度姜黄素组细胞凋亡率总体比较差异有统计学意义（F=72.516,P0.001）；M 2 3细胞调亡率随姜黄素作用浓度增加而逐渐升高，组间两两比较差异均有统计学意义（均P0.05）（表3）。0.05）（表4）。表2不同浓度姜黄素组细胞集落形成数量比较（xs，个）Table 2Comparison of colony formation number of M23 cellsamong different concentrations of curcumin groups(xs,pcs)组别样本量集落形成数0mol/L姜黄素组3128.79.220mol/L姜黄素组3100.3 8.7a40mol/L姜黄素组358.7 6.6ab80mol/L姜黄素组331.7 4.9abeF值97.941P值0.001注：与0 mol/L姜黄素组比较，P0.05；与2 0 mol/L姜黄素组比较，P0.05；与40 mol/L姜黄素组比较，P0.05（单因素方差分析，LSD-t 检验)Note:Compared with 0mol/L curcumin group,P0.05;compared with20mol/L curcumin group,bP0.05;compared with 40mol/L curcumingroup,P0.05(One-way ANOVA,LSD-ttest)2.4不同浓度姜黄素组细胞迁移率比较随着姜黄素作用浓度增加，细胞生长迁移速度减慢（图4）。不同浓度姜黄素组M23细胞迁移率总体比较差异有统计学意义（F=277.097,P0.001)；其中M23细胞迁移率随姜黄素作用浓度增加而降低，组间两两比较差异均有统计学意义（均P2.5不同浓度姜黄素组细胞侵袭数目比较随着姜黄素浓度增加，侵袭细胞密度逐渐减小（图5）。不同浓度姜黄素组M23侵袭细胞数总体比较差异有统计学意义（F=139.006,P0.001）；M 2 3侵袭细胞数随姜黄素作用浓度增加而减少，各组间两两比较差异均有统计学意义（均P0.05）（表5）。0 mol/L姜黄素组20umol/L姜黄素组40mol/L姜黄素组80mol/L姜黄素组3101010510210101051010410s103101010FITC-AnnexinV图3不同浓度姜黄素组细胞凋亡流式细胞图细胞早期及晚期调亡率随着姜黄素浓度的增加而逐渐升高Figure 3 Flow cytometry of M23 cell apoptosis of various concentrations of curcumin groupsThe early and late apoptosis rates were graduallyincreased with the increase of curcumin concentration34，Chin JExp Ophthalmol,January 2024,Vol.42,No.1中华实验眼科杂志2 0 2 4年1月第42 卷第1期表3不同浓度姜黄素组细胞凋亡率比较（xs，%）Table3Comparison of apoptosis rates of M23 cells amongdifferent concentrations of curcumin groups(xs,%)组别样本量细胞调亡率0 mol/L姜黄素组31.330.2920mol/L姜黄素组314.53 2.04a40mol/L姜黄素组327.23 3.56ab80mol/L姜黄素组344.73 4.36abcF值72.516P值0.001注：与0 mol/L姜黄素组比较，P0.05；与2 0 mol/L姜黄素组比较，bP0.05；与40 mol/L姜黄素组比较，P0.05（单因素方差分析，LSD-t检验)Note:Compared with 0 mol/L curcumin group,P0.05;compared with20 mol/L curcumin group,b P0.05;compared with 40 mol/L curcumingroup,P0.05(One-way ANOVA,LSD-t test)2.6不同浓度姜黄素组Wnt/-catenin通路相关基因表达水平比较不同浓度姜黄素组M23细胞c-Myc、Cy c li n D 1、Survivin及MMP-9mRNA相对表达水平总体比较差异均有统计学意义（F=241.558、2 6 9.8 0 4、17 9.6 8 0、284.000,均P0.001）；其中M23细胞c-Myc、Cy c l i nD1、Su r v i v i n 及MMP-9mRNA相对表达水平均随姜黄素作用浓度增加而降低，组间两两比较差异均有统计学意义（均P0.05)（表6）。0mol/L姜黄素组20mol/L姜黄素组40mol/L姜黄素组80mol/L姜黄素组二4图4不同浓度姜黄素组细胞迁移情况细胞迁移速度随着姜黄素浓度的增加逐渐减慢Figure 4 Migration of M23 cells in different concentrations of curcumin groupsThecell migration rate was gradually lowered with the increase of curcumin concentration表4不同浓度姜黄素组细胞迁移率比较（xs，%）Table 4Comparison of M23 cell migration rate amongdifferent concentrations of curcumin groups(x+s,%)组别样本量细胞迁移率0 mol/L姜黄素组389.764.5720mol/L姜黄素组365.433.70a40mol/L姜黄素组334.83 2.19ab80mol/L姜黄素组318.82 1.99abcF值277.097P值0.001注：与0 mol/L姜黄素组比较，P0.05；与2 0 mol/L姜黄素组比较，P0.05；与40 mol/L姜黄素组比较，P0.05（单因素方差分析，LSD-t检验)Note:Compared with 0 mol/L curcumin group,P0.05;compared with20 mol/L curcumin group,P0.05;compared with 40 mol/L curcumingroup,P0.05），-cat