T∕CIQA 51-2023 食药物质中T-2和HT-2毒素的测定液相色谱串联质谱法.pdf

IICS 67.040CCS X11团团体体标标准准T/CIQA 51-2023食药物质中食药物质中 T-2 和和 HT-2 毒素的测定毒素的测定液相色谱串联质谱法液相色谱串联质谱法Determination of T-2 and HT-2 in drug homologous foods byHPLC-MS/MS method2023-02-20发布2023-08-20实施中国出入境检验检疫协会 发布T/CIQA 51-2023I前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国出入境检验检疫协会进出口食品标准化技术委员会（CIQA/TC10）提出并归口。本文件起草单位：南京师范大学、中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所、皖西学院、江西中医药大学、湖南农业大学、南京海关动植食中心、常州磐诺仪器公司、中国药科大学。本文件主要起草人：吕广萍、王涵文、孙力军、沈伟健、韩邦兴、陈丽华、简晖、卢向阳、刘虎虎、张新轩、曹崇江、胡德俊、林群英、黄泽建、董欢欢、张盈月、匡峰岩、易鑫、吴丽娜。本文件知识产权归中国出入境检验检疫协会所有。任何单位或个人未经许可，不得以营利为目的，印制、出版、翻译、转发或复制全文或部分文字。T/CIQA 51-20231食药物质中 T-2 和 HT-2 毒素的测定 液相色谱串联质谱法1范围本文件描述了按照传统既是食品又是中药材的物质（简称食药物质）中T-2毒素（T-2）和HT-2毒素（HT-2）的液相色谱串联质谱检测方法。本文件适用于石斛、栀子、莲子、百合、薏苡仁、茯苓和麦芽中T-2毒素和HT-2毒素含量的测定，附录A内其余食药物质可参考执行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理采用乙腈水溶液提取试样中T-2毒素和HT-2毒素，分散固相萃取方法净化，液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂应均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。4.1 试剂4.1.1甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。4.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.1.4乙酸铵（CH3COONH4）：色谱纯。4.1.5氯化钠（NaCl）。4.1.6无水硫酸镁（MgSO4）。4.1.7二氧化硅（SiO2）。4.1.8N-丙基乙二胺（C5H14N2，PSA），4060 m。4.1.9C18吸附剂，4060 m。4.1.10石墨化碳黑（C，GCB），6080 m。4.2 溶液配制4.2.180%乙腈溶液：量取200 mL水加入到800 mL乙腈中，混匀。4.2.21 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）：称取0.077 g乙酸铵（4.1.4），加入1 mL甲酸（4.1.3），用水溶解并稀释至1000 mL，混匀。T/CIQA 51-202324.2.3甲醇-甲酸-水溶液（350.564.5，V/V/V）：量取 350 mL 甲醇，加入 5 mL 甲酸（4.1.3），用水稀释至 1000 mL，混匀。4.3 标准品4.3.1T-2标准品（C24H34O9，CAS：21259-20-1）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。4.3.2HT-2标准品（C22H32O8，CAS：26934-87-2）：纯度98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质4.4 标准溶液配制4.4.1标准储备液（1.0 mg/mL）：分别准确称取一定量的T-2毒素和HT-2毒素标准品，用乙腈溶解成1 mg/mL的标准储备液，-20 下避光保存。4.4.2标准工作液（1.0 g/mL）：分别准确移取一定量的T-2毒素和HT-2毒素标准储备液（4.4.1），用乙腈稀释成1 g/mL的标准工作液，4 下避光保存。4.4.3混合标准工作溶液：分别准确移取一定量的T-2毒素和HT-2毒素标准工作液（4.4.2），用甲醇-甲酸-水溶液（4.2.3）稀释，将T-2配制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的混合标准工作液，将HT-2配制成2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的混合标准工作液。4.4.4基质混合标准工作溶液：分别准确移取一定量的T-2毒素和HT-2毒素标准工作液（4.4.2），用基质空白溶液稀释，将T-2配制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的混合标准工作液，将HT-2配制成2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的混合标准工作液。5仪器和设备5.1液相色谱三重四级杆质谱联用仪：配有电喷雾离子源（ESI）。5.2分析天平：感量分别为0.01 g和0.000 01 g。5.3超声波发生器。5.4高速离心机：转速5 000 r/min。5.5恒温氮吹装置。5.6涡旋混合器。5.7粉碎机。5.81 mL一次性注射器。5.9滤膜：0.22 m，有机系。5.10离心管：50 mL。5.1120目筛。6试样制备与保存T/CIQA 51-20233从样品中取出具有代表性的样品1 kg，粉碎机粉碎混匀后过20目筛，装入洁净的自封袋中，密封，并标明标记，-20 下保存。7分析步骤7.1提取和净化称取20 g试样（精确到0.01 g），加入4 g氯化钠，再加入200 mL 80%乙腈（4.2.1），涡旋或振荡30s，超声波处理20 min，使用高速离心机8000 r/min离心5 min，取100 mL上清液用80%乙腈（4.2.1）定容至200 mL后取10 mL移至离心管中，分别按不同类型食药物质作如下处理。7.1.1石斛、栀子、莲子、百合、薏苡仁、麦芽的净化向上清液中加入MgSO4240 mg（4.1.6），SiO280 mg（4.1.7），PSA 80 mg（4.1.8），C18 80 mg（4.1.9），GCB 25 mg（4.1.10），涡旋或振荡1 min，8000 r/min离心5 min。7.1.2茯苓的净化向上清液中加入MgSO4240 mg（4.1.6），SiO280 mg（4.1.7），PSA 80 mg（4.1.8），C18 80 mg（4.1.9），涡旋或振荡1 min，8000 r/min离心5 min。分别取7.1.1和7.1.2中上清液5 mL，在40 条件下，用氮气吹干，加入1.0 mL甲醇-甲酸-水溶液（4.2.3），涡旋30 s溶解残留物，过0.22 m有机滤膜，收集滤液于进样瓶中，用液相色谱串联质谱法测定。7.2测定7.2.1液相色谱参考条件液相色谱参考条件列出如下：a)色谱柱：C18柱，（柱长100 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径2 m）或等效柱；b)流动相：A相为1 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）（4.2.2）；B相为甲醇（4.1.1）；c)流速：0.2 mL/min；d)进样量：5 L；e)柱温：40 f)梯度洗脱，洗脱程序见表 1。表 1 流动相梯度洗脱程序时间流动相A流动相B080%20%55%95%95%95%1080%20%T/CIQA 51-202341580%20%7.2.2质谱参考条件质谱参考条件列出如下：a)离子源：电喷雾离子源（ESI）；b)扫描方式：正离子；c)监测方式：多反应监测（MRM）；d)正离子模式检测条件：电喷雾电压：5 500 V；雾化气压力：70 Psi；气帘气压力：30 Psi；辅助气压力：60 Psi；离子源温度：600；其它质谱参数见表 2。表 2 待测物质谱参数化合物母离子/（m/z）子离子/（m/z）Q1 Pre偏差/V碰撞电压/VQ3 Pre偏差/V驻留时间/ms保留时间/minT-2毒素489.0245.0a-25-19-25-22-27-2429295.44326.9HT-2毒素447.1285.1a-22-17-20-48-22-2215155.14105.1a为定量子离子7.2.3 标准曲线的制作以标准工作溶液浓度为横坐标，待测物质的峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。每次试验均应重新绘制标准工作曲线。7.2.4 定性测定用高效液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定,在相同试验条件下,样品中应呈现定量离子对和定性离子对的色谱峰,被测物质的色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的色谱峰保留时间一致：样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表 3规定范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（k）k50%50%k20%20%k10%k10%T/CIQA 51-20235允许的最大偏差20%25（%）30（%）50（%）7.2.5定量测定按照 7.2.2 液相色谱串联质谱条件测定样液和标准工作液，外标标准曲线法测定样液中的待测物质的含量，样品中待测物质的响应值应在标准曲线范围之内，如果超出标准曲线范围，应适当稀释后再进样。色谱图参见附录 B。7.2.6空白试验除不加试样外，均按7.1和7.2步骤进行。8结果计算和表述T-2毒素和HT-2毒素的含量按式（1）计算：X cV1 000m1 000f（1）式中：X试样中待测物质的含量，单位为微克每千克（g/kg）；c从标准曲线上得到的待测物质的溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；1 000单位换算常数；m试样的质量，单位为克（g）；f稀释倍数。计算结果扣除空白值，检测测定结果以平行测定值的算术平均值表示，结果小数点后保留两位数字。9检出限及回收率9.1 灵敏度本方法的检出限：T-2毒素（T-2）为0.6 g/kg，HT-2毒素（HT-2）为3 g/kg。本方法的定量限：T-2毒素（T-2）为1.8 g/kg，HT-2毒素（HT-2）为9 g/kg。9.2 回收率本方法的添加浓度和平均回收率见附录C。T/CIQA 51-20236附录A（资料性附录）食药物质名单（110 种）丁香、八角、茴香、刀豆、小茴香、小蓟、山药、山楂、马齿苋、乌梢蛇、乌梅、木瓜、火麻仁、代代花、玉竹、甘草、白芷、白果、白扁豆、白扁豆花、龙眼肉（桂圆）、决明子、百合、肉豆蔻、肉桂、余甘子、佛手、杏仁、沙棘、芡实、花椒、红小豆、阿胶、鸡内金、麦芽、昆布、枣（大枣、黑枣、酸枣）、罗汉果、郁李仁、金银花、青果、鱼腥草、姜（生姜、干姜）、枳子、枸杞子、栀子、砂仁、胖大海、茯苓、香橼、香薷、桃仁、桑叶、桑葚、桔红、桔梗、益智仁、荷叶、莱菔子、莲子、高良姜、淡竹叶、淡豆豉、菊花、菊苣、黄芥子、黄精、紫苏、紫苏籽、葛根、黑芝麻、黑胡椒、槐米、槐花、蒲公英、蜂蜜、榧子、酸枣仁、鲜白茅根、鲜芦根、蝮蛇、橘皮、薄荷、薏苡仁、薤白、覆盆子、藿香、人参、山银花、芫荽、玫瑰花、松花粉、粉葛、布渣叶、夏枯草、当归、山奈、西红花、草果、姜黄、荜茇、党参、肉苁蓉、铁皮石斛、西洋参、黄芪、灵芝、天麻、山茱萸、杜仲叶。T/CIQA 51-20237附录B（资料性附录）标准品色谱图T-2标准品色谱图，见图B.1。图 B.1 T-2 总离子流图HT-2标准品色谱图，见图B.2。图 B.2 HT-2 总离子流图T/CIQA 51-20238附录C（资料性附录）T-2和HT-2平均回收率T-2和HT-2平均回收率见表C。表 C 平均回收率（n=3）样品基质T-2HT-2加标水平（g/kg）平均回收率（%）精密度（%）加标水平（g/kg）平均回收率（%）精密度（%）石斛0.675.33.8397.63.41.280.12.7687.82.1678.62.13089.60.7栀子0.699.52.0378.84.71.273.33.8680.51.3681.45.33075.32.9莲子0.688.34.2385.91.91.275.63.3676.63.0686.04.53093.31.7百合0.696.42.1377.53.81.272.62.9690.53.3686.31.73088.84.5薏苡仁0.690.42.8383.21.91.265.03.2680.25.6683.83.63091.94.2茯苓0.690.22.13101.44.01.286.83.46106.62.8680.60.930107.23.3麦芽0.688.61.23100.01.81.2105.72.8681.92.4683.65.53093.63.6石斛、栀子、莲子、百合、薏苡仁、茯苓、麦芽中T-2毒素（T-2）的加标水平为0.6、1.2、6 g/kg，平均回收率为65.0%105.7%，精密度为0.9%5.5%；HT-2毒素（HT-2）的加标水平为3、6、30 g/kg，平均回收率为75.3%107.2%，精密度为0.7%5.6%。