鸡圆圈病毒3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立与应用.pdf

56-07ChineseVeterinaryScience网络首发时间：2 0 2 3-10-182024,54(01):56-62中国兽医科学D01:10.16656/j.issn.1673-4696.2024.0013中图分类号：S852.659.2文献标志码：A文章编号：16 7 3-46 9 6(2 0 2 4)0 1-0 0 5鸡圆圈病毒3型SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法的建立与应用牛群1.4,庄丽云1.2,雷天宇1.2,戴婷婷1.2,孟庆福1,刘荣昌35,何华4,郑新添1*（1.龙岩学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室，福建龙岩36 40 0 0；2.福建农林大学动物科学学院，福建福州350000;3.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州350013;4.河南农业大学动物医学院，河南郑州450046；5.福建省禽病防治重点实验室，福建福州350013)摘要：本研究针对圆圈病毒3型（GyV3)VP2基因构建标准质粒，以此作为模板建立标准曲线，在优化qPCR反应体系的基础上，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示，该方法仅对GyV3特异性扩增，最低检测模板浓度为1.58 510 lcopies/uL，组内和组间重复性试验的变异系数均小于1.0%。用本研究建立的qPCR方法对50 份临床样品进行检测，阳性检出率为10%（5/50），高于常规PCR的阳性检出率8%（4/50）。上述结果表明，本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好、灵敏度高，可用于临床快速检测GyV3。关键词：圆圈病毒3型；VP2基因；实时荧光定量PCREstablishment and application of SYBR Green I real-timefluorescence quantitative PCR method for chicken circle virus type 3NIU Qun-4,ZHUANG Liyun2,LEI Tianyu2,DAI Tingting2,MENG Qingfu,LIU Rongchang-5,HE Hua,ZHENG Xintianl*(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine and Biotechnology,Longyan University,Longyan364000,China;2.College of Animal Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350000,China,3.Instituteof Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China,4.Collegeof Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450046,China;5.Fujian Provincial Key Laboratory forAvian Diseases Control and Prevention,Fuzhou 350013,China)Abstract:In this study,a standard plasmid based on Gyv3 vP2 gene was constructed and used asa template to establish a standard curve.On the basis of optimizing the qPCR reaction system,thespecificity,sensitivity and repeatability of this method were evaluated.The results revealed themethod was only specific for Gyv3 amplification,the minimum detection template concentration was1.585 X10l copies/L,and the coefficient of variation in both intra-class and intra-grouprepea-tability tests was less than 1.0%.The qPCR method established in this study was used todetect 50 clinical samples,and the detection rate was 10%(5/50),higher than the conventional PCRdetection rate of 8%(4/50).The results above indicate that the real-time fluorescent quantitativePCR method established in this study has high specificity,reproducibility,and sensitivity and can收稿日期：2 0 2 3-0 7-0 1；修回日期：2 0 2 3-0 9-13基金项目：国家现代农业产业技术体系资助项目（CARS-42）；龙岩学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室开放基金项目（2 0 2 2 KF03）；河南农业大学“拔尖人才项目（30 50 0 7 37）作者简介：牛群（1999-），男，河南南阳人，硕士生，E-mail:；庄丽云（2 0 0 0-），女，福建泉州人，硕士生，E-mail：12 8 6 0 56 50 5 q q.c o m。牛群与庄丽云对本文具有同等贡献。*通讯作者：郑新添（198 1-），男，教授，博士，研究生导师，主要从事预防兽医学研究，E-mail：z h-x i n t i a n 16 3.c o m g57牛群等：鸡圆圈病毒3型SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法的建立与应用第1期be utilized for quick clinical detection of Gyv3.Key words:gyrovirus 3;VP2 gene;real-time fluorescence quantitative PCR*Corresponding author:ZHENG Xin-tian,E-mail:zh-鸡圆圈病毒3型（gyrovirus3,GyV3）属于细环病毒科（Anelloviridae)圆圈病毒属（Gyrovirus），是一种小型、无囊膜的二十面体病毒，是单股环状DNA病毒的一员1。GyV3基因组编码3个ORF,分别编码衣壳蛋白VP1、骨架蛋白VP2和凋亡蛋白VP3。VP1在病毒侵染、复制和免疫逃避中发挥关键作用，与VP2相互作用可诱导中和抗体的产生，VP2基因相对保守,可作为GyV3感染流行病学监测的主要靶标。VP3由嵌套在VP2ORF中的一个较小的ORF编码，可诱导细胞凋亡。GyV3感染常发生于一些生物安全系数较低的禽类养殖厂，主要引起禽类发生精神菱顿、生长发育不良、背毛逆立、传染性腺胃炎等症状2-3。GyV3作为一种免疫抑制性病毒可以侵害家禽的免疫系统，是近年在鸡群中发现的新病毒，尚无特异性疫苗进行预防，给我国部分地区养禽业造成了重大经济损失4-5。目前用于检测GyV3的方法主要包括普通PCR、ELI SA、琼脂扩散试验等。本研究针对GyV3VP2基因建立SYBRGreen I实时荧光定量PCR方法，以期为GyV3的防控提供一种特异敏感的检测技术1材料与方法1.1病料来源GyV3、新城疫病毒（NDV）、马立克病毒(MDV）、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽白血病病毒(ALV)等阳性病料均由福建省禽病防治重点实验室鉴定和保存1.2主要仪器和设备ABIVeritiFAST梯度PCR仪、Nano300微量分光光度计、台式高速冷冻离心机购自Thermo公司。实时荧光定量PCR仪购自Eppendorf公司。电泳仪购自Tanon公司。凝胶分析成像系统购自ProteinSimple公司1.3主要试剂与耗材DNA Isolation Mini Kit、Pla s m id M in i K it,G e lDNA Extraction Mini Kit、2 X A c e Q q PC R SYBRGreenMasterMix、大肠杆菌DH5感受态细胞均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。DL5000DNAMarker购自宝生物工程（大连）有限公司1.4荧光定量PCR引物的设计与合成参照NCBI数据库中GyV3的基因序列，利用Primer5、M e g a l i g n 等软件对VP2基因序列进行引物设计（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.5病毒DNA的提取无菌采集患鸡的腺胃、肝等组织,对病变组织进行研磨破碎处理，12 0 0 0 r/min离心3min，取上清,用DNAIsolation MiniKit提取DNA。1.6常规PCR扩增以提取的DNA为模板,利用引物GyV3-VP2-F/R进行常规PCR扩增。反应体系：2 PCRmix25L，引物(GyV3-VP2-F/R)各1L,模板2 L,ddH,O21L。PCR反应程序：953min；然后进入循环阶段（9515s,5515s 7 2 15s），循环35次；最后4反应10 min,结束反应1.7阳性标准质粒的构建PCR扩增产物用GelDNAExtractionMiniKit回收，将回收产物连接于pMD-19T载体中，然后克隆至大肠杆菌DH5感受态细胞中,将PCR鉴定为阳性菌扩大培养后，用PlasmidMiniKit提取质粒并进行测序鉴定。依照公式：拷贝数=6.0 2 10 2 3（拷贝数/mol)X质粒质量浓度（g/L)/DNA长度（碱基数）6 6 0 ，计算阳性标准品质粒拷贝数1.8SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应体系建立及反应条件优化将上述构建的质粒标准品作为模板，分别采用表1GyV3引物序列Table1Primer sequence for virus nucleic acid detection引物名称Primernames引物序列（5-3）Primersequences扩增大小/bpProductlength备注RemarksGyV3-VP2-FATGTCATCCGGCGGTCTAG常规PCR720GyV3-VP2-RTTACCAGGTAAGATCCCGGATGConventional PCRGyV3-qPCR-FTGGATTACATCGCGAACAG174qPCRGyV3-qPCR-RGCATATCGAAGTTTACGCC58第54卷中国兽医科学两步法和三步法进行检测，根据试验结果进行反应条件优化1.9标准曲线建立和熔解曲线分析将初始浓度为1.58 510 copies/L的阳性标准质粒进行10 倍梯度稀释，获得1.58 510 41.58510copies/L的标准品质粒，以此为模板，在每一种浓度下,设定3个重复进行qPCR反应。反应体系:2 XAceQqPCRSYBRGreenMasterMix10L,GyV3-qPCR-F/R引物各1L,模板1L,最后用ddHO补充至2 0 L。在完成PCR反应(955min;9510 s;5515s;7 2 2 0 s;循环40 次)后，以质粒标准品拷贝数的对数为X轴，以C值（循环阈值）为Y轴，构建质粒拷贝浓度与循环阈值相对应的定量标准曲线，同时生成熔解曲线，并用Realplex软件分析熔解曲线1.10敏感性试验用建立的 SYBRGreen IPCR对1.58 5X10l1.58510copies/L的标准品质粒进行检测，并确定SYBRGreenIPCR所能检测的最低拷贝数，同时使用常规PCR做相同检测，将两者进行比较1.11特异性试验为了验证本研究建立的SYBRGreen IPCR方法的特异性,用NDV、M D V、A LV、CIA V的核酸作为检测样品，并以GyV3的阳性质粒作为阳性对照，同时设立ddHzO为阴性对照，评估该qPCR反应的特异性。1.12重复性试验为了对该试验的重复性进行定量分析，随机选取浓度为1.58 510 4copies/L、1.58 510 c o p i e s/L、1.585107copies/L的标准品质粒，以优化后的qPCR反应体系和反应条件,对每一个浓度进行3次平行试验，进行组内变异分析；同时在不同时间点对上述样品进行3次荧光定量检测，进行组间变异分析。根据反应结果的C值,计算组内和组间变异系数。1.13临床样品的检测以龙岩地区收集的50 份家禽病料为样品，提取DNA，分别采用实时荧光定量PCR和常规PCR进行检测2结果2.1常规PCR扩增以 GyV3的DNA为模板,对GyV3的VP2基因片段进行扩增，结果（图1)显示，扩增出约7 2 0 bp的条带，与预期大小一致。M11 000bp750bp720bp500bp200 bp100 bp图1GyV3VP2基因的扩增Figure1PCR amplification of GyV3VP2M:DNA分子质量标准;1目的基因的扩增产物。M:DL500o DNA Marker;l:Target gene amplification product.2.2阳性标准质粒的构建将PCR产物纯化后，克隆至pMD-19T载体，构建了重组质粒。对此重组质粒进行PCR扩增，通过凝胶电泳和测序对其进行验证，结果与目标片段相吻合，见图2。M121 000bp900bp750bp500bp200 bp180bp100bp图2标准品质粒的鉴定Figure 2Identification of standard plasmidM:DNA分子质量标准；1：重组质粒的PCR产物；2：载体。M:DL5000 DNA Marker;1:Recombinant plasmid PCR product;2:Car-rier.2.3SYBRGreenI实时荧光定量PCR条件的筛选通过比较各个反应的效果，确定最优的反应体系及反应程序。2 0 uL反应体系包含2 AceQqPCRSYBRGreenMasterMix10L，上、下游引物各1L,ddH,O7L,模板1L。以该体系获得了最优qPCR反应程序（95预变性6 0 s,95变性10s,55退火10 s，7 2 延伸10 s,共40 个循环）2.4实时荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线分析对拷贝数为1.58 510 copies/uL的GyV3重组质粒进行10 倍梯度稀释，选取6 个梯度浓度59牛群等：鸡圆圈病毒3型SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法的建立与应用第1期(1.5851041.58510copies/L）的质粒作为模板，用本研究建立的荧光定量PCR方法对这6 个梯度浓度的标准品质粒进行扩增，并以质粒标准品拷贝数的对数为横坐标，以3次的C平均值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明，标准曲线方程为y=一2.97 x十44.13，R为0.997,说明各浓度标准品之间具有良好的线性关系（图3A、B）。熔解曲线结果显示，在84出现单一峰值（图3C），证明反应不存在非特异性扩增。2.5敏感性试验采用常规PCR和本研究建立的实时荧光定量PCR分别对1.58 510 11.58 510 copies/L的标准品质粒进行扩增，结果（图4）显示，实时荧光定量PCR的最低检测限能达到1.58 510 icopies/L，而常规PCR所能达到的最低检测限为1.58 5X102copies/L,因此，实时荧光定量PCR的灵敏度比常规PCR的高10 倍。2.6特异性试验采用建立的实时荧光定量PCR方法对包括NDV、M D V、A LV、CIA V、G y V3等多种病毒进行检测。结果(图5)显示,除了GyV3以外,其他病原体核酸均无扩增信号，表明该方法具有良好的特异性。2.7重复性试验选取3个浓度的标准品，用优化后的实时荧光定量PCR方法进行组内和组间重复性试验，结果表明，组内变异系数在0.41%0.96%之间（表2）,组间变异系数在0.50%0.8 5%之间（表3）。因此，本研究建立的方法具有高度重复性，稳定性较好2.8临床样品检测分别运用常规PCR和实时荧光定量PCR对采自龙岩地区的50 份样品进行检测，结果显示，SYBRGreenI实时荧光定量PCR的阳性检出率为10%（5/50），而常规PCR为8%（4/50）。因此，本研究建立的SYBRGreenI实时荧光定量PCR的检出率高于常规PCR。3讨论圆圈病毒感染及其引起的传染性病毒性腺胃炎（transmissible proventriculitis，T VP）近年来在鸡场感染呈上升趋势，引起了广泛性的关注。尽管TVP不导致病禽的大量死亡，但是它引起鸡的生产性能下降,对鸡的生长发育产生显著影响6-7 ,同时GyV3作为免疫抑制病毒容易与其他病原混合感染【8 ,给家禽养殖业带来了严重危害910 。2 0 18 年首次在感染TVP的鸡群中发现GyV3,目前针对该A5.000110910%107400010010510430002.000123456100000510152025303540循环数CyclesBy=-2.97x+44.1332R?=0.99730-2826-24+22201816456789起始拷贝数的对数值Log value of the start copy quantityC1008060(%)LP/HP-401200-201-40657075808590温度/Temperature图3GyV3实时荧光定量PCR标准曲线的建立Figure3Establishment of GyV3 real-time quantitativePCR standard curveA：G y V3实时荧光定量PCR扩增曲线；B：G y V3实时荧光定量PCR标准曲线；C：荧光定量PCR熔解曲线；1 6：质粒浓度分别为1.585x101.585x10*copies/LA:Real-time PCR amplification curve of GyV3;B:Standard curve ofGyV3 real-time fluorescence quantitative PCR;C:Fluorescence quan-titative PCR melting curve;1-6:The plasmid concentrations are from1.585x101.585x10*copies/L.60第54卷中国兽医科学M123456789200 bp100bp500010%10%10710%4.000-105101010103000Threshold Line2.00010000510152025303540循环数Cycles图4实时荧光定量PCR敏感性试验Figure 4 Sensitivity test of real-time fluorescence quantitative PCRM:DNA分子质量标准；1 9：质粒浓度分别为1.58 510 9 1.58 510 lcopies/uL。M:DL5000 DNA Marker;19:The plasmid concentrations are from 1.585x101.585x10 copies/L.AB100400080300060(%)LP/HP-402.0001202610000260-205101520 253035406065707580859095循环数Cycles温度/Temperature图5实时荧光定量PCR特异性试验Figure 5 Specificity test of real-time fluorescence quantitative PCRA：特异性扩增曲线；B：特异性熔解曲线；1:GyV3;26:NDV、M D V、A LV、CIA V、d d H O。A:Specific amplification curve;B:Specific melting curve;1:GyV3;26:NDV,MDV,ALV,CIAV,ddH,O.表2 实时荧光定量PCR组内重复试验Table 2 Intra-group replication of real-time fluorescence quantitative PCR标准质粒浓度/（copiesL-1）平均值标准差变异系数/%CConcentration of standard-plasmidAveragevalueStandarddeviationCV1.58510420.3320.4120.5420.430.090.421.585X10625.9526.3526.5626.290.250.961.58510731.6231.8331.9331.790.130.41表3实时荧光定量PCR组间重复试验Table3Inter-group replication of real-time fluorescence quantitative PCR标准质粒浓度/（copiesL-）平均值标准差变异系数/%Concentrationof standard-plasmidCAveragevalueStandarddeviationCV1.58510430.9030.8231.1830.970.150.501.58510625.1325.2725.6425.350.220.851.58510730.9030.8231.1830.970.150.5061第1期牛群等：鸡圆圈病毒3型SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法的建立与应用病原的研究相对较少。由于传染性法氏囊炎病毒、网状内皮增生病毒、禽白血病病毒、腺病毒、呼肠孤病毒等均被报道与TVP有关12-16 ,然而TVP的实验室诊断方法尚未完备，且GyV3的临床诊断也较为困难。综上所述，建立一套包括检测GyV3的方法对于TVP的防控具有重要意义。与传统诊断方法相比，实时荧光定量PCR能够解决灵敏度低、特异性弱的问题，同时能够进行定量检测和特异性鉴定17-192022年林裕胜等7 运用传统的PCR方法对圆圈病毒进行病原检测,并对VP2基因进行分析，证实了VP2基因的稳定性。本研究针对GyV3VP2基因建立的实时荧光定量PCR检测方法具有较高的灵敏性，最低检测拷贝数为1.58 510 copies/L；同时该方法对不同浓度的核酸进行组间和组内重复检测试验，结果显示，其变异系数均小于1.0%，表明其重复性较好。在特异性试验中，仅对GyV3样品扩增，而对NDV、M D V、A LV、CIA V的病毒样品均无扩增信号，充分证明了本研究建立的方法具有高度特异性。综上所述，本研究建立的real-time qPCR检测方法特异性强、灵敏度高、可准确定量检测GyV3，为GyV3感染的临床检测、流行病学调查和防控提供了一种有效的技术工具。参考文献(References)1LI G,ZHOU D,ZHAO M,et al.Kinetic analysis ofpathogenicity and tissue tropism of gyrovirus 3 inexperimentally infected chickens J.VeterinaryResearch,2021,52(1):120.2刁治君，袁世玉，郝小静，等.圆圈病毒3型与鸡传染性贫血病毒共感染性腺胃炎的诊断J.中国家禽,2 0 19,41(19):78-80.DIAO Zhijun,YUAN Shiyu,HAO Xiaojing,et al.Diag-nosis of gonadal gastritis co-infected by circlevirus 3 and infectious anemia virus in chickensJ.ChinaPoultry,2019,41(19):78-80.(in Chinese)3ZHANG S,YUAN S,YAN T,et al.Serological investiga-tion of gyrovirus homsal infections in chickens inChinaJ.BMC Veterinary Research,2022,18(1):231.4LI G,YUAN S,HE M,et al.Emergence of gyrovirus 3 incommercial broiler chickens with transmissibleviral proventriculitisJ.Transboundary andEmerging Diseases,2018,65(5):1170-1174.5YUAN S,YAN T,HUANG L,et al.Cross-species pathogenicityof gyrovirus 3 in experimentally infected chick-ens and miceJJ.Veterinary Microbiology,2021,261:109191.6张龙.福建省部分地区三种禽病分子流行病学研究D.福州：福建农林大学,2 0 2 2.ZHANG Long.Molecular epidemiology of three aviandiseases in some areas of Fujian Province D.Fuzhou:Fujian Agriculture and Forestry Universi-ty,2022.(inChinese)7林裕胜，余明兴，陈长福，等.福建省部分养殖场鸡圆圈病毒3型病原检测及VP2基因分析J.中国动物检疫，2022,39(8):12-16.LIN Yusheng,YU Mingxing,CHEN Changfu,et al.Etio-logical detection of Gyv3 in some farms of FujianProvince and analysis on its VP2 geneJ.ChineseJournal of Animal Quarantine,2019,39(8):12-16.(inChinese)8YANG M,YANG Q,BI X,et al.The synergy of chickenanemia virus and gyrovirus homsa l in chickensJ.Viruses,2023,15(2):515.9贾梅玉.圆圈病毒3型亚单位疫苗和DNA疫苗的制备以及免疫保护性研究D.泰安：山东农业大学，2 0 19.JIA Meiyu.Development of subunit vaccine and DNAvaccine of gyrovirus 3 and immunoprotection eva-lutionD.Taian:Shandong Agricultural Universi-ty,2019.(inChinese)10CHU D K,POON L L,CHIU S S,et al.Characterizationof a novel gyrovirus in human stool and chickenmeatJJ.Journal of Clinical Virology,2012,55(3):209-213.11YAN T,LI G,ZHOU D,et al.Long read sequencing re-vealed proventricular virome of broiler chickenwith transmission viral proventriculitis J.BMC Veterinary Research,2022,18(1):253.12PANTIN-JACKWOOD M J,BROwWN T P.Infectious bursaldisease virus and proventriculitis in broilerchickens J.Avian Diseases,2003,47(3):681-690.13BAYYARI G R,HUFF WE,BALOG J M,et al.Experimentalreproduction of proventriculitis using homogenates ofproventricular tissueJ.Poultry Science,1995,74(11):1799-1809.14张志，崔治中，姜世金，等从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒J.中国兽医学报,2 0 0 4,40(1):10-13.ZHANG Zhi,CUI Zhizhong,JIANG Shijin,et al.Iso-lation and identification of reticuloendothe-liosis virus from tumors infected with subgroup Javian leukosis virusJ.Chinese Journal of Veteri-nary Medicine,2004,40(1):10-13.(in Chinese)15SCHULZE C,HEIDRICH R.Megabakterien-assoziierteproventrikulitis beim nutzgeflu gel in branden-burgJ.Deutsche Tierarztliche Wochenschrift,2001,108(6):264-266.胡弘博）（责任编辑62第54卷中国兽医科学16 SONGSERM T,ZEKARIAS B,VAN ROOZELAAR D J,et al.Experimental reproduction of malabsorption syn-drome with different combinations of reovirus,Escherichia coli,and treated homogenates ob-tainedfrom broilersJ.Avian Diseases,2002,46(1):87-94.17刘蔓蔓，温贵兰，李涛，等.马立克氏病病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用J.中国兽医科学,2 0 2 3,53(2)：17 0-17 5.LIU Manman,WEN Guilan,LI Tao,et al.Establish-ment of a SYBR Green I-based fluorescent quanti-tative PCR assay for Mareks disease virus J.Chinese Veterinary Science,2019,53(2):170-175.(in Chinese)18PEREIRA-GOMEZ M,FAJARDO A,ECHEVERRIA N,et al.Evaluation of SYBR Green real time PCR for de-tecting SARS-CoV-2 from clinical samples J.Journal of Virological Methods,2021,289:114035.19田雪，于可响，胡峰，等。鸡传染性腺胃炎相关的圆圈病毒3型SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法的建立J.中国动物传染病学报，2 0 2 2,30（2）：93-99.TIAN Xue,YU Kexiang,HU Feng,et al.Development ofA SYBR Green I real-time fluorescent quantita-tive PCR method for detection of gyrovirus 3 ofchickensJ.Chinese Journal of Animal Infec-tious Diseases,2022,30(2):93-99.(in Chinese)