副猪嗜血杆菌5个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45，No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202304016副猪嗜血杆菌5个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较丁略烜1，戚百川1，史琳琪1，杨金钱1，詹鹏飞1，关丽君1，薛云1，赵战勤1,2*(1.河南科技大学 动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室，河南 洛阳 471023；2.河南科技大学 动物科技学院/河南省高等学校环境与畜产品安全重点学科开放实验室，河南 洛阳 471023)摘要：为筛选副猪嗜血杆菌(GPS)亚单位疫苗的优势保护性抗原，本研究利用大肠杆菌BL21系统表达了GPS重要抗原rHps06257、rD15和rHps0675，及Hps0675 N端和C端的重组蛋白rHps0675-N和rHps0675-C，并通过SDS-PAGE检测各重组蛋白的表达情况。利用His标签蛋白纯化试剂盒纯化5个重组蛋白后，分别与MontanideTMISA 201 VG佐剂混合制成亚单位疫苗，对小鼠进行2次免疫，并分别在小鼠首免前、一免后21 d和二免后14 d(即首免后35 d)经尾根静脉采血分离血清，利用间接ELISA方法检测各组小鼠的抗体水平。二免后14 d分别利用5倍半数致死剂量(LD50)的5型GPS H5L3株和12型GPS H12L3株菌液对小鼠进行腹腔攻毒，攻毒后14 d内观察并记录各组小鼠的临床症状、发病及死亡情况，统计各组小鼠的免疫攻毒保护率。SDS-PAGE检测结果显示，5个重组蛋白均以包涵体形式表达，其表达量占菌体总蛋白的27.46%42.37%。ELISA检测结果显示，各蛋白疫苗免疫组小鼠的IgG抗体水平随免疫次数的增加而升高，与PBS对照组相比差异均极显著(0.01)。攻毒试验结果显示，分别利用5 LD50GPS 5型H5L3株菌液和12型H12L3株菌液攻毒后，PBS和BL21菌体蛋白对照组小鼠攻毒后24 h内开始发病，3 d内全部死亡；发病小鼠主要症状为精神沉郁，食欲减退或废绝，被毛紊乱，对外界刺激无明显反应等；对死亡小鼠剖检可见其各组织器官的多发性浆膜炎和败血症性病理学变化。各蛋白疫苗免疫组小鼠中也出现了不同程度 的发 病 和死 亡情 况，其 中利 用 5 LD50H5L3株 攻 毒 后，rHps06257、rD15、rHps0675、rHps0675-N和rHps0675-C对免疫组小鼠的保护率分别为80%、0、0、40%和80%；利用5 LD50H12L3株攻毒后，上述各组蛋白疫苗对小鼠的保护率分别为80%、20%、20%、10%和60%。本研究首次证实重组蛋白rHps06257和rHps0675-C能够诱导小鼠产生较强的免疫保护效力，具有作为亚单位疫苗靶抗原的潜力，为GPS亚单位疫苗候选保护性抗原的筛选奠定基础。关键词：副猪嗜血杆菌；抗原；小鼠；保护效力；亚单位疫苗中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)10-1074-06Comparative analysis of protective efficacy of three antigenicproteins ofon miceDING Lue-xuan1,QI Bai-chuan1,SHI Lin-qi1,YANG Jin-qian1,ZHAN Peng-fei1,GUAN Li-jun1,XUE Yun1,ZHAO Zhan-qin1,2*(1.Luoyang Key Laboratory of Prevention and Control Technology of Zoonotic Bacterial Infectious Diseases,College of Animal Science andTechnology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China;2.Key-Disciplines Lab of safety of environment andAnimal Product,College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China)收稿日期：2023-04-19基金项目：国家自然科学基金(U1704117、31672530)作者简介：丁略烜(1995-)，男，河南商丘人，硕士研究生，主要从事家畜传染病及其疫苗研究.*通信作者：E-mail：*Corresponding authorAbstract:In order to screen for the dominant protective antigens of(GPS)subunit vaccine,thepET28a/BL21 system was used to express rHps06257,rD15 and rHps0675 proteins,as well as the N-terminal(rHps0675-N)andC-terminal(rHps0675-C)proteins of Hps0675.The expression of each recombinant protein was detected by SDS-PAGE.Fiverecombinant proteins were purified using His-tagged protein purification kit,and then mixed with MontanideTMISA 201 VGadjuvant to make subunit vaccine.Mice were immunized twice,and blood samples were collected and serum was isolated from tailroot vein before the first immunization,21 days after the first immunization,and 14 days after the second immunization(i.e.35 dafter the first immunization).The antibody levels in each group of mice were detected by indirect ELISA method.On 14 days afterthe second immunization,the mice were intraperitoneally challenged with 5 times the lethal dose(LD50)of type 5 GPS virulentstrain H5L3 strain and type 12 GPS strain H12L3,respectively.The clinical symptoms,morbidity and mortality of the mice wereobserved and recorded for 14 days,and the challenge protection rate of each group was analyzed.SDS-PAGE showed that the fiverecombinant proteins were expressed in the form of inclusion bodies,accounting for 27.46%-42.37%of the total bacterial proteins.ELISA results showed that the IgG antibody level in each recombinant protein immune group increased with the increase ofimmunization times,and the difference was very significant compared with that in PBS control group(0.01).The challenge testresults showed that the onset of disease began within 24 hours,and all died within 3 days of the PBS and BL21 protein controlgroup after challenge with 5LD50type 5 GPS strain H5L3 or 5LD50type 12 strain H2L3.The main symptoms of the onset micewere depression,loss of appetite,disordered coat and no obvious response to external stimuli.Necropsy of dead mice mainlyshowed the pathological changes of multiple serositis and septicemia in various tissues and organs.In mice immunized withdifferent recombinant proteins,there were also different degrees of morbidity and death.The protection rates of rHps06257,rD15,rHps0675,rHps0675-N and rHps0675-C were 80%,0,0,40%and 80%,respectively,after challenge with 5LD50H5L3 strain.Theprotection rates were 80%,20%,20%,10%and 60%,respectively,and after challenge with 5LD50H12L3 strain.The results ofthis study confirmed for the first time that the recombinant proteins rHps06257 and rHps0675-C can induce strong immuneprotection in mice,and have the potential to be used as the target antigen of subunit vaccine,which lays a foundation for thescreening of candidate protective antigen proteins of GPS subunit vaccines.Key words:;antigen;mouse;protective efficacy;subunit vaccine猪副猪嗜血杆菌(,GPS)病是由GPS感染引起猪的以多发性纤维素浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要症状的疾病，是世界范围内养猪业的重要细菌性传染病之一1-2。各年龄段的猪均能感染GPS，其中断奶仔猪和保育仔猪最易感3。GPS包括至少15种不同的血清型，世界范围内以血清4型和5型为主4-5。在我国最为流行的血清型依次是4型、5型、13型、14型和12型6-8。疫苗免疫接种是预防GPS病的有效手段，但由于GPS血清型众多，各血清型之间缺乏交叉保护力，灭活疫苗对各种血清型的保护效果参差不齐9。当前需要研发一种安全性高、覆盖面广的新型GPS疫苗。本实验室前期对具有作为亚单位疫苗抗原潜力的多个GPS抗原片段进行了表达与纯化，并在同一条件下进行了反应原性的比较研究，其中包括蛋白Hps06257、D15 和 Hps067510。已 有 研 究 表 明Hps06257、D15和Hps0675均是GPS重要的保护性抗原11-14。外膜蛋白D15属于Omp85家族，是其他外膜蛋白定位和折叠于外膜的必需蛋白，可以对多种血清型产生交叉免疫保护反应15。Hps06257是GPSABC型抗微生物肽转运系统和ATP酶的组分，其C端含有脂蛋白GNA1870结构域，相似蛋白在脑膜炎奈瑟球菌中已成为最有潜力的保护性抗原16。付书林通过生物信息学同源比对和反向遗传学的方法预测了外膜蛋白Hps0675，证明其能够诱导机体产生显著的体液免疫反应，并能够介导Thl型细胞因子的产生13。本研究选择本实验室前期构建的GPS表达Hps06257、D15 和 Hps0675 蛋 白 的 重 组 质 粒(即pET28a-Hps06257、pET28a-D15和pET28a-Hps0675)及表达Hps0675 N端和C端蛋白的重组质粒(pET28a-Hps0675-N和pET28a-Hps0675-C)分别进行诱导表达和纯化，并在相同背景条件下进行小鼠免疫保护效力的比较研究，以期筛选出具有制备GPS亚单位疫苗潜力的抗原成分。丁略烜，等.副猪嗜血杆菌 5 个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较第 10 期10751材料与方法1.1主要实验材料重组质粒pET28a-Hps06257、pET28a-D15、pET28a-Hps0675、pET28a-Hps0675-N和pET28a-Hps0675-C均由本实验室构建及保存10。GPS 5型H5L3株和12型H12L3株均由本实验室分离并保存。LB(Luria-Bertani)、TSA(Tryptic Soy Agar)和TSB(Tryptic Soy Broth)培养基均购自美国BD公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、硫酸卡那霉素、异丙基-茁-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、Ni-TED 6FF His标签蛋白纯化试剂盒、ELISA相关试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；硝酸纤维素膜(NC膜)购自武汉博士德生物工程有限公司；MontanideTMISA 201 VG佐剂购自Sigma-Aldrich公司。6周龄8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司。1.2重组蛋白的表达及纯化按照参考文献10，将重组质粒pET28a-Hps06257、pET28a-D15、pET28a-Hps0675、pET28a-Hps0675-N和pET28a-Hps0675-C分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，37 培养后挑单菌落于10 mL含50 滋g/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37、180 r/min摇床培养至对数生长期后(OD600=0.61.0)，加入IPTG溶液(终浓度为1 mmol/L)37 诱导4 h。将菌液离心后收集菌体，PBS洗3次后定容至1/40原菌液体积；在冰浴条件下，利用超声破碎仪对菌液超声破碎，10 000 r/min离心8 min，分离上清和沉淀，同时以pET28a/BL21诱导表达菌液作为对照，进行SDS-PAGE检测，鉴定表达的5个重组蛋白是否以包涵体形式表达，按照His标签蛋白纯化试剂盒说明书，利用8 mol/L尿素变性溶解再以亲和层析法纯化，最后均利用500 mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白，纯化后的包涵体蛋白经PBS透析后，利用超微量核酸蛋白浓度测定仪测定蛋白浓度，重组蛋白分别命名为rHps06257、rD15、rHps0675、rHps0675-N和rHps0675-C。同时，按照上述方法制备pET28a/BL21超声破碎后的全菌体蛋白，命名为BL21菌体蛋白。1.3小鼠免疫保护试验按照佐剂说明书，分 别 制 备 上 述 5 个 重 组 蛋 白 和 BL21 菌 体 蛋 白 的ISA201佐剂疫苗。以重组蛋白rHps06257为例，制备方法简述如下。利用高速匀浆机(10 000 r/min)将ISA201佐剂搅拌60 s后，在继续搅拌状态下缓慢加入等体积重组蛋白rHps06257溶液(500 滋g/mL)，继续搅拌4 min6 min成为白色粘稠乳液，疫苗中蛋白含量为250 滋g/mL，检验合格后分装，置4 保存。将140只BALB/c小鼠，随机均分为7组(20只/组)，16组每只小鼠分别皮下注射制备的重组蛋白rHps06257、rD15、rHps0675、rHps0675-N、rH-ps0675-C和对照BL21菌体蛋白疫苗0.2 mL(蛋白含量250 滋g/mL)，第7组注射无菌PBS为阴性对照组。21 d后用相同的方法二免。一免前、一免后21 d、二免后14 d，从各组取5只小鼠经尾根静脉采血分离血清，通过间接ELISA方法测定各组小鼠血清中的抗体水平11。小鼠二免后14 d(首免后35 d)，每组各取10只小鼠，经腹腔注射5 LD50的5型GPS H5L3株菌液(0.2 mL，8.4伊108cfu)；各组剩余10只小鼠各经腹腔注射5 LD50的12型GPSH12L3株菌液(0.2 mL，6.0伊108cfu)。观察并记录小鼠的发病和死亡情况14 d，死亡小鼠立即剖检并进行细菌的分离鉴定；观察期结束，统计各组小鼠保护率，对所有存活小鼠剖杀(颈椎脱臼法)并进行细菌的分离鉴定。1.4数据的统计与分析通过SPSS 20.0软件对试验数据进行统计学分析，采用 检验(Studentstest)和单因素方差分析(one-way ANOVA)(采用Duncan氏法进行多重比较)，比较各组之间的差异性，0.05表示差异显著，0.01表示差异极显著。2结果与讨论2.15个重组蛋白的表达与纯化结果将5个重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导4 h后，经SDS-PAGE检测结果显示，重组菌pET28a-Hps06257/BL21、pET28a-D15/BL21、pET28a-Hps0675/BL21、pET28a-Hps0675-N/BL21、pET28a-Hps0675-C/BL21分别在约27.5ku、52ku、55ku、36ku、32 ku处有明显目的条带，均以包涵体形式表达，表达量分别为31.90%、27.46%、38.5%、42.37%和28.21%；重组蛋白经His标签蛋白纯化试剂盒纯化后均 得到较单一 的预 期大小 的目的 条带(图1)，中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1076rHps06257、rHps0675-N、rHps0675-C、rHps0675、rD15纯化后的浓度分别为5.92 mg/mL、1.56 mg/mL、2.13 mg/mL、2.47 mg/mL、3.15 mg/mL。本研究中重组蛋白rHps06257和rD15的分子量、表达形式与其他学者的前期研究结果均一致10,12,14,17；重组蛋白rHps0675与付书林研究中的表达形式不同13。两者所使用的重组表达载体，以及诱导表达的方法和条件均一致，可能是本研究中表达片段去除了部分信号肽编码基因所导致。5个重组蛋白的表达和纯化为其免疫保护效力的比较研究奠定基础。2.2各组小鼠血清抗体水平检测结果以各重组蛋白为包被抗原(100 ng/孔)，通过ELISA方法测定各重组蛋白免疫小鼠血清的抗体水平。结果显示，各蛋白免疫组小鼠与PBS对照组相比抗体水平均极显著升高(0.01)。各蛋白疫苗免疫组小鼠一免后抗体水平均极显著高于一免前(0.01)，二免后各免疫组小鼠的抗体水平均再次显著升高，除rD15(0.05)外，其他4个蛋白疫苗免疫组与一免后抗体水平均差异极显著(0.01)。一免后各蛋白疫苗免疫组之间相比较，rD15组小鼠抗体水平极显著高于rHps0675和 rHps06257 组(0.01)，显 著 高 于 rHps0675-N 和rHps0675-C组(0.05)；二免后rD15组小鼠抗体水平极显著高于rHps0675和rHps06257组(0.05)(图2)。抗体水平是检测机体对抗原免疫原性及其诱导机体产生体液免疫应答的主要指标18，本研究中各抗原蛋白的疫苗均能够诱导小鼠产生较高水平的IgG抗体。相比较而言，rHps06257诱导小鼠产生的抗体水平最低，这与周明光的研究结果基本一致11，但该蛋白在小鼠免疫保护试验中均提供了最高的保护率。本研究中rD15和rHps0675诱导小鼠产生的抗体水平较高，这与其他研究结果一致13-14。上述试验结果表明5个重组蛋白的免疫原性均良好。2.3小鼠免疫攻毒保护试验结果二免后14 d，用5 LD50的5型GPS H5L3株菌液对各组小鼠进行腹腔攻毒。结果显示，PBS阴性对照组和BL21菌体蛋白对照组小鼠攻毒后24 h内开始发病，3 d内全部死亡；发病小鼠主要症状为精神沉郁，食欲减退或废绝，被毛紊乱，对外界刺激无明显反应等；对死亡小鼠立即剖检，主要表现为胸腔和腹腔积液，腹腔纤维素粘连，肺脏、肝脏、肠道等组织脏器出血等剖检病变(图3A、3B)，从死亡小鼠的心血和肺脏中均能分离到GPS。各重组蛋白免疫组小鼠中也出现了不同程度的发病或死亡情况。14 d的观察期结束后，对所有存活小鼠剖检，均无明显剖检变化(图3C图3E)，从小鼠心血和肺脏等组织中均未分离到GPS。用5 LD50的12型H12L3株菌液对各组小鼠进行腹腔攻毒的临床症状和剖检变化与5型H5L3株相似。利用5 LD50剂量的5型GPS H5L3株攻毒后，rHps06257和rHps0675-C蛋白疫苗均能提供免疫小鼠较强的保护力，保护率均为80%(8/10)；其次为rHps0675-N，保护率为40%(4/10)，rD15和rHps0675对小鼠的保护率均为0(0/10)；使用5 LD50剂量的12型H12L3株攻毒后，蛋白疫苗rHps06257和rHps0675-C对小鼠的保护 率 分 别 为 80%(8/10)和 60%(6/10)，rD15 和 rH-ps0675的保护率均为20%(2/10)，rHps0675-N对小鼠的保护率为10%(1/10)(表1)。丁略烜，等.副猪嗜血杆菌 5 个重组蛋白的小鼠免疫保护效力比较第 10 期1077M:Protien Marker;1:pET28a/BL21 induced by IPTG;2-6:rHps0675-C,rHps0675-N,rHps0675,rD15 andrHps06257,respectively图1纯化蛋白的SDS-PAGE分析M123456130ku100ku70ku50ku35ku25ku20ku15ku*:0.01;*:0.05;ns:Not significant图2各组小鼠血清IgG抗体水平的检测结果rHps06257rHps0675-1rHps0675rHps0675-2rD15BL21PBS35d21d043210Time post first immunizationnsnsns表15个重组蛋白疫苗对小鼠的免疫保护试验结果疫苗种类VaccinetyperHps06257rD15rHps0675rHps0675-NrHps0675-CBL21PBS controlrHps06257rD15rHps0675rHps0675-NrHps0675-CBL21PBS control攻毒菌株ChallengestrainH5L3 strainH5L3 strainH5L3 strainH5L3 strainH5L3 strainH5L3 strainH5L3 strainH12L3 strainH12L3 strainH12L3 strainH12L3 strainH12L3 strainH12L3 strainH12L3 strain小鼠只数No.ofmice1010101010101010101010101010死亡数Amountof death21010621010288941010存活数Amountof survival80048008221600保护率Protectionrate80%0040%80%0080%20%20%10%60%00注：攻毒后14 d观察期内，小鼠存活即判定为保护。Note:During the 14-day observation period after challenge,the survivalof mice was judged as protection.123456789A，B：PBS对照组和BL21菌体蛋白对照组死亡小鼠；CE：rHps06257、rHps0675-N和rHps0675-C蛋白疫苗免疫组存活小鼠免疫组A,B:Dead mice in PBS control group and BL21 whole cell proteincontrol group;C-E:Mice immunized with rHps06257,rHps0675-N andrHps0675-C protein after the and of the observation period,respectively.图3各组免疫小鼠攻毒后的解剖图(H5L3株)ABCDE本研究中rHps06257对5型和12型GPS攻毒小鼠均提供了80%的保护率，与Zhou11和赵建平12的研究中rHps06257对小鼠提供的保护率基本一致(80%；70%)，表明rHps06257可能具有抵抗不同血清型GPS侵袭的能力。针对GPS攻毒，rD15提供免疫小鼠的保护率较低(20%)或不能提供任何有效保护(0)，而Zhou11和李新果14等的研究中rD15却对小鼠免疫保护率较高(60%；76%)，这可能是由于本研究中攻毒剂量偏高，rD15的保护效力低于其他优势蛋白(如Hps06257)。值得注意的是，rHps0675对攻毒小鼠提供了很低(20%)或没有提供有效保护率(0)，然而其两个分段蛋白rHps0675-N和rHps0675-C分别对攻毒小鼠提供了25%和70%的保护率，另外付书林的研究显示rHps0675对小鼠提供60%的保护率13，这可能是由于诱导表达过程中蛋白二级或三级结构的折叠，蛋白质氨基酸序列及空间结构的改变引起抗原表位的隐藏或掩盖而影响了其免疫原性所致19。这表明rHps06257和rHps0675-C免疫小鼠后具有较强的保护效力。近年来关于GPS亚单位疫苗抗原的研究多有报道，但将多个GPS重要抗原进行免疫保护效力的比较研究却较少，本研究在同一实验中对GPS重要抗原rHps06257、rD15、rHps0675，及Hps0675的N端和C端rHps0675-N和rHps0675-C重组蛋白疫苗的免疫保护效力进行了比较研究，筛选出亚单位疫苗抗原成分的侯选蛋白rHps06257和rHps0675-C，为其在亚单位疫苗研发中的应用提供了参考依据。参考文献：程家园，王迪，李亮，等.副猪嗜血杆菌病四价灭活苗的制备 及 对 豚 鼠 的 免 疫 效 果 评 价 J.中 国 预 防 兽 医 学 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