环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p_IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究.pdf

第 45卷 第2期2024 年 3月Vol.45 No.2March 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p/IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究梁俣1，胡志琴2，温艺红3，伍华燕3，王娅3，刘宇鹏1，单志新4，方咸宏1（1.广东省心血管病研究所/南方医科大学附属广东省人民医院/广东省医学科学院 广东 广州 510080；2.广州医科大学附属第五医院药学部，广东 广州 510799；3.华南理工大学医学院，广东 广州 510006；4.广东省临床药理学重点实验室/南方医科大学附属广东省人民医院/广东省医学科学院 广东广州 510080）摘要：【目的】研究环形 RNA circ_0120051对心肌成纤维细胞的纤维化表型的调控作用和机制。【方法】通过实时萤光定量PCR（RT-qPCR）检测健康器官捐献者（n=24）与心力衰竭（HF）病人（n=21）心肌标本中 circ_0120051及其宿主基因溶质载体家族 8 成员 A1（SLC8A1）的表达水平。核糖核酸外切酶（RNase R）消化实验鉴定 circ_0120051 的 RNA 稳定性。RT-qPCR 检测 circ_0120051 在人心肌细胞 AC16 中的核质分布情况。利用腺病毒在C57BL/6 乳小鼠心肌成纤维细胞（mCFs）中过表达 circ_0120051，通过 RT-qPCR 和 Western blot 检测过表达 circ_0120051对mCFs中纤维化相关基因表达的影响，利用细胞划痕实验检测对mCFs迁移能力的影响。通过RNA免疫共沉淀技术（RIP）验证circ_0120051与miR-144-3p间的结合作用，利用双萤光素酶报告基因实验鉴定miR-144-3p与靶基因异柠檬酸脱氢酶2（Idh2）3-UTR的结合位点。【结果】Circ_0120051在心衰病人心肌中表达显著增加，而其宿主基因SLC8A1表达无显著差异。Circ_0120051主要定位于人心肌细胞的胞质中。RNase R消化实验证实circ_0120051相对于线性SLC8A1 mRNA具有典型的环状RNA稳定性。过表达circ_0120051可抑制mCFs中纤维化相关基因表达和mCFs的迁移能力。RIP实验证实circ_0120051与miR-144-3p之间具有明显结合作用。在mCFs中转染miR-144-3p可促进纤维化相关基因的表达，并有效逆转circ_0120051对mCFs纤维化表型的抑制作用。双萤光素酶报告基因实验证实miR-144-3p与Idh2的3-UTR存在结合作用。miR-144-3p可在转录水平抑制mCFs中Idh2表达，而过表达circ_0120051可增加mCFs中IDH2表达。在mCFs中转染miR-144-3p和Idh2的小干扰RNA（siRNA），可一致性地逆转circ_0120051对纤维化相关基因表达和mCFs迁移的抑制作用。【结论】Circ_0120051通过特异结合miR-144-3p并增加其靶基因IDH2表达来发挥抑制mCFs纤维化表型的作用。关键词：心肌纤维化；环状RNA；微RNA；Circ_0120051；心肌成纤维细胞中图分类号：R363.2 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）02-0196-10DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240305.004CircRNA Circ_0120051 Inhibits the Fibrotic Phenotype of Myocardial Fibroblasts via Targeting miR-144-3p/IDH2 AxisLIANG Yu1，HU Zhiqin2，WEN Yihong3，WU Huayan3，WNAG Ya3，LIU Yupeng1，SHAN Zhixin4，FANG Xianhong1（1.Guangdong Cardiovascular Institute/Guangdong Provincial People s Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510080，China；2.Department of Pharmacy，The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong 510799，China；3.School of Medicine，South China University 收稿日期：2023-12-20 录用日期：2024-02-22基金项目：国家自然科学基金（82070254，82200325）；广东省自然科学基金（2023A1515010201，2021A1515220122）；广州市科技计划项目（202201011627，202102080093）；广东省医院药师青年托举研究基金（晴粤药学基金）（2023QNTJ16）作者简介：梁俣，第一作者，研究方向：心肌纤维化的分子机制，E-mail：；单志新，通信作者，研究员，博士生导师，研究方向：心肌重构和心肌保护，E-mail：；方咸宏，通信作者，主任医师，硕士生导师，研究方向：心肌重构的治疗研究，E-mail： 基础研究 第2期梁俣，等.环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p/IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究of Technology，Guangzhou 510006，China；4.Guangdong Provincial Key Laboratory of Clinical Pharmacology/Guangdong Provincial People s Hospital/Guangdong Academy of Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou 510080，China）Correspondence to：SHAN Zhixin，E-mail：；FANG Xianhong，E-mail：Abstract：【Objective】To investigate the regulatory effect of circular RNA circ_0120051 on the fibrotic phenotype of cardiac fibroblasts and the potential mechanism involved.【Methods】The expression of circ_0120051 and its host gene of solute carrier family 8 member A1（SLC8A1）mRNA in the myocardium of healthy organ donors（n=24）and heart failure（HF）patients（n=21）were assessed by real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-qPCR）assay.RNA stability of circ_0120051 was identified by RNase R exonuclease digestion assay.The cytoplasmic and nuclear distribution of circ_0120051 in human cardiomyocyte AC16 was detected by RT-qPCR assay.The expression of fibrosis-related genes in mouse cardiac fibroblasts（mCFs）with adenovirus-mediated overexpression of circ_0120051 was detected by RT-qPCR and Western blot assay，respectively.The effect of overexpression of circ_0120051 on the migration activity of mCFs was evaluated by wound-healing assay.RNA co-immunoprecipitation（RIP）was conducted to detect the interaction between circ_0120051 and miR-144-3p.The binding site of miR-144-3p in the 3-UTR of isocitrate dehydrogenase 2（Idh2）mRNA was identified by the dual luciferase reporter gene assay.【Results】Circ_0120051 was significantly up-regulated in the myocardium of HF patients，while the mRNA expression of its host gene SLC8A1 was not changed.Circ_0120051 was mainly located in the cytoplasm of human AC16 cells.Results of RNase R exonuclease digestion revealed that circ_0120051 possesses the characteristic stability of circular RNA compared to the linear SLC8A1 mRNA.Overexpression of circ_0120051 could inhibit the expression of fibrosis-related gene in mCFs and mCFs migration.RIP assay confirmed the specific interaction between circ_0120051 and miR-144-3p.Transfection of miR-144-3p mimic could efficiently promote the expression of fibrosis-related genes in mCFs and reverse the inhibitory effect of circ_0120051 on the fibrotic phenotype of mCFs.Results of the dual luciferase reporter gene assay confirmed the interaction between miR-144-3p and the 3-UTR of Idh2.Transfection of miR-144-3p transcriptionally inhibited Idh2 expression，and overexpression of circ_0120051 enhanced IDH2 expression in mCFs.MiR-144-3p mimic and Idh2 small interfering RNA（siRNA）could consistently reverse the inhibitory effects of circ_0120051 on fibrosis-related genes expression in mCFs and mCFs migration.【Conclusions】Circ_0120051 inhibits the fibrotic phenotype of cardiac fibroblasts via sponging miR-144-3p to enhance the target gene of IDH2 expression.Key words：cardiac fibrosis；circular RNA；miRNA；Circ_0120051；cardiac fibroblastJ SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（2）：196-205心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是多种心脏疾病终末期的特征性改变，心肌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积和分布异常，致心室舒张和收缩功能障碍、电传导异常引起心律失常和心脏重构1-2，最终可导致心力衰竭的发生3。心肌纤维化中，活化的心肌成纤维细胞可转化为具有合成、分泌基质以及收缩作用的肌成纤维细胞4，被激活的肌成纤维细胞是心肌纤维化过程中细胞外基质结构蛋白的主要来源5。高等真核生物中，许多蛋白编码基因可以通过外显子的反向剪接产生环状RNA（circular RNA，circRNA）6。CircRNA不具有 5 端帽子和 3 端 poly A 尾结构，不易被RNA核酸外切酶降解7，相对于线性RNA，circRNA具有更好的稳定性和独特的生物学功能6。细胞质中的 circRNA 可通过竞争内源性 RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs）途径结合微 RNA（miRNA）8-9，或 与 RNA 结 合 蛋 白（RNA binding protein，RBP）相结合来发挥生物学功能，而胞质中一些circRNA还被证实具有翻译蛋白的功能；细胞核中的circRNA可以招募蛋白或者作为功能组分参与调节基因的转录表达10。CircRNAs参与包括心肌纤维化、心肌缺血再灌注损伤11-13、心力衰竭及其他多种心血管疾病过程14。前期测序结果提示，来源于溶质载体家族 8 成员 A1（solute carrier 197第45卷中山大学学报（医学科学版）family 8 member A1，SLC8A1）基 因 的 环 状 RNA circ_0120051在心衰患者心肌组织中表达上调15，但其对心肌纤维化的调控作用尚不明确，本研究旨在探讨 circ_0120051对心肌成纤维细胞的纤维化表型调节作用和分子机制。1 材料与方法1.1心肌标本利用心衰患者、健康器官捐献者心肌样本检测circ_0120051 和其宿主基因 SLC8A1 mRNA 表达。本文涉及的心肌样本均经广东省人民医院伦理委员会批准（批准号 NO.GDREC2016255H），所有心肌样本捐献者均签署知情同意书，病例资料同以往报道16。1.2动物13 d的SPF级C57BL/6乳小鼠（雌雄不拘），购自南方医科大学实验动物中心，生产许可号为SCKK（粤）2013-0034。本研究的动物实验已得到广东省人民医院伦理委员会批准（批准号 NO.KY-D-2021-136-01）。1.3主要试剂细胞培养基DEME/F12（Gibco）、特级澳洲胎牛血清（Bio Ind）、1PBS 粉末（博士德）；胰蛋白酶（2.5 g/L，Trypsin-EDTA）（Gibco）；miR-144-3p mimic（广州瑞博）；转染试剂Oligofectamine（Invitrogen）；核糖核酸外切酶（Ribonuclease R）（广州吉赛生物）；逆转录试剂盒（Takara）；Trizol裂解液（Invitrogen）；RIPA裂解液、NP40裂解液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（碧云天）；PVDF膜（What-man）BCA蛋白定量试剂盒（Thermo）；蛋白 Marker（Fermentas）；抗型胶原蛋白 1 链（Collagen Type Alpha 1，COL1A1）抗体、抗型胶原蛋白1链（Collagen Type Alpha 1，COL3A1）抗体（Protein Technology）；抗平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）抗体（Abcam）；抗 GAPDH 抗体、ECL化学发光检测试剂盒（Millipore）。1.4主要方法1.4.1乳小鼠心肌成纤维细胞的原代分离、传代培养和干预处理将出生日龄 13天 C57BL/6小鼠（雌雄不限）用医用酒精棉球消毒两遍，医用无菌眼科剪小心取出完整乳小鼠心脏，于冰盒上进行适当修剪心脏周围血管及其他多余组织后进行破碎，加入含酚红的胰蛋白酶-EDTA（2.5 g/L）和 PBS混合液4 摇床过夜消化后，取适量血清浓度的DMEM/F12终止消化，置于37 水浴箱温浴，用巴氏管轻柔吹打消化致肉眼不可见组织块后离心，弃上清重悬细胞沉淀并加入无菌培养瓶中培养，待乳小鼠心肌成纤维细胞长满培养瓶后换液、传代、铺板进行后续处理。实验中所有干预处理所用的细胞皆为P2代乳小鼠心肌成纤维细胞。1.4.2实时萤光定量 RT-qPCR 检测利用 Trizol法从心衰患者、健康器官捐献者心肌组织或乳小鼠心肌成纤维细胞中提取总 RNA，取 1.0 g 总 RNA为 模 板 逆 转 录 得 到 cDNA，检 测 circ_0120051、SLC8A1 以及纤维化相关基因的表达。在 qTOWER 3G（德国，real time system）进行 PCR 反应，用2-Ct或2-Ct法计算circ_0120051、SLC8A1以及纤维化相关基因的表达。PCR引物序列见表1。1.4.3蛋白免疫印迹弃细胞培养基，加入适量PBS清洗残留培养基，将培养板置于冰上，细胞裂解液均匀加入每孔细胞，静置20 min后刮取裂解细胞，收集至1.5 mL的EP管中。预冷离心机至4，12 000g，离心 1520 min，回收上清，弃沉淀。测定蛋白浓度后，蛋白定量1015 g，加入适量SDS-PAGE Loading Buffer，99 变性蛋白1015 min，取适量样品进行恒压 SDS-PAGE 凝胶电泳，电转PVDF膜，室温下5%脱脂牛奶封闭处理PVDF膜。根据目标蛋白大小裁剪PVDF膜，分别加入特异性抗 体 COL1A1（1：2 000）、COL3A1（1：2 000）、-SMA（1：2 000）、GAPDH（1：5 000），4 孵育过夜后，于常温使用对应的二抗孵育1 h，利用ECL印迹检测试剂对目标蛋白条带进行显影，借助Image J工具对条带进行灰度值分析，进而明确目标蛋白表达水平。1.4.4双萤光素酶报告实验利用特异的上下游引物退火获得目的DNA片段，使用相同的限制性核酸内切酶双切片段和PGL3-promoter载体，构建双 萤 光 素 酶 报 告 质 粒 PGL-circ_0120051。将HEK293 细 胞 均 匀 接 种 于 24 孔 板，使 用 Lipo198第2期梁俣，等.环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p/IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究fectamine 2000将萤光素酶报告载体和miRNA共同转染至HEK293细胞，同时转染pRL-TK（可表达海参萤光素酶质粒，将其作为内参质粒），37 培养24 h，测定萤火虫萤光（firefly luciferase，FL）和海参萤光强度（ranilla luciferase，RL），通过两者比值FL/RL 量化判断 circ_0120051 与 miRNA 之间结合能力强弱。1.4.5环形 RNA 稳定性实验提取人心肌细胞AC16 总 DNA，将 DNA 均 分 成 两 份（加 和 不 加RNase R处理）消化10 min，取等质量1.0 g逆转录后行 qPCR反应，分别检测 circ_0120051及其宿主基因SLC8A1 mRNA表达水平。1.4.6重组腺病毒的构建和包装Circ_0120051是由其宿主基因 SLC8A1前体 mRNA第 810号外显子反向剪接形成。将circ_0120051模板DNA定向克隆入腺病毒穿梭载体pAd-Track-cmv，并进一步 将 pAd-Track-cmv-circRNA-0120051 与 pAd-Easy-I在BJ5183 E.Coli中进行同源重组。重组成功后通过 Pac I 酶单切鉴定，并将线性化的 circ_0120051腺病毒质粒，利用转染试剂转染入密度达到80%90%的HEK293细胞中，进行811 d的病毒包装，待绿色萤光蛋白表达充分提示病毒包装完成，可回收病毒进行后续扩增。1.4.7划痕实验将乳小鼠心肌成纤维细胞接种于6孔细胞板中，待细胞密度达80%进行细胞干预处理，继续培养24 h后，用灭菌处理的枪头沿着细胞板垂直划线，PBS冲洗细胞碎片，更换培养基后拍摄0 h划痕图片。24 h后再次拍摄划痕图片，通过 Image J 工具对前后两次划痕面积进行定量分析，计算乳小鼠心肌成纤维细胞的迁移率。1.4.8统计学分析应用 GraphPad Prism9.0.0 和Image J进行统计学分析。实验结果用数标准差表1PCR引物序列Table 1The PCR primers sequences GeneCol1a1Col3a1Acta2Circ_0120051SLC8A1Idh2GapdhmiR-144-3pU6The primer sequence（5-3）F：CTGGTCCTGTTGGAAGTCGTR：CAGATGCACCTGTTTCTCCAF：CAATGTAAAGAAGTCTCTGAAGR：CAAACAGGGCCAATGTCCACF：CTGTGCTATGTCGCTCTGGAR：ATAGGTGGTTTCGTGGATGCF：GGACAAACTCATTAAGAAGACAR：CCTCTTTGCTGGTCAGTGGF：GAAGACAAACCTGGCCCTTGR：GAGACAATGAAACACGCCCAF：TTCTGAAGGCCTATGACGGGR：TGAGCCAGGATGTCAGACTGF：CAAGAAGGTGGTGAAGCAGGR：CCACCCTGTTGCTGTAGCCRT，GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAGTACATCATF：GTCCGCTACAGTATAGATGATGTACTR：GTGCGTGTCGTGGAGTCRT，GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACF：GTCCGCGTGCTCGCTTCGGCAGCR：GTGCGTGTCGTGGAGTCProduct/bp20124019220022820520068160199第45卷中山大学学报（医学科学版）表示。两组资料的方差齐性，每组资料服从正态分布，采用t检验进行两组比较；多组均数比较，各组定量资料都呈正态分布并且方差齐性进行 One way-ANOVA分析，反之用Kruskal Wallis H检验分析。采用 bonferroni法进行两两比较。P0.05视为具有差异统计学意义。2 结 果2.1环形 RNA circ_0120051 在心衰病人心肌中表达增加Circ_0120051序列来自于宿主基因SLC8A1的第8、9和10外显子，长度为300碱基（图1A）。Masson 染色结果显示心衰患者相对于健康器官捐献者，心肌组织的细胞间质胶原沉积增加，呈现高度纤维化状态（图 1B）。RT-qPCR 结果显示，circ_0120051在心衰患者心肌中表达显著上调，而其宿主基因 SLC8A1 的表达没有显著性异（图 1C）。RNase R处理结果显示，SLC8A1 mRNA水平显著下降，而circ_0120051变化不显著（图1D）。基于人心肌细胞 AC16 的核质 RNA 检测结果显示，circ_0120051主要定位于细胞质中（图1E）。2.2Circ_0120051抑制mCFs中纤维化相关基因表达和mCFs的迁移能力利 用 制 备 好 的 circ_0120051 腺 病 毒 感 染mCFs，RT-qPCR结果显示该circRNA可在mCFs中有效过表达（图2A）；DNA测序结果显示过表达的circ_0120051具有正确的接头序列（图 2B）。RNA水平检测结果示，过表达 circ_0120051的 mCFs中纤维化相关基因Col1a1、Col3a1和Acta2表达显著降低（图2C）。Western blot结果显示，过表达circ_0120051 可以显著抑制 mCFs 中 COL1A1、COL3A1A：Circ_0120051 sequence derives from exon 8 to exon 10 of SLC8A1 gene.B：Masson trichrome staining showed the increased collagen accumulation in the myocardium of HF patients，scale bar is 100 m,t=8.426，*P0.000 1 vs.healthy donors；C：Expression of circ_0120051 and SLC8A1 mRNA in the myocardium of HF patients by RT-qPCR assay，circ_0120051：t=2.059，*P=0.045 6 vs.healthy donors；D：Resistance of circ_0120051 against RNase R treatment by RT-qPCR assay，Circ_0120051：t=8.986，*P0.05 vs.Mock；E：Circ_0120051 is abundant in the cytoplasm of human AC16 cardiomyocytes.GAPDH mRNA and U6 were applied as positive controls in the cytoplasm and nucleus，respectively.Data are shown as Mean SD.n=3.图1Circ_0120051在心衰病人心肌中表达增加Fig.1Up-regulation of circ_0120051 in the myocardium of patients with heart failure200第2期梁俣，等.环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p/IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究和-SMA表达（图2D）。划痕实验结果显示，过表达 circ_0120051 的 mCFs 迁 移 能 力 显 著 降 低（图2E）。2.3Circ_0120051 通过结合 miR-144-3p 抑制mCFs的纤维化表型生物信息学预测（https：/circinteractome.nia.nih.gov/index.html）结果显示，circ_0120051序列上有潜在 miR-144-3p 结合位点（图 3A）。过表达circ_0120051 可显著降低 mCFs 中 miR-144-3p 水平（图 3B）。进一步的 RIP 实验提示 circ_0120051与miR-144-3p之间存在结合作用（图3C）。Western blot 结果显示，转染 miR-144-3p 可显著增加mCFs中纤维化相关蛋白表达，并逆转circ_0120051对 mCFs 中纤维化相关蛋白表达的抑制作用（图3D）。划痕实验结果显示，转染 miR-144-3p 可显著增强mCFs的迁移能力，并显著减弱过表达circ_0120051对mCFs迁移的抑制作用（图3E）。2.4miR-144-3p介导circ_0120051抑制纤维化相关基因表达利用TargetScan-Vert（www.targetscan.org）进行miR-144-3p 靶基因预测分析，提示miR-144-3p与异柠檬酸脱氢酶 2（Idh2）基因的 3 非翻译区（3-UTR）有潜在结合位点（图 4A）。双萤光素酶报告基因实验结果显示，miR-144-3p 与 Idh2 3-UTR可发生结合作用，突变 Idh2 3-UTR 上 miR-144-3p结合序列后，可以消除这种特异的结合作用（图 4B）。RT-qPCR 结果显示，转染 miR-144-3p 可降低 mCFs中 Idh2 mRNA表达（图 4C）。Western blot检测证实，转染 miR-144-3p 的 mCFs 中 Idh2 蛋白水平显著降低（图 4D），而过表达 circ_0120051 的mCFs中Idh2 蛋白水平显著升高（图 4E）。在mCFs 中转染 miR-144-3p和靶向抑制Idh2的小干扰RNA（siRNA）可一致地逆转过表达circ_0120051对mCFs中纤维化相关蛋白表达的抑制作A：Over-expression of circ_0120051 in mCFs detected by RT-qPCR assay；B：Sanger sequencing results showed the correct junction sequence of the exogenously overexpressed circ_0120051 in mCFs；C：MRNA expression of Col1a1，Col3a1 and Acta2 in mCFs with overexpression of circ_0120051，Col1a1：t=4.867，*P=0.008 2 vs.Vector；Col3a1：t=6.835，*P=0.002 4 vs.Vector；Acta2：t=5.692，*P=0.004 7 vs.Vector；D：Protein expression of COL1A1，COL3A1 and-SMA in mCFs with overexpression of circ_0120051，COL1A1：t=9.011，*P=0.000 8 vs.Vector；COL3A1：t=7.913，*P=0.001 4 vs.Vector；-SMA：t=10.60，*P0.05 vs.Vector.E：Migration activity of mCFs by wound healing assay.scale bar is 200 m,t=3.798，*P=0.019 1 vs.Vector.Data are shown as Mean SD.n=3.图2Circ_0120051抑制乳小鼠心肌成纤维细胞纤维化表型Fig.2Circ_0120051 inhibits the fibrotic phenotype of mouse cardiac fibroblasts201第45卷中山大学学报（医学科学版）用（图 4F）。划痕实验结果显示，转染 miR-144-3p和 Idh2 siRNA 亦可一致减弱过表达 circ_0120051对mCFs迁移的抑制作用（图 4G）。3 讨 论本文首先在年龄、性别、体质量匹配的健康捐献者、心衰患者组织中进行芯片测序，筛选到在心衰组织中显著上调的环形RNA circ_0120051，而其宿主基因SLC8A1与健康捐献者组织相比没有明显差异，提示circ_0120051表达上调不是其前体转录本含量增加所致，而是参与circ_0120051生成相关的RNA结合蛋白所致，具体的调节机制有待于进一步研究证实。Circ_0120051是由其宿主基因SLC8A1第810号外显子反向剪接形成，Rnase R实验结果显示相比于线性的 SLC8A1 转录本，circ_0120051 具有典型的环状 RNA 稳定性。利用腺病毒介导过表达circ_0120051可显著抑制mCFs中纤维化相关基因的表达。鉴于心肌纤维化发生中心肌成纤维细胞增殖和迁移能力增强的特征17。进一步的划痕实验结果显示过表达 circ_0120051 可以显著抑制mCFs的迁移。上述结果表明circ_0120051可以抑制 mCFs的纤维化表型，提示 circ_0120051具有抑A：The potential binding site of miR-144-3p in circ_0120051；B：Down-regulation of miR-144-3p in mCFs with over-expression of circ_0120051 by RT-qPCR，t=4.120，*P=0.014 6 vs.Vector；C：RIP assay was performed by using anti-AGO2 antibody，and the enrichment of circ_0120051 and miR-144-3p was determined by RT-qPCR，circ_0120051：t=6.882，*P=0.002 3 vs.Ig G；miR-144-3p：t=4.775，*P=0.008 8 vs.Ig G；D：Protein expression of COL1A1，COL3A1 and-SMA in mCFs by Western blot assay，COL1A1：F=117.9，P0.000 1，*P0.000 1 vs.Vector+scramble，*P=0.000 6 vs.Vector+scramble，*P0.000 1 vs.Vector+miR-144-3p；COL3A1：F=127.6，P0.000 1，*P0.000 1 vs.Vector+scramble，*P=0.004 8 vs.Vector+scramble，*P0.000 1 vs.Vector+miR-144-3p；-SMA：F=44.72，P0.000 1，*P=0.000 5 vs.Vector+scramble，*P=0.002 6 vs.Vector+scramble，*P=0.000 4 vs.Vector+miR-144-3p；E：Migration activity of mCFs by wound healing assay.scale bar is 200 m,F=130.9，P0.000 1，*P0.000 1 vs.Vector+scramble，*P=0.000 2 vs.Vector+scramble，*P0.000 1 vs.Vector+miR-144-3p.Data are shown as Mean SD.n=3.图3MiR-144-3p介导circ_0120051抑制mCFs纤维化表型Fig.3MiR-144-3p mediates the inhibitory effect of circ_0120051 on the fibrotic phenotype of mCFs202第2期梁俣，等.环状RNA circ_0120051通过miR-144-3p/IDH2轴抑制心肌成纤维细胞的纤维化表型研究A:Predicted miR-144-3p seed matches to the sequence in the 3-UTR of mouse Idh2 mRNA.The seed sequence of miR-144-3p is ACAGUAU,the mutant nucleotides were indicated in red;B:Verific