毕赤酵母植酸酶相关(1).doc

本 科 毕 业 论 文 第页 共页 毕赤酵母植酸酶相关目 录1 绪论11.1植酸与植酸酶11.2 植酸酶的分类31.3 植酸酶的来源41.4 植酸酶的基本酶学性质61.5 植酸酶的作用机理61.6 植酸酶的应用意义7第2章 植酸酶发酵过程主要影响因素研究92.1 试验材料112.2 试验方法112.3 试验结果与讨论142.4 本章小结25结 论26参考文献27致谢29本 科 毕 业 论 文 第31 页 共32页 1 绪论自从人类畜牧业产生以来，最大限度的发挥家畜的生产潜力和生产价值一直是生产者们和动物营养科学家们共同追求的目标，因此，在配置家畜饲料时，他们从来不考虑家畜营养物质和矿物元素的排泄量，而导致大量的营养物质和矿物元素随动物的粪便排出体外。在广大农村，分散而且低密度的圈养条件下，动物的排泄物是一种非常好的有机肥料，但随着畜牧业大力发展，畜牧业生产集约化的程度大幅度的提高，饲养密度和饲养规模急剧增加，必然导致在较小的面积上产生出大料的排泄物。这些排泄物不得到合理的分散和处理，便会对周围的环境造成严重的污染。猪鸡等家畜，由于是单胃动物，胃中缺乏植酸酶，对植物性饲料中的磷的利用率非常低，为满足单胃动物对磷的需求量，生产中不得不在饲料中添加大量的无机磷，结果大量的未消化的无机磷随动物粪便排泄稻周围环境中，对生态环境造成了很严重的威胁。目前，国内外大量的实验证明，在家畜的饲料中添加植酸酶可以提高家畜对磷的利用率，从而可以减少向环境中排放的磷。植酸酶是一种可作为饲料及食品添加剂的新型酶制剂，可以分解动物饲料中的植酸磷，释放出动物能直接吸收的利用的磷，可以有效减少单胃动物的排便中磷的含量，因此可以减少磷对环境的污染。在饲料中添加少量的植酸酶可以代替添加大量价格昂贵的无机磷酸钙，使饲料成本降低，而饲料的综合利用率提高。植酸酶还能消除植酸对多种金属离子的螯合作用，可以提高动物对植物蛋白和多种矿物元素的利用率以及植物性饲料的营养价值。植酸酶因其多方面的应用特点，植酸酶已成为饲料、医学、人类营养、食品工业、植物生理学和植物育种等领域关注的焦点。1.1植酸与植酸酶1.1.1 植酸磷是动植物的重要元素，作为一种必须的矿物元素在动植物营养中发挥着非常重要的作用磷是动植物核酸、核蛋白和磷脂的重要成分，并与蛋白质的合成、细胞的分裂、细胞的生长有着密切关系。磷是许多辅酶如NAD+、NADP+等的成分，也是ATP和ADP的成分。磷在机体内参与碳水化合物的代谢和运输，如在光合作用和呼吸作用的生理过程中，糖的合成、转化、降解大多数是在磷酸化以后才起反应的。磷对氮的代谢有重要作用，如硝酸还原有NAD和FAD的参与，而磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺则参与氨基酸的转化。磷还与脂肪转化有关，脂肪代谢需要NADPH、ATP、CoA和NAD+的参与。68%-80%的磷在植物性饲料中都是以植酸的方式存在1。植酸( phy tic acid, 简称PA) 又名肌醇六磷酸, 是维生素B 族的一种肌醇六磷酸酯, 化学名环己六醇- 1, 2, 3, 4, 5, 6- 六磷酸二氢酯。由1分子肌醇和6分子磷酸结合而成，分子式为C6H18024P6，通式为C6H6OP(OH)26分子量为660.8 。植酸广泛以植酸钙镁钾盐存在于植物种子内，是许多植物组织中磷的主要存在方式，占总磷的60%-90% 。植酸对大多数金属离子有极强的络合能力，络合能力与EDTA类似。植酸二价以上金属盐均可定性沉淀2。在饲料中，植物性的饲料含有约1% 4%的磷, 其中60% 80% 的磷通常是以植酸磷的形式稳定的存在于植酸盐复合物中, 这些矿物磷只有在植酸磷被分解游离的情况下才能供家畜吸收及利用, 单胃动物, 如猪和家禽消化道内缺乏植酸酶, 因而对磷的吸收率非常低。另外植酸不仅能够螯合Ca2+ 、Mg 2+ 、Zn2+ 、Fe2+ 等二价金属离子, 降低了矿物质在肠道中的吸收；植酸还能与蛋白质和氨基酸等螯合，抑制体内消化酶的酶活性。植酸的存在大大降低了蛋白质及脂肪物质等营养物质的消化和吸收，使多种微量元素和常量元素的利用率降低,降低了植物性饲料的整体生物作用。1.1.2 植酸酶植酸酶(phytase)，是催化植酸盐及植酸水解成为磷酸和肌醇的一类生物酶的总称，系统名称是肌醇六磷酸酶3，是特殊的酸性磷酸酶，是一种磷酸单脂水解酶，具有特殊的空间结构能水解植酸释放出肌醇和无机磷。在植物性的动物饲料中，大部分的磷酸盐是以植酸的形式存在的。而单胃动物缺少分解植酸的植酸酶。为了改良磷酸盐的生物利用度可以在植物性饲料中添加少量的异种植酸酶，减少植酸的抗营养作用；大量减少无机磷在环境中的排泄，由此可以降低农业生态对环境造成的负担，并且大大减缓了江，河，湖泊及海洋的富营养化；同时也大大减少了动物饲料对无机磷的添加量，然而无机磷是一种不可再生的矿物质资源。为保护环境目前欧洲十几个国家规定不添加植酸酶的饲料不准上市4。1.2 植酸酶的分类1.2.1 基于最适pH 和立体专一性的植酸酶分类植酸化学名为环己六醇- 1, 2, 3, 4, 5, 6- 六磷酸二氢酯5。因植酸分子的特殊立体构象, 植酸酶水解植酸时具有立体专一性，根据立体的专一性, 由国际纯粹与应用化学联合会-国际生物化学与分子生物学联合会(IUPAC-IUBMB)目前承认了三类常见的植酸酶（3-植酸酶、5-植酸酶和6-植酸酶）。3-植酸酶开始水解植酸时首先释放出C3 位磷酸基团, 随后逐渐释放其它的磷酸基团, 5-植酸酶和6-植酸酶分别从C5和C6位开始水解植酸。微生物和植物绝大多数分别产3-植酸酶以及6-植酸酶。最适PH是各种酶的基本属性之一，根据酶活性最适pH值不同，植酸酶也可大致分为两类：酸性植酸酶和碱性植酸酶，酸性植酸酶在pH值5.0左右具有较高活性，碱性植酸酶在pH值接近8.0的时候有较高活性。除了芽孢杆菌和百合花粉外，大部分的生物植酸酶和植物植酸酶都属于酸性植酸酶，为了适应畜禽的胃肠酸性环境, 酸性植酸酶一直受到研究者的青睐和开发，因此酸性植酸酶在饲料和人类食品的适用性中比碱性植酸酶更广泛的底物特异性而被广泛关注。1.2.2 基于结构和催化机理的植酸酶分类按结构的不同，可以将酸性植酸酶划分为有代表性的组氨酸酸性磷酸酶(HAP)-螺旋植酸酶（BPP），紫色酸性磷酸酶（PAP），半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CPhy)。 (1)组氨酸酸性磷酸酶（HAP）大多数知名的植酸酶都是HAP，这个类的所有成员都有一个共同的活性位点保守序列RHGXRXP和一个水解磷酸单脂的两步作用的机制。Wyss 和他的同事通过比较几种来源于真菌的植酸酶的水解的特性，提出了 2个类别的HAP 植酸酶：一类底物特异活性比较宽，但是特异活性对植酸的比较低；第二类底物比较窄特异活性，但是比较高特异活性对植酸。（2）- 螺旋植酸酶（BPP）与HAP不同，BPP是最近发现的一类有着特殊水解机制的酶。BPP基因已经从Bacillius subtili和 Bacillus amyloliquefaciens中获得。该分子的三维模型近似于有6个叶片螺旋的基本结构。搜索蛋白数据库，数据显示没有其它的目前已知的磷酸酶具有这种的结构。由于Ca2+的束缚，而具有特定热水解活性和稳定性。BPP有2个束缚位点的磷酸盐，对它的底物的水解出现在邻近的“亲和位点”和“剪切位点”， “亲和位点”加强了对底物亲和力。Ca2+创造了一个有利使束缚变得容易的静电环境。然而，目前与BPP对应的磷酸酶已知的没有，是否在其它的真菌或者细菌中发现还有待于确定。 (3) 紫色酸性植酸酶（PAP）已经从发芽的黄豆种子中分离出来了另一种植酸酶Gmphy。Gmphy 有着活性位点保守序列的紫色酸性磷酸酶。它的水解机制和三维结构已经非常明确了。对基因数据库搜索结果示，在植物，哺乳动物，真菌和细菌中显示了类似于PAP的序列。纯化的Gmphy 的大小估计在7072kda，和其它植物来源的PAP 的分子大小相近。但是Gmphy 是仅知已报道的有较高植酸酶的活性的PAP。（4）半胱氨酸磷酸酶植酸酶(CPhy)目前发现仅存于瘤胃微生物含有半胱氨酸磷酸酶植酸酶。单胃动物因体内缺乏内源性植酸酶所以不能利用植酸。调查厌氧瘤胃微生物时，Yanke 等首先发现一株S. ruminantium 具有植酸酶活性。经过研究表明是一个单体蛋白的植酸酶, 约为46 kD, 最为适应的pH 4.04.5, 最为适应的温度50C55C, 受铁离子等离子的抑制，随后的研究催化机理和蛋白晶体结构揭示这个植酸酶既不属于- 螺旋植酸酶也不属于组氨酸酸性磷酸酶,而是半胱氨酸磷酸酶植酸酶超家族的一种, 它的推断氨基酸序列包含活性部位基元HCXXGXXR (T/S), 并且与半胱氨酸磷酸酶植酸酶类群的成员蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosinephosphatase, PTP)具有显着相似性。瘤胃微生物是生活在反刍动物胃肠的一类有益共生菌, 所分泌的植酸酶和纤维素酶等在反刍动物的营养利用中起重要作用。Hong 等利用S. ruminantium植酸酶基因SrPf6 构建的转基因水稻, 其萌发种子在pH 2.06.0 时的植酸酶活性是非转化子的4060 倍, 这为单胃动物饲料开发开辟了新的思路。1.3 植酸酶的来源植酸酶在自然界分布非常广泛，它广泛存在于动物植物组织中，也存在于微生物（细菌，真菌和酵母）。1.3.1 植物植酸酶最早发现的植酸酶是在植物中，大多存在于花粉和种子中，其活性因为种类的差别而又很大不同。如在豆类，谷类，和油料作物，其活力一般都比较低。种子中的植酸酶把植酸磷水解分为无机磷酸盐和肌醇，为种子的发芽及幼苗的生长提供了必要的营养物质。植酸酶最早是在1907年在植物中发现的，因此早期的研究都集中在植物和动物器官上。植物植酸酶分为两种，大部分的植物植酸酶是从肌醇的第六位碳点上开始水解，因此是6-植酸酶，一般存在于植物种子中；另一种存在于植物的组织中，为3-植酸酶。目前已知可从多种植物中分离出植酸酶。1.3.2 动物植酸酶动物植酸酶存在于哺乳动物的红血球和血浆原生质中。但一般而言，动物植酸酶含量较少而且活性低，多胃动物瘤胃微中生物可生产植酸酶，因此可利用植酸盐，单胃动物则难以利用植酸盐。1.3.3 微生物植酸酶微生物来源的植酸酶，1968年，Shine等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所得的22株黑曲霉中有21株能产生植酸酶，确定第一个被分离纯化的植酸酶来源于土曲霉。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶。微生物植酸酶活性最强的是真菌,特别是Aspergilli 属的真菌。由于动物植酸酶含量非常低，然而植物植酸酶在加工、贮藏等过程中结构易被破坏，而且难以提纯；微生物植酸酶作用范围广泛，较为稳定，规模化生产简单，因此，近几年的研究都集中于微生物植酸酶。产植酸酶的微生物有丝状真菌、酵母和细菌等。就商业化生产植酸酶而言，微生物是最有前景的7。目前，用微生物产植酸酶的工艺主要有固体发酵(sSF) 和液体发酵(sMF) 两种。抉择某一种特定生产工艺时应考虑底物特性、营养素的利用率等、培养条件以及菌株类型因素，这些都是影响发酵产量的重要因素。Stockmann 等报道了在限制氧气的条件下由多形汉逊酵母经液体发酵生产植酸酶，研究数据发现，以葡萄糖作为培养基预先培养菌株在限制氧气的条件下， 使植酸酶的产量提高了大约25%，而且消除了大约20h的发酵延滞期，然而在没有限制氧气条件下通常是存在延滞期的。已有3 种不同的方法可以利用无花果曲霉生产植酸酶，即液体发酵、半固体发酵和固体发酵。但因液态发酵植酸酶生产成本比较高，投产不易。所以我国多采用固态发酵方法。韩建春等用紫外线和EB的复合诱变方法获得植酸酶高产菌AS3.430912作为发酵菌株，并以玉米面和麸皮作为培养基，摸索出了固态发酵生产植酸酶的最佳工艺条件为：发酵温度30，玉米面和麸皮比例4：6，最初pH5，培养基水分51.3，液体种子接种量5，发酵时间108 h。张继英以MR020为试验菌株，研究了产植酸酶活力较高的固体培养基配方，最佳条件为：以麸皮为基本培养基，添5%的蛋白胨，0.2%NH4Cl、0.01% FeS04、0.07%MgS04 组成的培养基在相同条件下产酶活力较高，该菌种在此培养基上培养4.5d (108 h)时达到产酶高峰。华南热带农业大学的科研人员通过研究，掌握了以木薯为原料固态发酵生产植酸酶的最佳发酵条件、产品的使用及保存性能、植酸酶的最适作用条件等，为植酸酶的工业化生产及应用提供了科学的依据。1.4 植酸酶的基本酶学性质植酸酶它广泛存在于微生物和植物中，是一种糖蛋白，因有不同来源，它们的糖基化程度、最适pH 值、等电点、氨基酸组成、Km 值、分子量、热稳定性、底物专一性等有一定差异。1.5 植酸酶的作用机理 植酸酶能够将肌醇六磷酸(植酸)分解成为磷酸和肌醇。它将逐个切下植酸分子上的磷酸基团，水解成中间产物IP5，IP4，IP3，IP,最终产物为磷酸和肌醇6。因为植酸酶来源不同所以其作用机理不同。微生物的植酸酶水解植酸时，首先从植酸的第3碳位点开始水解植酸酯键而释放无机磷，其它碳位点的磷依次被释放，整个植酸分子最终酯解，3-植酸酶需要Mg2+参加催化过程。植物来源的6-植酸酶，它首先从第6位碳位点开始催化植酸水解为无机磷。1g植酸完全分解理论上可释放出磷2816mg。植酸酶只能将植酸分解为肌醇磷酸酯，而不能完全分解成磷酸和肌醇，在酸性磷酸酶的帮助下可以将肌醇磷酸酯彻底分解，二磷酸酯、单磷酸酯在酸性磷酸酶的分解下可以彻底分解成磷酸和肌醇。1.6 植酸酶的应用意义1.6.1 减少磷排放，保护生态环境单胃动物的消化系统缺乏或更少的植酸酶，无法有效地利用植酸而导致动物粪便排放大量的植酸，大量的水和土壤中的微生物分解植酸在水中释放的无机磷，以及在日粮中大量的无机磷的添加，水中磷超负荷。磷是水生植物生长的最重要因素的限制营养。入水中大量的磷刺激藻类和其他地表水植物的生长，随后，大量的水生植物坏死，导致淡水水质恶化，水中的氧气含量低，危及鱼类的生存和其他野生动物，从而破坏了生态环境，特别是养殖区密集的地方磷污染的更为突出。植酸酶可以有效地防止水的磷污染。植酸酶有助于降低单胃动物饲料中的植酸分解，释放无机磷，以充分满足动物生长需要磷，饲料加工，没有必要添加无机磷，从而大大减少磷排放入水中，以防止磷污染，保护生态环境。例如，植酸酶混合鸡饮食，小鸡增长超过60的植酸磷的吸收和利用，其排放量减少约50;植酸酶喂养鱼，猪和其他测试也取得了相同的结果。据在美国的调查显示：美国单胃动物饲料中所有的植酸酶，美国全年减少8.23107公斤的磷进入生态环境，不仅有效地保护生态环境，唯一的植酸从饲料中无机磷值168万美元释放植酸的酶降解。中国是一个人口大国，水产养殖发展的重大植酸酶的合理应用。1.6.2 减轻江河、水域等环境污染。中国的河流，水体污染十分严重，关键是污染水体中氮和磷超过每年多达250万t从动物粪便中磷的排放，是在水体富营养化的罪魁祸首之一。大量的实验研究表明，植酸酶补充饮食可以使粪磷排泄量下降50左右，但通过外源磷的添加或提高饲料转化率只能使磷的排泄量减少10，吴东 等采用AA肉雏鸡分5 个处理进行试验证明，在水平一致总磷、有效磷的情况下，随着日粮中植酸磷水平的递增, 而磷的排泄量递减，我国每年的磷排放量因此可以减少约180万吨，将大大缓解磷污染水体1.6.3 消除植酸的螯合作用，提高食物的营养价值人类和动物所需的营养成分可分为有机养分和无机养分。后者少，只占4至5的体重，但种类很多, 功能各不相同，且都具有非常重要的生理功能。如骨形成，维持体液，酶和辅酶的活性，都不能离开无机盐，如缺铁易患贫血，缺钙易患骨质疏松症，消除植酸其螯合作用，食物还有丰富的无机盐，其螯合作用将大大减少二价和三价阳离子和蛋白质的生物利用度。加植酸酶，可以消除此其螯合作用，从而提高无机营养盐的生物利用度。 2单独使用或与木聚糖酶和葡聚糖酶的组合，可以提高小麦的营养价值。牛饲料中添加有植酸酶，可减少乳牛胃内胺基氮，从而增加了挥发性脂肪酸，牛奶产量和质量提高很多。1.6.4 提高蛋白质、氨基酸的利用率酸与某些蛋白质相结合，阻碍蛋白质水解，植酸与蛋白质结合与pH值有很大的关系。当pH值低于蛋白质等电点，植酸的磷酸基团和蛋白质的阳离子基团结合，形成二元蛋白- 植酸复合物，可溶但只有当pH值低于3.5。这些化合物可影响酶的活性，蛋白质溶解度和蛋白质的消化率。体外研究表明，多种因素影响植酸与蛋白质结合的程度，包括pH值，蛋白质溶解度及来源和钙的水平和饮食中的镁。植酸对蛋白质的抑制作用，可能是因为蛋白质- 植酸非特定性Ca2+螯合作用，从而影响胰岛素和-淀粉酶活性，对蛋白酶活性的影响也降低了蛋白质的吸收率的原因。植酸酶水解，释放蛋白复合物，使消化利用率提高。添加微生物植酸酶到饲料后，不仅使蛋白质和缬氨酸，赖氨酸，苏氨酸，色氨酸，精氨酸，组氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸和亮氨酸表观消化率分别增加9至128。1.6.5 提高矿物元素的利用率植酸酶在饲料和食品中的存在是不利于吸收和利用其中的矿物质元素的，包括锌，钙，镁，锰，铜等。植酸与下列离子形成复合物的稳定性依次减弱：Zn2+的，Cu2+，Ni2+，CO2+，Mn2+，Ca2+。因此，植酸，影响最大的是锌矿物元素的利用率。植酸的存在可降低主食植物性食物的人群对Zn2+的吸收和稳态，可导致侏儒症和性腺功能低下症。 pH值是一个重要的因素，在低pH值的植酸溶解度的溶解度是优于在较高的pH值的溶解度。Ca2+、Cd2+、Zn2+和Cu2+植酸盐在pH值小于4到5可以溶解，但植酸镁在酸性pH值到pH7.5的可以溶解。1.6.6 提高能量利用率植酸和脂肪酸钙镁聚合成脂肪酸盐，也可以直接或间接地，结合淀粉，同时抑制-淀粉酶的活性，从而限制了淀粉的利用率，减少牲畜使用这些能量物质。Brady报道不同水平添加量的植酸酶在日常饮食可以提高能源利用的物质，添加1000FTU/kg植酸酶时提高能源利用水平6.3，另外植酸酶添加脂肪厚度。Johnston等向不同钙磷水平的日粮中添加植酸酶可以促进能量代谢。以上表明，植酸酶添加的饲料和食品，可以极大地提高利用率，磷，蛋白质，矿物质，营养元素和能量。1.7.2 高密度发酵高密度发酵也称为高密度发酵技术，是一种高效表达外源蛋白表达水平的重要战略。该方法大大提高了发酵过程，发酵周期可缩短一半以上，菌体生产和产品表达提高1050倍，蛋白活性增加2至3倍9，并能降低培养容器的体积，降低了设备投资，从而减少了生产成本，大大提高了产品在市场上的竞争力10。现在，有许多蛋白质高密度发酵，获得高表达水平，如巴西三胶腈水解酶表达水平到22克/ L11，植酸酶表达达12.2 g / L12等。不同品系和不同菌株之间，以实现高密度水平有很大的不同，不同的外源蛋白表达水平的差异很大，造成这种差异的重要因素有两个，一个是基因工程菌自身特点有差异的，二是发酵。因此，想要在生物反应器中以最大限度地得到的目标蛋白，必须对发酵过程进行研究，探索产品生产的影响因素，确定最佳发酵条件。第2章 植酸酶发酵过程主要影响因素研究目前，基因工程受到了越来越多的关注，基因工程产品从实验室到车间，实现了产业化，主要问题是如何最大限度地提高高产基因工程菌发酵。许多因素可影响发酵产量，这些因素可以被划分为内部因素和外部因素，内部因素为工程菌的特性，包括选则基因密码子外对外源蛋白的驱动性，外源蛋白的自身特点，在毕赤酵母融合基因组外源基因;外部因素，主要指的是基因工程菌发酵条件，包括培养基成分的选择和种子种龄和接种量，生长和发酵过程中的pH值和甲醇添加量等。种子质量：在工程菌在发酵过程中，毕赤酵母菌种的培养是一个极其重要的组成部分。接种的菌种质量，在很大程度上决定了工程菌发酵过程中细胞的生长的速度和合成目标产品的产量。种龄，是指种子生长年龄，就是多久才能做种。种龄太短，用于接种种子仍然处于滞后阶段，或者刚刚进入对数生长期，会导致早期细胞生长缓慢，发酵周期延长，甚至可能导致异常发酵。种龄太长，在稳定期后期的或衰亡阶段的种子，接种后会导致后代的延滞阶段增长，因此选择适当的年龄接种是非常重要的。一般选择对数生长期后期或刚进入稳定的种子细菌，这时候整体的生理特点大多一致，菌体生长快，可以很快适应新的环境，并能提高细胞干重。接种量：接种量不同也会影响发酵率，接种较少的菌体生长缓慢，最终导致滞后期太久，发酵周期的增加，接种细胞过多，生长过于强烈，导致过多的代谢物可能会影响细胞的生长，而且对养分和氧气的需求增加，如果氧气不足，会导致对培养基的利用率下降。选择合适的接种量，不仅缩短生长期，节约电耗，同时也提高了设备利用率。pH值：菌体的生长阶段或诱导表达目标蛋白的的阶段，pH值是非常重要的影响因素。毕赤酵母中生长pH值从3.0到7.0都可以，范围广泛，但在极酸性（pH 2.2）条件下细胞停止生长，最适生长的pH值范围是5.06.0。谢子文对毕赤酵母发酵产植酸酶的条件进行摇瓶实验研究发现，细胞的生长阶段的最适pH值为5.0，诱导生产阶段酶的最适pH值为5.5 。温度：毕赤酵母培养温度对生长和产酶有很大的影响，培养温度过低，不利于细菌生长，从而导致较低的产酶，培养温度过高，容易导致活性物质在细胞变性，微生物的新陈代谢和循环，起到一个非常严重的负面影响。甲醇添加量：毕赤酵母中含有AXO1独特的醇氧化酶基因启动子，在诱导期，甲醇作为酵母生长唯一碳源和的能量来源，诱导AXO1对外源基因表达的调控，因此，添加甲醇的量要满足酵母生长的需要，但过量甲醇会导致细胞生长抑制，因此，在实验过程中，要严格控制甲醇添加量，满足毕赤酵母对甲醇的需求，同时不影响细胞的生长。培养时间：培养时间对细胞的生长和产酶的诱导时间有很大的影响，因此选择一个合适的发酵周期也很重要。大多数报道的诱导时间约160h，外源基因的表达量最高，有一些细菌甚至需要培养超过200h。培养时间太短，目标蛋白表达量过低，培养时间长，外源蛋白的降解会增加，因此，选择适当的培养时间是高密度发酵的一个非常重要的方面。2.1 试验材料2.1.1 菌种用于实验的菌种是由本实验室保存的植酸酶毕赤酵母基因工程菌。2.1.2 主要试剂甲醇氨水盐酸山梨糖醇2.1.3 主要仪器主要仪器PHS-25型pH计SW-CJ-IBV型单人超净工作台OL-5低速大容量离心机TZ-2H型台式恒温振荡培养TU-1810型紫外可见分光光度计JJ-2型组织捣碎匀浆机DZKW-D水浴锅发酵罐2.2 试验方法2.2.1 测定方法2.2.1.1 测定菌体浓度方法本实验采用分光光度计比色法测定细胞浓度，将培养液稀释到一定倍数，测定波长600nm处吸光值。2.2.2 菌体摇瓶培养条件研究本节主要研究植酸酶工程菌菌种接种量的量，菌种的不同种龄，基因工程菌生长阶段的培养基pH值，诱导阶段pH，甲醇补充量，补加的时间间隔，诱导时间和诱导阶段，添加山梨糖醇 - 甲醇为混合碳源研究和筛选，以确定摇瓶阶段最佳的生长和诱导条件。2.2.2.1 接种菌种量的确定以50 mL麦芽汁-麦麸为培养基中分别接种1，3，5，7，9接种优质菌种，在22小时培养，离心机离心弃去上清，加入25ml消过毒的麦汁 - 麦麸培养基重新悬浮，甲醇的每天添加量为1.8mL，每24小时在添加1.8ml，诱导时间为72小时，诱导过后发酵结束取发酵生产的植酸酶的酶的活性。2.2.2.2 种龄 将基因工程菌接种到20ML麦汁环 - 麸皮的生长培养基中。抽样8个时间点（12h，14h，16h，18h，20h，22h，24h，26h）进行细胞浓度的测定，并绘制细胞生长曲线。分别在培养16h，18h，20h，22h，24h，26h时，以5的接种量接种到50毫升麦芽 - 麸皮培养基，培养22小时，离心机离心弃去上清液，加入25毫升的麦汁 - 麸皮高温提取的培养基到离心得到的沉淀种并重新悬浮，每天甲醇的添加量1.8mL不变，每24小时后的额外添加1.8ml甲醇，诱导72小时后取样测定发酵的植酸酶活性。2.2.2.3 在生长阶段培养基pH的确定把五份ph调为4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,的50mL的麦芽汁-麦麸生长培养基于121灭菌20分钟，备用。接种适量的优质菌种，培养22小时。然后离心机离心弃去上清，加入25毫升的麦芽 - 麸皮培养基到离心好的沉淀理并重新悬浮细胞，每天添加甲醇1.8mL，每过24小时再添加一次甲醇，诱导72小时，结束后取培养液测定生产植酸酶活性。成长阶段的第一个22小时，每隔4h将pH值校准一次。在诱导阶段所需的培养基pH：将麦芽汁-麦麸生长培养基每50毫升分别装乳五只三角瓶，接种最适量优质的菌种培养22小时，离心机离心后弃去上清液，留下菌体，在三角瓶加入25mL的pH值为5.0,5.5,6.0,6.5,7.0的麦芽汁-麦麸生长培养基，重新悬浮，每天添加甲醇1.8mL，每过24小时再添加一次甲醇，诱导72小时，结束后取培养液测定生产植酸酶活性。成长阶段的每6小时将pH值校准一次。2.2.2.4 甲醇添加量和补加间隔时间分别将50毫升麦芽汁-麦麸生长培养基放入250mL的烧瓶中，接种适量的优质菌种，培养22小时。然后离心机离心弃去上清，装25毫升最适宜的pH值的麦芽汁-麦麸高温浸提培养基，将菌体重新悬浮。甲醇，添加为0.6毫升/天，1.2毫升/天，1.8毫升/天，2.4毫升/天，3.0毫升/天，额外每间隔为12小时，24小时添加一次。诱导后72小时测定菌液浓度和测定发酵液中植酸酶活性。2.2.2.5 使用山梨醇-甲醇混合碳源进行诱导探讨25的山梨醇和甲醇的比例（V / V）（分别为1:2,1:4,1:6,1:8,1:10，山梨糖醇 - 甲醇混合碳源对产酶和诱导时间的影响。对生产酶的影响：将麦芽汁-麦麸调好最适应的ph值加入到250mL的烧瓶中，接种适量的优质菌种，培养22小时，离心机离心后弃去上清，装入25毫升的最适应ph值的 - 麸皮培养基，细菌培养基重新悬浮，添加甲醇作为唯一碳源，诱导72小时后测定酶的活性。对照组仍然是用甲醇作为唯一的碳源。使用山梨醇-甲醇混合碳源对诱导时间的影响：向50毫升的麦汁 - 麦麸的生长培养基中接种适量的优质菌种，培养22小时后离心机离心弃去上清液，加入25 mL麦汁-麦麸培养基，重新悬浮于培养基，分别由甲醇单碳源和甲醇-山梨醇混合碳源诱导细菌，恒定剂量24mL/天，分别为12小时，24小时，36小时，48小时，60小时，72小时，84小时进行诱导，诱导完毕后取培养基样测定植酸酶活性。2.3 试验结果与讨论2.3.1 菌体摇瓶培养条件研究2.3.1.1 种龄此次研究各种接种种龄，对细胞的生长和诱导产酶的影响。在测试过程中，12h26h每2h取细胞浓度的采样测定，根据毕赤酵母生长数据绘制的的细菌的生长曲线，如图2-1所示。图2-1 种子生长曲线Fig.2-1 Growth curve of yeast seed图2-1显示，在毕赤酵母生长前22小时，细胞的生长旺盛，繁殖迅速，现在为对数生长期，在对数生长期细胞浓度的状态。培养22小时，细胞浓度达到一个高峰，然后进入了一个稳定的时期，正增长和负增长，在一个动态的平衡，生长速率常数R是几乎为零，反映了细胞浓度的上升。适合作为种子为生长20小时或22小时的细菌，下面进一步验证。此次研究分析不同菌种种龄对发酵产植酸酶的影响，分别采取各种不同种龄的生长20小时的菌种接种，产酶，诱导酶的活性测定后，前后种子。这个实验中，6个平行实验，选择种子的年龄，分别为16小时，18小时，20小时，22小时，24小时。结果如图2-2所示。图2-2 种龄对酶活的影响Fig.2-2 The effect of seed age on phytase activity图2-2显示了最大的种子年龄为20h时，最终发酵液的酶的活性最高。种子的年龄超过20小时，种子的菌体浓度很小，生长的滞后期长，诱导接种的细胞浓度不够，酶的活性低的直接结果，菌种种龄超过20小时后，接种后延滞。导致过早到达稳定阶段和衰退阶段，甚至菌体自溶，影响最终产酶，活性较低。因此，选择毕赤酵母接种最佳种龄为20小时。2.3.1.2 接种量此次实验研究了接种量对细胞的生长和表达产酶的影响，分别采取不同的液体菌种的接种量，对发酵后的细胞浓度和酶的活性进行测定。此次实验所选定的1，3，5，7，9进行平行试验。结果如图2-3所示。图2-3 接种量对菌体生长和酶活的影响Fig.2-3 The effect of inoculations quantity on yeast growth我们从图2-3可以看到结果，在不到9的接种量时，发酵候的细胞浓度随着接种量的增加而上升，毕赤酵母长势良好，因此可以发现，接种量数量的多少影响最后的细胞浓度。活力曲线显示，接种是5时，发酵候植酸酶活性最高，高于或低于5，酶的活性下降，因此确定为5为最好的接种量2.3.1.3 培养基pH在细胞生长阶段，培养基的pH值分别为4.5,5.0,5.5,6.0,6.5的平行实验，培养22小时，对细胞浓度测定，诱导完成后对植酸酶活性进行测定，结果如图2-4所示。图2-4 生长阶段pH对菌体浓度和酶活的影响Fig.2-4 The effect of pH on yeast concentration and phytase activity at growth phase图2-4结果表明生长阶段时处于pH值5.5时，培养22小时后的细胞浓度最高，细胞生长活跃，低于或高于5.5的pH值时，细胞浓度降低。对于最终的发酵液的pH值范围在4.5至6.0阶段，植酸酶的活性随着pH值的增加而增长活动的增加，当pH值6.5是酶活性最大。这表明，对于此次试验的工程菌来说，细胞生长和诱导产酶的最适pH值的最佳pH值是不一致的。在这种情况下，处于生长发育阶段，调节pH值5.5，因此，这种细菌是完全生长诱导期可适当增加，以确保高发酵液中的活性，因此，确定的生长培养基的最适pH值为5.5。将麦芽汁-麦麸培养基pH值分别调整为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0在诱导阶段做平行试验，诱导完成后测定菌体浓度和植酸酶的酶活性，结果如图2-5所示。图2-5 诱导阶段pH对菌体生长和酶活的影响Fig.2-5 The effect of pH on yeast concentration and phytase growth at inducing phase图4-5结果表明，细胞浓度在pH值为5.5最高，此时细胞生长和最适pH值为5.0。诱导时培养基pH值为6.0，此时拥有最高的植酸酶活性，pH值低于或高于6.0时，都会降低酶的活性，所以诱导时培养基的最适pH值为6.0。图2-4和图2-5都显示了细菌的最适生长pH值和最佳产酶pH值的是不一致的，因为毕赤酵母的次生代谢产物是植酸酶，而生产次生代谢产物和细胞生长的并不一起进行。次级代谢物为一些微生物生长到稳定期左右才产生的，构造简单，复杂的次生代谢途径产生大量的各种产生结构复杂的化学物。与初级代谢产物相比有所不同，次生代谢产物不是菌体的生长和繁殖所必需的，一般次生代谢产物生产对自己的生命活动没有一个明确的功能。次生代谢产物，稳定期左右才被合成，一般被分为两个不同时期，细菌的生长阶段和次生代谢产物阶段。2.3.1.4 甲醇添加量和补加间隔时间醇氧化酶（AOX1）启动子强烈调控植酸酶在毕赤酵母中的合成，甲醇是AOX1的诱导剂，甲醇添加的多少对酶制剂生产上的意义和影响力重大。此次试验研究了细胞的生长和诱导产酶与甲醇含量的影响。选择每日剂量为0.6毫升/天，1.2毫升/天，1.8毫升/天，2.4毫升/天，3.0毫升/天，5个不同添加水平，再次补充的时间间隔分别为12h和24h。此外甲醇的量和补加时间间隔对细胞生长的影响，分别在图2-6所示。图2-6 甲醇添加量对菌体生长的影响Fig.2-6 The effect of methanol addition on yeast growth 由图2-6显示，从甲醇再次添加的时间间隔的角度来看，时间间隔为12h显着高于间隔24小时。当甲醇用量0.6毫升/天到2.4mL/天，无论间隔12 h或间隔24 h额外添加甲醇，细胞浓度增加与甲醇量的增加成正比，但甲醇增加到大于2.4毫升/天时，细胞浓度降低。因此，我们可以看到，工程菌对甲醇的最大耐受剂量为2.4mL/天。在诱导期，甲醇作为唯一碳源对细胞的生长和诱导细菌产酶提供能量。添加甲醇，细胞的生长繁殖以甲醇作为碳源，并合成植酸酶。然而，当甲醇浓度过高，会抑制细胞生长。因此，当甲醇的量继续增加，细胞浓度但有下降趋势。在图2-7所示，时间间隔与甲醇量对酶的活性的影响。图2-7 甲醇添加量对酶活的影响Fig.2-7 The effect of methanol addition on phytase activity如图2-7所示，当甲醇用量0.6毫升/天到2.4毫升/天，不管间隔12小时或间隔24小时额外添加的甲醇，甲醇量的增加也增加了酶的活性，但是当甲醇大于2.4mL/天时，酶的活性开始下降。从时间间隔来看，额外添加甲醇的时间间隔12h明显比间隔24小时要好。综合图2-6和图2-7显示了甲醇的量最大为2.4mL/天，添加甲醇的量大于2.4mL/天时，过量甲醇会抑制细菌生长。因此，甲醇选择加入2.4mL/天，12小时的额外添加时间。2.3.1.5 使用山梨醇-甲醇混合碳源诱导本次测试使用山梨醇- 甲醇混合碳源代替甲醇单一碳源，诱导毕赤酵母，研究诱导时间对酶活性的影响。 25的山梨醇和100甲醇比为1:8,1:6,1:4,1:2对照组不添加甲醇。山梨醇 - 甲醇混合碳源时酶的活性，结果如图2-8所示。图2-8 山梨醇-甲醇混合碳源对产酶的影响Fig.2-8 The effect of sorbitol-methanol mixed carbon sources on the production of phytase我们可以从图2-8中看到的结果，与对照组酶的活性相比，添加山梨糖醇后酶的活性较高，山梨醇和甲醇比为1:6时，酶的活性增加12.7。山梨醇和甲醇以1:2,1:4的酶的活性与1:6无异，酶的活性几乎没有差别，因此，基于成本的考虑，25的山梨醇和100甲醇之比1：6。这项研究是甲醇唯一碳源和山梨醇 - 甲醇混合碳源诱导工程菌，混合碳源25山梨醇与100的甲醇的比例为1:6。每12h对植酸酶活性测定，结果显示在图2-9和图2-10所示。图2-9 甲醇单一碳源诱导曲线Fig.2-9 Induction curve of useing methanol as single carbon source图2-10 山梨醇-甲醇混合碳源诱导曲线