JEV感染对小鼠睾丸间质细胞信号通路、炎症因子及睾酮分泌影响的研究.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202304015JEV感染对小鼠睾丸间质细胞信号通路、炎症因子及睾酮分泌影响的研究中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineVol.45,No.12Dec.2023何松，陈闾，汤德元，曾智勇，王彬，黄涛，罗柳，周飘，毛茵茗，廖正波，陈旭，袁盛林，胡雯雯，周敏（贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550 0 2 5)摘要：为探究日本乙型脑炎病毒(JEV)感染睾丸间质细胞(LC)后对其信号通路、炎症反应和睾酮分泌水平的影响，本研究以MOI1的JEV感染小鼠LC(TM3细胞)后不同时间采用荧光定量PCR(qPCR)检测TM3细胞中Toll样受体3(TLR3)、维甲酸诱导基因-I(RIG-I)、NF-k B及干扰素调节因子3(IRF3)信号通路相关蛋白基因mRNA的转录水平并确定JEV的最佳感染时间。结果显示，与空白对照组相比，JEV感染后12 h各蛋白基因mRNA的转录水平均显著升高(P0.05)，随着JEV感染时间的延长各蛋白基因mRNA转录水平逐渐降低至与空白对照组无显著差异，因此选择12 h作为后续JEV感染细胞的最佳时间。将JEV感染TM3细胞12 h后，采用westermblot检测TM3细胞中TLR3、RI G-I、其下游信号通路相关蛋白NF-kB、I RF3及NF-kB和IRF3的磷酸化水平；采用间接免疫荧光试验(IFA)检测TM3细胞中NF-kB和IRF3蛋白的入核；通过间接ELISA检测TM3细胞中睾酮的分泌水平。Westerm blot结果显示，JEV感染TM3细胞后12 h TLR3、RIG-I、NF-k B、IRF3蛋白的表达及NF-kB、IRF3的磷酸化水平均显著升高(P0.05)。IFA 结果显示，空白对照组细胞核形态完整，绿色荧光均弥散分布于细胞和细胞质之中，而JEV感染后12 h出现CPE的TM3细胞核溶解和破碎，有些细胞核变形，绿色荧光出现在细胞核中，且荧光信号明显增强。ELISA结果显示，JEV感染后12 hTM3细胞上清中IL-6、I FN-分泌水平极显著升高(P0.01)，睾酮分泌水平显著下降(P0.05)。利用TLR3和RIG-I siRNA转染TM3细胞，以千扰TLR3和RIG-I的表达，采用western blot检测这两个siRNA分别对TLR3和RIG-I的千扰效果；千扰TLR3和RIG-I表达后以MOI1的JEV感染TM3细胞，12 h后经ELISA检测细胞上清中IL-6、IFN-和睾酮的分泌水平。SiRNA干扰试验结果显示，与空白对照细胞及转染siNC的细胞相比，目的基因 siRNA转染的TM3细胞中TLR3和RIG-I蛋白的表达水平均极显著降低(P0.01)；ELISA 结果显示，与JEV感染的细胞相比，siRNA+JEV组细胞中IL-6和IFN-的含量显著或者极显著降低(IL-6：P 0.0 5；IFN-：P 0.0 1),睾酮分泌水平显著升高(P0.05)。上述结果表明JEV感染TM3细胞后能够通过刺激TLR3、RI G-I 的表达，激活NF-kB和IRF3信号通路，诱导NF-kB和IRF3的磷酸化并入核，刺激细胞炎症因子和干扰素的分泌并降低睾酮的分泌水平。本研究为深入探究JEV感染LC后引起雄性动物生殖障碍的机制奠定了基础。关键词：日本乙型脑炎病毒；NF-kB；T o l l 样受体3；炎症因子；睾酮中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 6 4-0 8Effects of JEV infection on signaling pathway,inflammatory factorsand testosterone secretion in mouse testicular interstitial cells*Corresponding author收稿日期：2 0 2 3-0 4-19基金项目：贵州大学重点项目(黔科合平台人才2 0 18 57 8 1-8)作者简介：何松(1999-)，男，贵州铜仁人，硕士研究生，主要从事动物传染病病原分子生物学研究.*通信作者：E-mail：t d y u a n 16 3.c o m第12 期何松，等.JEV感染对小鼠睾丸间质细胞信号通路、炎症因子及睾酮分泌影响的研究1265HE Song,CHEN Chang-zheng,TANG De-yuan,ZENG Zhi-yong,WANG Bin,HUANG Tao,LUO Liu,ZHOU Piao,MAO Yin-ming,LIAO Zheng-bo,CHEN Xu,YUAN Sheng-lin,HU Wen-wen,ZHOU Min(College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025,China)Abstract:In order to investigate whether inflammation occurs,the signaling pathway and testosterone secretion levels afterJapanese encephalitis virus(JEV)infects testicular interstitial cells(LC),in this study,the mRNA transcription level of the toll-likereceptor 3(TLR3),retinoic acid-inducible gene-I(RIG-I),NF-kB and signal pathway related protein genes of interferon regulatoryfactor 3(IRF3)in mouse testicular interstitial cells(TM3 cells)was detected by fluorescence quantitative PCR(qPCR)at differenttime points after MOI 1 JEV infection,and the optimal infection time of JEV were determined.The results showed that comparedwith the blank control group,the mRNA transcription levels of all tested genes were significantly increased at 12 hpi(P0.05),andthe mRNA transcription levels of each gene gradually decreased to no significant difference with the blank control group in theextension of JEV infection.Therefore,12 hours was selected as the follow-up detection time of JEV-infected cells.Follow-up testswere performed at 12 hours after post JEV infection(hpi)on infected TM3 cells.Western blot was used to detect the expressionlevel of TLR3,RIG-I,and its downstream signaling pathway-related proteins NF-kB,IRF3,as well as the phosphorylation ofNF-kB and IRF3 in TM3 cells.In addition,the nucleation of NF-kB and IRF3 proteins in TM3 cells was detected by indirectimmunofluorescence assay(IFA)and the level of testosterone secretion in TM3 cells was tested by indirect ELISA.Western blotresults showed that the expression of TLR3,RIG-I,NF-kB and IRF3 protein and the phosphorylation of NF-kB and IRF3 weresignificantly increased in TM3 cells at 12 hpi(P0.05).IFA results showed that the cell nuclei of the blank control group wereintact,and green fluorescence was dispersed in the cells and cytoplasm.However,at 12 hours after JEV infection,nucleolysis andfragmentation occurred in the TM3 cells with CPE,green fluorescence appeared in the nucleus,and the fluorescence signal wassignificantly enhanced.ELISA results showed that the secretion levels of IL-6 and IFN-in TM3 cells supernatant weresignificantly increased at 12 hpi(P0.01),while the secretion levels of testosterone were significantly decreased(P0.05).Besides,to interfere the expression of TLR3 and RIG-I,TLR3 and RIG-I siRNA were transfected into TM3 cells and the interference effectsof the two siRNA on TLR3 and RIG-I expression were detected by western blot.TM3 cells were infected with MOI 1 JEV afterinterfering the expression of TLR3 and RIG-I.After 12 hours,the secretion levels of IL-6,IFN-and testosterone in thesupernatant of the cells were detected by ELISA.The results showed that,compared with the blank control cells and cellstransfected with siNC,the expression levels of TLR3 and RIG-I protein were significantly decreased in TM3 cells transfected withtarget gene siRNA(P0.01).ELISA results showed that compared with JEV-infected cells,the amount of IL-6 and IFN-insiRNA plus JEV group were significantly decreased(IL-6:P0.05;IFN-:P0.01),testosterone secretion level was significantlyincreased(P0.05).The results indicated that JEV infected TM3 cells could activate the NF-kB and IRF3 signaling pathway bystimulating the expression of TLR3 and RIG-I,induce the phosphorylation of NF-kB and IRF3 into the nucleus,stimulate thesecretion of inflammatory factors and interferons,and reduce the secretion levels of testosterone.This study laid a foundation forfurther exploration of the mechanism of reproductive disorders in male animals caused by JEV infection on LC.Key words:Japanese encephalitis virus;NF-kB;IRF3;inflammatory factors;testosterone日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由JE病毒(JEV)感染引起的一种严重的人兽共患病，因于1934年首次于日本分离出该病原而得名。JEV在自然界中主要以人-蚊-猪的循环模式传播2-。JEV感染人类后主要表现为脑炎、脑膜炎和脊髓炎等神经系统症状，病死率高达30%，30%50%的患者存在永久性的中枢神经系统损伤后遗症4。猪是JEV最重要的自然宿主，当JEV感染猪后，母猪会流产、产死胎；公猪出现睾丸单侧或双侧肿大，精液携带病毒、丧失种用能力5。天然免疫系统是宿主抵抗外界病原侵入的第一道防线，在细胞膜上和细胞内部分布着许多模式识别受体(Pathogen recognition receptors，PRR)，当识别到病原的病原体相关分子模式(Pathogen associatedmolecular patterns，PA M P)后，宿主细胞启动下游信号级联反应诱导炎症因子和干扰素(IFN)等细胞因子1266中国预防兽医学报2023年的分泌6 。根据蛋白质结构的同源性可以将PRR分为多种类型：Toll样受体(Toll-like receptors，T LR)、维甲酸诱导基因-I(RIG-I)样受体(RIG-I-like recep-tors，RLR)、核苷酸结合寡聚结构域(NOD)样受体(NOD-like receptors，NLR)、C型凝集素受体(C-typelectin receptors，C LR)和环鸟苷酸一腺苷酸合成酶受体(Cyclic GMP-AMP synthase，c G A S)。这些PRR存在于细胞不同位置，参与识别不同的PAMP，它们是先天免疫反应的关键，也是先天和适应性免疫反应的关键调节因子7 。干扰素调节因子3(Interferon regulatory factors 3，IRF3)是调节IFN基因表达的重要蛋白质分子，作为PRR多个通路下游的信号调节因子和转录因子发挥作用，在IFN-I以及多种 IFN 刺激基因(ISG)的产生中起关键作用8 。IRF3在不同来源的细胞中普遍表达，并以静止状态存在于细胞质中，为无活性形式。在PRR感知病原后，IRF3通过TANK结合激酶1(TBK1)和/或IkB激酶(IKK8)羧基末端的磷酸化被激活，从而诱导IRF3的二聚化和磷酸化，并转运至细胞核内9。核因子kB(NF-kB)家族包含多个转录因子，因这些转录因子均能够与B细胞内的k基因中的位点结合，在细胞免疫、炎症反应等方面起关键作用10 。NF-kB主要包括5个转录因子：p50、p 52、p 6 5(Re l A)、RelB和c-Rel。这些转录因子均有相同的Re结构域使其能互相结合形成同源或异源二聚体，在正常细胞内存在多种NF-kB的抑制蛋白包括NF-kB抑制蛋白(IkB)、I k B和lkB8，统称为IkBs，他们与NF-kB形成p50/p65/lkB的聚合物并处于失活状态9。当受外界刺激时，IkBs被磷酸化，从而导致NF-kB的激活191。有研究表明JEV感染后可激活RIG-I和TLR3受体，但在JEV感染宿主细胞的过程中受体启动下游基因名称GenBank登录号Gene nameAccession No.RIG-IXM_036163986.1IRF3NM_016849.4TLR3XM_006509283.4NF-kBNM_001365067.1GAPDHNM_001411843.11.3JEV感染TM3细胞后细胞病变(CPE)的观察待六孔板中的TM3细胞生长至汇合度约8 0%后，将JEVGZ株病毒液以每孔MOI1的剂量感染，37、先天免疫相关的信号通路及信号通路的作用机制尚不清楚。因此，本研究将JEV感染小鼠睾丸间质细胞(Leydig cells，LC)(T M 3细胞)，检测JEV感染后不同时间TM3细胞中TLR3、RI G-I、NF-k B和IRF3的转录及蛋白表达水平、炎症因子及睾酮的分泌水平。干扰RIG-I和TLR3在TM3细胞中的表达，再以JEV感染，通过检测细胞中细胞因子和睾酮的分泌水平，探究JEV感染对小鼠TM3细胞激活的信号通路、炎症因子及睾酮分泌的影响。为研究JEV的致病机制提供参考依据。1材料与方法1.1主要实验材料JEVGZ株由本实验室分离鉴定并保存；TM3细胞购自武汉普诺赛生物技术公司；DMEM/F12培养基胎牛血清均购自Gibco公司；兔源RIG-I、I RF3、p-I RF3、NF-k B、p-NF-k B单克隆抗体(MAb)均购自CST公司；兔源TLR3多克隆抗体(pAb)购自Abcam公司；小鼠IL-1、IL-6、T NF-、IFN-、睾酮ELISA试剂盒，免源GAPDHMAb、H RP标记的山羊抗兔IgG(IgG-HRP)购自生工生物工程(上海)有限公司；TRIzol Universal总RNA提取试剂购自天根生化科技(北京)有限公司；RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、FITC标记的山羊抗兔IgG(H+L)、Lip o RNA i转染试剂购自碧云天生物技术(上海）有限公司；1st Strand cDNA合成试剂盒购自TaKaRa公司；FastSYBRMixture购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司。1.2引物的设计与合成根据GenBank中登录的小鼠TLR3、RI G-I、I RF3、P6 5基因，通过Primer5.0软件，分别设计引物(表1)，并由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成。表1荧光定量PCR(qPCR)引物序列Table 1 qPCR primer sequences上游引物(5-3)Forward primerATTGTCGGCGTCCACAAAGGAGAGCCGAACGAGGTTCAGCTCTGGGCTGAAGTGGACAAATTGATGGATGCTACCAAACTGGACCTCGTCCCGTAGACAAAATG下游引物(5-3)Reverse primerGTGCATCGTTGTATTTCCGCACTTCCAGGTTGACACGTCCGGAGAAGGAACCGTTGCCGACATCTGTGACTCCAGCTTATCTCTTGGTGAGGTCAATGAAGGGGTCGT5%CO,培养箱中吸附1h后弃上清液，加入含2%胎牛血清的DMEM/F12维持液于37、5%CO,继续培养，每隔6 h观察细胞的CPE。并对感染JEV的TM3第12 期何松，等.JEV感染对小鼠睾丸间质细胞信号通路、炎症因子及睾酮分泌影响的研究1267细胞连续传3代，每代均观察JEV是否能够稳定引起TM3细胞出现CPE。1.4JEV感染后TM3细胞中TLR3、RI G-I 及其下游信号通路相关蛋白基因NF-kB、I RF3m RNA 转录水平的qPCR检测待六孔板中TM3细胞贴壁生长至汇合度约8 0%后，每孔按照MOI1的剂量接种JEVGZ株病毒液，空白对照组(BC)中加入DMEM/F12,37、5%C O,条件下吸附1h后弃上清液，经PBS清洗3次后加入含2%胎牛血清的DMEM/F12维持液于37、5%CO2条件下继续培养至12 h、2 4h 和48 h时，采用TRIzol试剂提取细胞总RNA反转录为cDNA作为模板，以表1中的引物采用qPCR检测细胞中TLR3、RI G-I、NF-k B、I RF3 m RNA 的转录水平。反应条件为：952 0 s，9530 s、6 0 30 s，共40个循环；融解曲线分析，9515s、6 0 1m i n、95 15s、6 0 15s。以GAPDH基因为内参，采用2-法计算细胞中各目的基因mRNA的相对转录水平并确定JEV对TM3细胞的最佳感染时间。1.5JEV感染后TM3细胞中TLR3、RIG-I、NF-k B、IRF3蛋白的表达及NF-kB、I RF3磷酸化水平的westernblot检测按照1.4方法将JEV感染TM3细胞12h（由1.4的结果确定)后，利用RIPA裂解细胞后以12000r/min离心10 min后收集上清，分别以兔源TLR3 pAb(1:1 000)、兔源RIG-I(1:1 000)、NF-k B(1:1 000)、p-NF-k B(1:1 0 0 0)、I RF3(1:1 0 0 0)、p-I RF3(1:1 000)及GAPDH MAb(1:1 000)为一抗，以山羊抗免IgG-HRP(1:10 000)为二抗，采用western blot检测JEV感染TM3细胞后各目的蛋白的表达及NF-kB、IRF3的磷酸化水平。1.6JEV感染后TM3细胞中NF-kB和IRF3蛋白入核的间接免疫荧光试验(IFA)鉴定按照1.4方法将JEV感染TM3细胞12 h后，采用4%多聚甲醛固定细胞，分别以兔源NF-kB(1:1000)和IRF3（1:10 0 0)M A b 为一抗，以FITC标记的山羊抗兔IgG(H+L)(1:1 000)为二抗，DAPI染核后，经IFA检测NF-kB和IRF3蛋白在细胞中的定位。1.7JEV感染后TM3细胞中炎症因子及睾酮分泌水平的ELISA检测按照1.4方法将JEV感染TM3细胞12h后，收获细胞上清液，采用ELISA试剂盒分别检测IL-1、IL-6、T NF-、IFN-、睾酮的分泌水平。以标准品浓度为横坐标，OD450mm值为纵坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算细胞上清中上述细胞因子与睾酮的浓度，分析JEV感染后对TM3细胞中细胞因子及睾酮分泌水平的影响。1.8siRNA干扰TLR3、RI G-I 基因表达效果的western blot检测根据GenBank中登录的小鼠RIG-I(XM_036163986.1)及 TLR3基因(XM_006509283.4)为参考序列，由北京擎科生物科技公司设计与合成相应的siRNA序列(表2)，同时设计与靶基因无相关性的siNC作为阴性对照。表2 siRNA序列Table2siRNA sequences名称正义RNANameSense RNAsiRIG-I CUUCAGAAGCGUCUUCUAATT UUAGAAGACGCUUCUGAAGTTsiTLR3 GCAGAAGAUUCAAGGUACATT UGUACCUUGAAUCUUCUGCTTsiNCUUCUCCGAACGUGUCACGUTT ACGUGACACGUUCGGAGAATT待六孔板中的TM3细胞贴壁生长至汇合度约80%后，利用LipoRNAi转染试剂将各siRNA及siNC分别与DMEM/F12培养基充分混匀后，室温孵育20min后加入细胞培养液中，置于37、5%CO,条件下继续培养48 h时采用1.5的方法提取细胞蛋白样品，以未作任何处理的细胞作为空白对照(BC)。分别以兔源TLR3 pAb(1:1 000)、兔源RIG-I(1:1 000)MAb、兔源GAPDH（1:10 0 0)M A b 为一抗，以HRP标记的山羊抗兔IgG（1:10 0 0 0)为二抗，经westernblot检测两个siRNA分别对TLR3和RIG-I的干扰效果。1.9JEV感染干扰TLR3、RI G-I 表达后的TM3细胞中炎症因子及睾酮分泌水平的ELISA检测按照1.8的方法采用LipoRNAi试剂于TM3细胞中转染各siRNA，36h后采用MOI1的JEV感染TM3细胞(siRNA+JEV)，设感染JEV的TM3细胞作为对照组。并于转染后48 h时收获各组细胞上清液，利用相应ELISA试剂盒检测其中IL-6、I FN-和睾酮的分泌水平，分析干扰TLR3、RI G-I 表达后对上述因子分泌水平的影响。1.10数据的统计与分析采用统计分析软件GraphpadPrism8计算各组数据的平均值和标准差，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)各组实验数据的差异性。*：P0.05为差异显著；*：P0.01、*：P 0.0 0 1均为差异极显著。2 结 果2.1JJEV感染TM3细胞后的CPE的观察将JEV感染TM3细胞后每隔6 h观察细胞状态，观察可见病毒反义RNAAiti-sense RNA1268中国预防兽医学报2023年TBC感染12 h后细胞开始出现CPE，少量细胞变圆和出现空泡样病变，且细胞之间出现空隙，连接松散，随着感染时间的延长大量细胞皱缩，甚至裂解死亡，死亡细胞从细胞板上脱落。连续传3代后JEV仍能稳定引起TM3细胞出现CPE。表明JEV可稳定感染TM3细胞并在其中复制及增殖，引起TM3细胞出现CPE。2.2JEV感染后TM3细胞中TLR3、RIG-I及其下游信号通路相关蛋白基因NF-kB、I RF3m RNA 转录水平的qPCR检测结果采用qPCR方法分别检测JEV感染后12 h、2 4 h、48 h T M 3细胞中TLR3、RIG-I、NF-kB、I RF3 m RNA 的转录水平，结果显示：与空白对照细胞(BC)相比，JEV感染后12 h TM3细胞中TLR3、RI G-I、NF-k B及IRF3 mRNA的转录水平均显著或极显著升高(TLR3、RI G-I：P 0.0 5；NF-k B、IRF3：P 0.0 0 1)，随着JEV感染时间的延长各蛋白基因mRNA转录水平逐渐降低至与对照组无显著差异(图1)，因此选择12 h作为后续JEV感染的最佳时间。TLR386-42一0642-0BC 12h 24h 48hTime post infection*:P0.05;*:P0.001,the same as below.图1TLR3、RIG-I、NF-k B和IRF3基因mRNA转录水平的Fig.1 qPCR results of mRNA transcription levels of TLR3,RIG-I,2.3JEV感染后TM3细胞中TLR3、RIG-I、NF-k B、IRF3蛋白的表达及NF-kB、I RF3磷酸化水平的westernblot检测结果采用westernblot检测JEV感染后12 h TM3细胞中TLR3、RI G-I、NF-k B、I RF3蛋白的表达及NF-kB、I RF3的磷酸化水平。结果显示：与BC细胞相比，JEV感染12 h后TM3细胞中TLR3、RIG-I、NF-k B及IRF3蛋白表达水平均显著升高(P0.05)。该结果与各基因mRNA的转录水平变化趋势一致。NF-kB与IRF3蛋白的磷酸化水平也显著或极显著升高(p-NF-kB：P 0.0 5；p-I RF3：P 0.0 0 1)(图2)。表明JEV感染能够通过上调TLR3和RIG-I的表达诱导NF-kB和IRF3发生磷酸化，激活NF-kB和IRF3信号通路。Ap-IRF3NF-kBp-NF-KBTLR3RIG-IGAPDHB1.571.0RIG-1I0.5-302IRF3 p-IRF3 NF-kBp-NF-kB TLR3RIG-I1图2 各目的蛋白的表达及NF-kB、IRF3蛋白磷酸化水平的western blot检测(A)及灰度值分析(B)结果Fig.2Western blot(A)and gray value(B)analysis of proteinBC12h24h48hBC12h24h48hTime post infectionTime post infectionNF-KBIRF3*8642Bc 12h 24h 48hTime post infectionqPCR检测结果NF-B and IRF3 geneBCJEVIRF3*expression and phosphorylation levels of NF-kB and IRF32.4JEV感染后TM3细胞中NF-kB和IRF3蛋白入核*的IFA鉴定结果采用IFA鉴定JEV感染TM3细胞后NF-kB和IRF3蛋白的入核(绿色荧光为表达的目的蛋白，蓝色荧光为细胞核)。结果显示，对照组中细胞核形态完整，绿色荧光均弥散分布于细胞和细胞质中，而JEV感染12 h后TM3细胞出现CPE的细胞核核溶解和核破碎，有些细胞核变形，绿色荧光出现在细胞核，且荧光信号明显增强(图3)。表明JEV感染TM3细胞后可刺激NF-kB和IRF3入核。2.5JEV感染后TM3细胞中炎症因子及睾酮分泌水平的ELISA检测结果JJEV感染TM3细胞12 h后收集上清液，利用ELISA试剂盒检测IL-6、IFN-、IL-1和TNF-的表达水平，结果显示：细胞上清液中未检出IL-1和TNF-；与BC组相比，JEV感染TM3细胞12 h后IL-6、IFN-的分泌水平极显著升高(P0.01)(图4)；睾酮的分泌水平极显著降低(P0.01)(图4)。表明JEV感染TM3细胞后能够引起细胞炎症反应并抑-JEV第12 期何松，等.JEV感染对小鼠睾丸间质细胞信号通路、炎症因子及睾酮分泌影响的研究1269制睾酮的合成。NF-KBBC低目的蛋白的表达水平。DAPIMergeATLR3RIG-IBCsiNCsiRNAJEVBCGAPDHBMergeIRF3DAPI1.5-1.0工工*BC口siNCsiRNA0.5-工JEV0图5siRNA干扰TLR3、RIG-I表达效果的western blot检测(A)图3JEV感染后TM3细胞中NF-kB和IRF3蛋白入核的及灰度值分析(B)结果IFA鉴定结果(40 0)Fig.5Western blot(A)and gray value(B)analysis of the effect of Fig.3IFA identification of NF-kB and IRF3 protein insiRNA interference on TLR3 and RIG-I expressionTM3 nucleus after JEV infection(400 x)2.7JEV感染TLR3、RI G-I 干扰表达后的TM3细胞*300-200-Tu/ed100-0IL-6*:P0.01,the same as below.图4JEV感染后TM3细胞中炎症因子及睾酮分泌水平的ELISA检测结果Fig.4EELISA results of inflammatory cytokines and testosteronesecretion levels in TM3 cells after JEV infection2.6siRNA干扰TLR3与RIG-I表达效果的westernbolt检测结果利用western bolt检测各siRNA转染细胞中TLR3、RIG-I蛋白的表达水平，结果显示：空白的TM3细胞各目的蛋白的表达水平与对照组均无显著差异，表明转染过程中其他因素并不影响目的蛋白的表达；而TLR3、RIG-Is i RNA 转染的TM3细胞中TLR3和RIG-I蛋白的表达水平与两个对照组相比均极显著下降(P0.01)（图5)，表明TLR3和RIG-1siRNA设计合理且能够通过与靶基因结合，有效降RIG-I*中细胞因子及睾酮分泌水平的ELISA检测结果将TLR3及RIG-I siRNA分别转染TM3细胞36 h后，以BCMOI1的JEV感染12 h，收集细胞上清液，通过JEVELISA试剂盒检测IL-6、IFN-以及睾酮的分泌水平。结果显示：与JEV感染的细胞相比，siRNA+JEV组细胞中IL-6和IFN-含量显著或者极显著降低(IL-6:P0.05；IFN-：P 0.0 1)，睾酮分泌水平显著升高(P0.05)（图6)。表明JEV感染TM3细胞后引发的炎IFN-睾酮(Testostcrone)TLR3症反应和对睾酮分泌水平的抑制是通过激活TLR3、RIG-I的表达后实现的。*300200-Tu/ad100-0IL-6图6JEV感染干扰TLR3、RI G-I 表达后的TM3细胞中炎症因子及睾酮分泌水平的ELISA检测结果Fig.6 ELISA results of cytokine and testosterone secretion levels inTM3 cells after JEV infection interferes with TLR3 and RIG-I*IFN-睾酮(Testostcrone)expressionIJEV-siRNA+JEV1270中国预防兽医学报2023年3 讨 论宿主细胞中的TLR3通过激活下游诱导IFN-且含TIR域的适配蛋白(TRIF)信号分子在抗病毒天然免疫中发挥重要作用，TRIF作为TLR3的重要衔接分子，其N端结构域可以与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6)结合，促进NF-kB的激活12 ；TRIF还可以促进IKK(IkB激酶)与TBK1的结合，诱导IRF3的磷酸化进而启动IFN-I的表达。RIG-I在识别病毒dsR-NA后通过解除自身N端半胱天冬酶招募结构域(CARD)的抑制状态并与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)结合使其活化，活化的MAVS一方面招募TRAF2和TRAF6随后激活IKK复合物，导致NF-kB的激活；另一方面通过TRAF3发出信号并激活TANK/IKK/IKKs/TBK1复合物，导致IRF3的磷酸化，从而激活NF-kB和IRF3及其信号通路以调控干扰素及炎性因子的表达13。聚肌苷：聚胞苷酸poly(I:C)作为病毒复制过程中产生的一种dsRNA类似物，因其不抑制IFN的分泌水平，常被作为抗病毒反应试验的激动剂。Shang等通过poly(I:C)处理TM3细胞后，发现其能激活细胞中的TLR3，并诱导NF-kB与IRF3的磷酸化和核易位4；Zhu等采用poly(I:C)处理敲除TLR3的TM3细胞后，RIG-I诱导了IRF3的磷酸化；采用siRNA干扰RIG-I的表达后，IRF3的磷酸化被显著抑制15。表明RIG-I在诱导IRF3的磷酸化及激活IRF3信号通路过程中起着重要作用。本实验以MOI1剂量的JEV感染TM3细胞不同时间后，以qPCR、w e s t e r n b l o t 检测细胞中TLR3、RI G-I 及其下游信号通路NF-kB及IRF3mRNA转录水平及其蛋白表达水平的变化。结果显示，JEV感染TM3细胞后12 h，T LR3、RI G-I 及NF-kB、I RF3的mRNA转录和蛋白表达水平均显著升高；NF-kB与IRF3蛋白的磷酸化水平显著或极显著升高，N