江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征分析.pdf

中 国 人 兽 共 患 病 学 报C h i n e s eJ o u r n a l o fZ o o n o s e s ,()D O I:/j i s s n 实验研究江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征分析孔筱筱,韩悦,周璐,程晓庆,董晨十四五流行病学重点学科(N o Z D X K )通讯作者:董晨,E m a i l:d o n g c h e n_J S C D C c o m;O R C I D:作者单位:国家卫生健康委员会肠道病原微生物重点实验室,江苏省疾病预防控制中心,南京 ;杭州远大生物制药有限公司,杭州 摘要:目的分析江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征,进而评估其潜在的致病性,为感染性腹泻的监测与防控提供依据.方法采用全基因组测序技术对江苏省某监测点分离的家畜来源的 株肠致病性大肠埃希菌(E P E C)菌株进行特征性分析.结果本地家畜来源的E P E C均为非典型E P E C(a E P E C),其血清型多样,携带多种与腹泻相关的毒力基因,有种S T型且具有区域性流行特征,e a e基因包含有种亚型,为优势亚型,其在腹泻病人中也最为常见.结论a E P E C对公众健康构成潜在威胁,应在感染性腹泻的监测工作中,加强对家畜粪便及养殖环境的监测.关键词:肠致病性大肠埃希菌;感染性腹泻;分子特征分析中图分类号:R 文献标识码:A文章编号:()M o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c so f e n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l ii s o l a t e sf r o ml i v e s t o c ka t am o n i t o r i n gp o i n t i nJ i a n g s uP r o v i n c eKONGX i a o x i a o,HANY u e,Z HOUL u,CHE NGX i a o q i n g,D ONGC h e n(J i a n g s uC e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o la n dP r e v e n t i o n,K e yL a b o r a t o r yo fI n t e s t i n a lP a t h o g e n i cM i c r o o r g a n i s m s,N a t i o n a lH e a l t hC o mm i s s i o n,N a n j i n g ,C h i n a;H a n g z h o uY u a n d aB i o p h a r m a c e u t i c a lC o,L t d,H a n g z h o u ,C h i n a)A b s t r a c t:T h i ss t u d yw a sa i m e da ta n a l y z i n gt h em o l e c u l a rc h a r a c t e r i s t i c so fe n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i(Ec o l i)s t r a i n s i s o l a t e df r o md o m e s t i ca n i m a l sa t as u r v e i l l a n c es i t e i nJ i a n g s up r o v i n c ea n de v a l u a t i n gt h e i rp o t e n t i a l p a t h o g e n i c i t y,t op r o v i d ee v i d e n c e s u p p o r t i n g t h e s u r v e i l l a n c e,p r e v e n t i o n,a n dc o n t r o l o f i n f e c t i o u sd i a r r h e a T h i r t y s e v e nE P E Cs t r a i n s i s o l a t e df r o md o m e s t i ca n i m a l sa t t h i ss u r v e i l l a n c e s i t ew e r e c h a r a c t e r i z e db yw h o l eg e n o m e s e q u e n c i n g A l lE P E Cs t r a i n s i s o l a t e d f r o ml o c a l l i v e s t o c kw e r ea E P E C,w h i c hh a sav a r i e t yo f s e r o t y p e sa n dc a r r i e sav a r i e t yo fv i r u l e n c eg e n e sa s s o c i a t e dw i t hd i a r r h e a N i n eS Tt y p e sw i t hr e g i o n a l e p i d e m i cc h a r a c t e r i s t i c sw e r e i d e n t i f i e d F i v ee a eg e n es u b t y p e sw e r e f o u n d,a m o n gw h i c hw a sd o m i n a n t a n dw a sa l s ot h em o s tc o mm o ns t r a i ni np a t i e n t sw i t hd i a r r h e a A c c o r d i n gt oa n a l y s i so ft h ec h a r a c t e r i s t i c so f E P E Cs t r a i n s,a l lE P E Cs t r a i n s f r o ml o c a l l i v e s t o c kw e r e a E P E C,t h u sp o s i n gap o t e n t i a l t h r e a t t op u b l i ch e a l t h M o n i t o r i n go fl i v e s t o c kf e c e sa n dt h eb r e e d i n ge n v i r o n m e n tm u s tb es t r e n g t h e n e d i nt h es u r v e i l l a n c eo f i n f e c t i o u sd i a r r h e a K e y w o r d s:e n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i;i n f e c t i o u sd i a r r h e a;m o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i ca n a l y s i sS u p p o r t e db yt h eK e yD i s c i p l i n eo fE p i d e m i o l o g i c a lS t u d i e s i nt h e t hF i v e Y e a rP l a n(N o Z D X K )C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:D o n gC h e n,E m a i l:d o n g c h e n_J S C D C c o m肠致病性大肠埃希菌(e n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i,E P E C)是导致发展中国家婴儿腹泻的一个重要原因,已从动物和动物食品中分离出来.将携带编码紧密黏附素的e a e基因,而不具有编码志贺毒素的s t x基因的致泻性大肠埃希菌(d i a r r h e a g e n i cEc o l i,D E C)定义为E P E C.我国由D E C引起的岁以下腹泻儿童病例中,E P E C是常见病原体.动物 一 直 被 认 为 是E P E C的 天 然 宿 主.E P E C可被动物无症状携带,通过粪便污染周围环境,并在屠宰和加工过程中污染肉类,从而导致人类感染.江苏省在畜牧养殖业方面有着传统优势,家畜粪便携带的E P E C对于环境污染所引发的公共卫生安全问题不容忽视.本研究对某监测点家畜来源的E P E C进行全基因组测序,了解其血清型分布、毒力基因携带情况、S T型别特征以及与同期分离的产志贺毒素大肠埃希菌(s h i g at o x i n p r o d u c i n gE s c h e r i c h i a c o l i,S T E C)之间的遗传进化关系,进而评估其潜在的致病性,为感染性腹泻的监测与防控提供依据.材料与方法材料菌株来源 株E P E C分离株、株S T E C分离株均分离自 年江苏省产志贺毒素大肠埃希菌相关监测点牛羊家畜动物的粪便中,由江苏省疾病预防控制中心急性传染病防制所采用磁珠法 保存.菌株的复苏、纯化及鉴定方法参照文献.主要试剂和仪器营养琼脂培养基(北京陆桥 技 术 有 限 公 司)、E C C显 色 培 养 基(法 国CHR OM a g a r公司)、细菌基因组D NA提取试剂盒(美国P r o m e g a公司)、P C R M a s t e rM i x(美国P r o m e g a公司)、P C R仪(美国A p p l i e dB i o s y s t e m s公司)、毛细管电泳仪(德国Q i a g e n公司)、P C R引物(上海生工生物).方法全 基 因 组 测 序、组 装采 用 细 菌 基 因 组D NA提取试剂盒对测试菌株基因组进行提取.使用I l l u m i n aH i S e qP E 测序平台构建成对双末端测序文库,全基因组测序工作由上海生工生物工程有限公司完成.通过f a s t p 剔除r e a d s首尾质量Q 区域,并去除接头,上传至E n t e r o B a s e数据库(h t t p s:/e n t e r o b a s e w a r w i c ka c u k),使用该数 据 库 自 动 组 装 管 道QA s s e m b l yv 中S P A d e sv 进行基因组从头组装.E P E C菌株分子特征分析 血清型将组装完整的基因组序列 与C e n t e rf o r G e n o m i c E p i d e m i o l o g y(C G E)S e r o t y p e F i n d e rv 数据库(h t t p s:/c g e c b s d t u d k/s e r v i c e s/S e r o t y p e F i n d e r/)进行比对,设置比对参数为:序列相似性,覆盖度,获得菌株OH血清型,如果基因组血清型未预测成功,再使用E n t e r o B a s e数据库进行血清型预测.b f p A基因、毒力基因分析将组装完整的基因组序列与C G E V i r u l e n c e F i n d e rv 数据库(h t t p s:/c g e c b s d t u d k/s e r v i c e s/V i r u l e n c e F i n d e r/)进行比对,识别b f p A及其他毒力基因,设置比对参数为:序列相似性,覆盖度.ML S T分型使用E n t e r o B a s e数据库对菌株 基 因 组 识 别 基 于个 管 家 基 因(a d k、i c d、f u m C、r g y r B、p u r A、m d h和r e c A)的ML S T分型,采用ME GAv 软件构建最小生成树.e a e基因分型及进化关系分析从组装完整的基因组序列中提取e a e基因的全长,从N C B IG e n B a n k数据库中获得常见 种e a e基因型别序列.使用N C B I中B L A S T n套件(h t t p s:/b l a s t n c b i n l mn i hg o v/B l a s t c g i)进行e a e型别比对,当序列同源性大于 时,则认为该分离株e a e与参考e a e型别一致.使用ME GAv 软件中C l u s t a lW进行多序列比对并对齐,采用最大似然法构建进化树,分析 株E P E C分离株间e a e基因关系.基于c g ML S T构建E P E C与同期分离的S T E C系统发育树本研究利用E n t e r o b a s e数据库进行c g ML S T分型来评估 株E P E C与当地同期分 离 的 株S T E C菌 株 之 间 的 进 化 关 系.c g ML S T核心基因组方案采用E n t e r o b a s e数据库中大肠杆菌 个核心基因组等位基因位点方案.通过G r a p e T r e ev 程序使用M S T r e ev 算法构建最小生成树(m i n i m u ms p a n n i n gt r e e,M S T),同时将簇定义为小于 个等位基因差异的菌株群.结果血清型、毒力基因及S T型 株E P E C分离株共分为 种不同O血清群和种不同H型,组成 种 不 同O H血 清 型.从 羊 粪 中 分 离 的E P E C的优势血清型为O H(,/),O H (,/),和O H (,/)(表).株来源于牛粪的E P E C血清型同属于O H .株E P E C中均为b f p A基因阴性,判定为非典型E P E C(a t y p i c a lE P E C,a E P E C).其他毒力基因分布情况详见表.期孔筱筱,等:江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征分析表E P E C分离株其他毒力基因分布T a b D i s t r i b u t i o no fo t h e rv i r u l e n c eg e n e s i nE P E Ci s o l a t e s毒力基因种类毒力基因羊(n)牛(n)合计(n)百分率/黏附相关基因i h a t o x B e f a l p f A o m p T p a p C 型分泌系统基因e s p A e s p B e s p F e s p J 非L E E效 应基因n l e A n l e B n l e C 毒素相关基因e h x A s u b A 肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自动转家族e p e A e s p l e s p P 血清抗性因子基因i s s t r a T 其他g a d t e r C 根据ML S T分型方法,株分离株被分成种S T型(图),其中S T 和S T 比例较高,分别为(/)和(/).除S T 包含有种血清型(O H ,O H )外,其余S T型对应单一的血清型.e a e基因分型及进化关系分析 株E P E C分离株经比对后,共产生种e a e型别,分别为、和.其中最主要的型别为,占比(/),其次为,占比(/),而、和型分别为株、株和株.见表.株羊来源的E P E C分离株存在种e a e型别(、和),而株牛来源的E P E C分离株e a e型别均为.见表.e a e基因的聚类结果表明:株菌的e a e基因共分为个组,其中组、组、组分别对应不同的型基因序列,组包含种不同的型e a e基因序列,其余组各对应、型的种基因序列.从和血清型的对应关系来看,组为型,包含有 株菌,血清型为O H;组为 型,包含有株菌,血清型为O H;组为型,包含有株菌,血清型为O H、O H ;组为型,包含有株菌,血清型为O H 、O H ;组为型,包含有株菌,血清型为O H、O H ;组为型,包含株菌,血清型为O H,组为型,包含有株菌,血清型为O H .见表和图.图E P E C菌株S T型别构建的最小生成树F i g M i n i m u ms p a n n i n g t r e ec o n s t r u c t e do nt h eb a s i so fE P E Cs t r a i nS Tt y p e中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()表 株E P E C分离株e a e基因分型结果T a b G e n o t y p i n gr e s u l t so fe a ei n E P E Ci s o l a t e s菌株名称菌株来源血清型e a e型别A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H A E P E C羊O H N E P E C牛O H N E P E C牛O H W E P E C羊O H W E P E C羊O H 基 于c g ML S T构 建E P E C与 同 期 分 离 的S T E C系统发育树 株E P E C和 株同期分离图采用最大似然法构建e a e基因的系统进化树F i g P h y l o g e n e t i ct r e eo ft h ee a eg e n ew i t ht h em a x i m u ml i k e l i h o o dm e t h o d的S T E C进 化 关 系 采 用E n t e r o b a s e数 据 库 中 的c g ML S T方案,如图所示.所有分离株间等位基因差异为 个.当采用 个等位基因差异的聚类阈值时,E P E C中形成了个簇,而S T E C中形成了个簇.每个簇包含有相同的血清型和S T型,菌株间的等位基因差异为个等位基因.簇间的 等 位 基 因 差 异 数 至 少 为 个 等 位 基 因.E P E C中 的 优 势 簇 为 簇,由 株O H E P E C组成.在簇 中观察到e a e阳性O H S T E C菌株和O H E P E C菌株之间有 个等位基因差异.讨论过去,血清型一直做为E P E C的鉴定依据.随着高通量测序技术的发展,越来越多的E P E C的血清型被发现 .迄今为止,世界范围内已经发现 多种血清型的E P E C菌株.本研究的结果显示,监测点分离的E P E C菌株的血清型呈现多样期孔筱筱,等:江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征分析注:圆圈内的编号代表菌株血清型,圆圈间连线上的数字代表等位基因差异数.图基于 株E P E C和同期分离的 株S T E C核心等位基因差异构建最小生成树F i g M i n i m u ms p a n n i n g t r e eb a s e do nc o r ea l l e l ed i f f e r e n c e sb e t w e e n E P E Cs t r a i n s a n d S T E Cs t r a i n s i s o l a t e d i nt h e s a m ep e r i o d性.建议在E P E C日常检测中采用分子生物学方法.b f p A基因是区分典型E P E C(t E P E C)和非典型E P E C(a E P E C)的主要依据.本研究中,所有的E P E C均为a E P E C.这与其他文献报道的相一致:即t E P E C的宿主只有人,而a E P E C在人和动物中广泛存在.近年来越来越多的研究发现,目前a E P E C在发展中国家和发达国家的存在的比例高于t E P E C,甚 至 有 报 道 表 明 其 存 在 率 达 .我国的数据也表明,中国E P E C菌株中,a E P E C菌株所占比例也显著高于t E P E C.尽管a E P E C较t E P E C引起的腹泻症状轻,不会造成脱水,但是其腹泻时间延长,容易引起儿童慢性腹泻、营养不良等.本文中a E P E C毒力基因携带种类多样.值 得 关 注 的 是,型 分 泌 系 统 基 因e s p B()、e s p F()、e s p J()、非L E E效应基因n l e B()、毒素相关基因e h x A()都是 与E P E C致 病 相 关 的 重 要 毒 力 基 因.ML S T分型结果表明,本地监测点E P E C菌株S T型丰富,且与其他地区报道的家畜来源的大肠埃希菌S T型不同,说明此监测点家畜来源E P E C的传播具有地区局限性的特点.e a e基因位于E P E C染色体的L E E(l o c u so fe n t e r o c y t ee f f a c e m e n t)毒力岛中,会对肠黏膜造成黏附/抹平(a t t a c h i n ga n de f f a c i n g,A/E)损伤,全长约 b p.由于e a e基因 端相对保守,而 端差异较大,根据这种差异,将e a e分为不同亚型,目前已发现超过 种不同型别,不同e a e型别具有不同的宿主特异性和组织嗜性.本研究中,型是e a e基因主要的亚型.有报道表明,含有型e a e基 因 的E P E C菌 株 在 腹 泻 病 人 中 最 为 常见.可见此监测点动物来源的E P E C具有一定的致病潜力,需要加以关注.e a e基因的聚类结果显示,同种血清型的E P E C菌株,具有同种的e a e亚型,如图组中,株O H E P E C菌株均为型;同时不同血清型的E P E C菌株也可能具有相同的e a e亚型,如图,虽然其中包含的菌株e a e亚型序列相同,均为型,但是他们的血清型不同.这个结果可以推测,相同的e a e亚型可以在不同血清型的菌株中转移.有研究表明,a E P E C在遗传学上和携带有e a e基因的S T E C更为接近.本研究采用基于全基因组测序技术的c g ML S T方法来构建E P E C与同期中 国 人 兽 共 患 病 学 报 ,()分离S T E C的系统发育树,以了解E P E C和S T E C之间的遗传进化关系.结果表明,基于不同的血清型和S T型,E P E C和S T E C各自成簇.其原因可能是此监测点分离到的大多数S T E C不含有e a e基因.而株e a e阳性O H S T E C菌株与其他S T E C菌株遗传距离较远,与同种血清型的E P E C菌株之间有 个等位基因差异.有研究假设,在感染、分离或继代培养过程中,携带e a e基因的S T E C菌株可以和E P E C菌株通过丢失或溶原化编码S t x的噬菌体进行转化.因此,我们推测这株e a e阳性O H S T E C菌株的编码S t x的噬菌体 在同种血清 型的E P E C中 可 能 发 生 了转移.综上所述,本研究采用全基因组测序技术对江苏省某监测点分离的家畜来源的 株E P E C菌株进行特征性分析,发现此监测点家畜来源的E P E C均为a E P E C,其血清型多样、携带多种与腹泻相关的毒力基因,S T型丰富且具有区域性特征,e a e基因包含有种亚型,有种优势亚型在腹泻病人中最为常见,可见此监测点a E P E C对当地公众健康构成潜在威胁.此外,我们推测此监测点的a E P E C与S T E C存在通过噬菌体的转移发生转化的可能性,由于S T E C是一类可引起暴发和严重疾病的最常见致泻性大肠杆菌,所以我们认为不可忽视家畜传播a E P E C的潜在风险,应在感染性腹泻的监测工作中,加强对家畜粪便及养殖环境的监测.利益冲突:无引用本文格式:孔筱筱,韩悦,周璐,等江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征分析J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n 参考文献:H uJ,T o r r e sA G E n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i:f o eo ri n n o c e n tb y s t a n d e rJ C l i n M i c r o b i o lI n f e c t,():D O I:/j c m i M o n a g h a n,B y r n eB,F a n n i n gS,e ta l S e r o t y p e sa n dv i r u l e n c ep r o f i l e so fa t y p i c a le n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i(E P 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a I,R a y t s e l i sY,e t a l N C B IB L A S T:ab e t t e rw e bi n t e r f a c eJ N u c l e i cA c i d sR e s,(W e bS e r v e r):W W D O I:/n a r/g k n Z h o uZ,A l i k h a nN F,M o h a m e dK,e t a l T h ee n t e r o b a s eu s e rsg u i d e,w i t hc a s es t u d i e so nS a l m o n e l l at r a n s m i s s i o n s,Y e r s i n i ap e s t i sp h y l o g e n y,a n dE s c h e r i c h i ac o r eg e n o m i cd i v e r s i t yJ G e n o m eR e s,():D O I:/g r Z h o uZ,A l i k h a nN F,S e r g e a n tM J,e t a l G r a p eT r e e:v i s u a l i z a t i o no fc o r eg e n o m i cr e l a t i o n s h i p sa m o n g b a c t e r i a lp a t h o g e n sJ G e n o m eR e s,():D O I:/g r M l l e r S t r a yJ,E r i k s e n HM,B r u h e i m T,e ta l T w oo u t b r e a k so fd i a r r h o e a i nn u r s e r i e s i nN o r w a ya f t e r f a r m v i s i t s,A p r i l t o M a y J E u r oS u r v e i l l,():D O I:/e s e e n H e d b e r gCW,S a v a r i n oS J,B e s s e rJ M,e ta l A no u t b r e a ko ff o o d b o r n e i l l n e s sc a u s e db yE s c h e r i c h i ac o l iO NM,a na g e n tn o t f i t t i n g i n t o t h e e x i s t i n gs c h e m e f o r c l a s s i f y i n gd i a r r h e o g e n i cEc o l iJ JI n f e c tD i s,():D O I:/巴鹏斌,赵爱兰,白向宁,等肠致病性大肠埃希菌分离株血清型多样性分析J中国卫生检验杂志,():,O c h o aT J,C o n t r e r a sC A E n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l ii n f e c t i o n i nc h i l d r e nJ C u r rO p i nI n f e c tD i s,():D O I:/Q C O b e a b b 吴少鹏,王国华,赵效南,等山东省某地区奶牛源大肠埃希菌的血清型、耐药特性及分子特性J微生物学报,():D O I:/j c n k i w s x b Z h a n gS,W uQ,Z h a n gJ,e ta l O c c u r r e n c ea n dc h a r a c t e r i z a t i o no fe n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l i(E P E C)i nr e t a i lr e a d y t o e a t f o o d s i nC h i n aJ F o o d b o r n eP a t h o gD i s,():D O I:/f p d 白向宁,许彦梅,赵爱兰,等非O 产志贺毒素大肠埃希菌分离株e a e基因分型分析J中华微生物学和免疫学杂志,():D O I:/c m a j i s s n 杨蕾,李俊霖,申玉玺,等肠致病性大肠杆菌紧密黏附素的作用机制及基因分型研究进展J中国人兽共患病学报,():D O I:/j i s s n K o s s o wA,Z h a n gW,B i e l a s z e w s k aM,e ta l M o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no f h u m a na t y p i c a l s o r b i t o l f e r m e n t i n ge n t e r o p a t h o g e n i cE s c h e r i c h i ac o l iO r e v e a l sh i g hd i v e r s i t yJ JC l i nM i c r o b i o l,():D O I:/J CM 收稿日期:编辑:梁小洁期孔筱筱,等:江苏省某监测点家畜来源肠致病性大肠埃希菌分离株分子特征分析