NOD1基因单核苷酸多态性与牛结核病易感性相关性的研究.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202302023NOD1基因单核苷酸多态性与牛结核病易感性相关性的研究中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineVol.45,No.12Dec.2023王坤1-2，高伟娜1-2，杨霄，况修冬，赵战勤12，薛云12*（1.河南科技大学动物科技学院/洛阳市动物细菌性传染病防控技术重点实验室，河南洛阳47 10 0 3；2.河南科技大学医学技术与工程学院分子诊断实验室，河南洛阳47 10 0 3)摘要：为探究中国荷斯坦奶牛NOD1基因多态性与牛结核病(BTB)易感性的相关性，本研究以提取的BTB组(130份)与对照组(130 份)共2 6 0 份的牛全血样品基因组DNA为模板，利用PCR分段扩增NOD1基因13个外显子的编码区基因序列并测序，通过Chromas软件读取2 6 0 份全血样品每段PCR产物的测序结果，以筛选单核苷酸多态性(SNP)位点。采用SPSS.16.0软件分别统计BTB组与对照组牛NOD1基因中SNP等位基因与基因型出现频率的差异。采用卡方检验，计算各组牛中NOD1基因SNP等位基因、基因型出现频率差异的P值、OR值(风险比值)及95%CI值(95%可信区间），通过上述指标确定与BTB易感性相关的SNP位点。PCR及其产物测序结果显示：从2 6 0 份牛全血样品中均扩增到NOD115个目的基因片段并全部测序。Chromas软件筛选结果显示，从中国荷斯坦奶牛NODI基因的编码区共筛选出7 个SNP位点，其等位基因分别为C/T、A/C、T/A、G/C、C/T、C/G 和G/A。7 个SNP位点共包含18种基因型，其中4个SNP位点均包含3种基因型，均包括2 个纯合子基因型和1个杂合子基因型；3个SNP位点分别包含2 种基因型，均包括1个纯合子基因型和1个杂合子基因型。SNP位点鉴定结果显示，rs42935035等位基因T（基因型TT)和rs466132550等位基因A（基因型GA)在BTB组与对照组牛中出现的频率存在显著差异(P0.05)，且95%CI值均包含小于1大于1的范围，表明它们均不是BTB易感性相关的位点。利用RNAfold软件测定SNP位点rs42935035等位基因变为T和rs466132550等位基因变为A后mRNA二级结构的自由能(与参考NODI基因相应SNP位点等位基因相比)后NOD1基因mRNA二级结构的自由能，结果显示两者较参考序列mRNA二级结构的自由能均有所升高，表明其稳定性降低。采用ExPasy软件分析结果显示，仅rs42935035能够引起NOD1相应氨基酸的改变，当其等位基因由C变为T时，对应编码的氨基酸由半胱氨酸(Cys)变为精氨酸(Arg)，为错义突变；而rs466132550位点等位基因（由G变为A)的变化不能导致NOD1相应氨基酸的改变，为同义突变。采用SOPMA软件和AlphaFold2软件的分析结果显示，当SNP位点rs42935035的等位基因由C变为T时，NOD1蛋白质的二级结构和三级结构均未发生改变。本研究从宿主分子遗传学的角度阐述了BTB的发病机制，并提供了一种区分低风险与高风险结核病牛的新方法。关键词：牛结核病；NOD1基因；SNP；易感性中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 32-0 8Analysis of the correlation between NOD1 gene polymorphismand bovine tuberculosis susceptibilityWANG Kun-2,GAO Wei-na-,YANG Xiao,KUANG Xiu-dong”,ZHAO Zhan-qin-2,XUE Yunl.2*Corresponding author收稿日期：2 0 2 3-0 2-2 4基金项目：国家自然科学基金项目(32 0 7 2 8 99、316 7 2 530)；河南省科技公关项目(2 12 10 2 310 7 41)作者简介：王坤(1994-)，男，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事家畜传染病及其疫苗研究，*通信作者：E-mail：z h a o z h a n q i n 12 6.c o m；x u e y u n 6 6 8 8 16 3.c o m第12 期王坤，等.NOD1基因单核苷酸多态性与牛结核病易感性的相关性研究1233(1.Luoyang Key Laboratory of Prevention and Control Technology of Zoonotic Bacterious Diseases,College of Animal Science andTechnology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Laboratory of Molecular diagnosis,College of Medicaltechnology and Engineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)Abstract:In order to explore the correlation between NOD1 gene polymorphisms and bovine tuberculosis susceptibility inChinese Holstein cows,a total of 260 genomic DNA samples from the bovine tuberculosis group(130 samples)and the controlgroup(130 samples)were used as templates,and the coding region sequences of 13 exons of NOD1 gene were amplified by PCRand the amplicons were sequenced.Sequencing results of each PCR product of 260 whole blood samples were read by Chromassofiware to screen single nucleotide polymorphism(SNP)sites.The software SPSS.16.0 counted the differences in the frequencyof SNP alleles and genotypes in the NODI gene of cattle in the tuberculosis group and the control group.The chi-square test wasused to calculate the P value,OR value(risk ratio)and 95%CI value(95%confidence interval)of the SNP allele and genotype ofNODI gene in each group of cattle,and the SNP loci related to bovine tuberculosis susceptibility were determined by the aboveindicators.The 15 target fragments of NOD1 gene were successfully amplified from 260 bovine whole blood samples and were allsequenced.Results of Chromas sofware showed that a total of 7 SNP loci were screened in the coding region of NODI gene inHolstein cows in China,and their alleles were C/T,A/C,T/A,G/C,C/T,C/G and G/A,respectively.The 7 SNP loci contained atotal of 18 genotypes,of which 4 SNP loci had three genotypes,including two homozygous genotypes and one heterozygousgenotype.Each 3 SNP loci had two genotypes:one homozygous and one heterozygous genotype.The identification of SNP lociassociated with bovine tuberculosis susceptibility showed that there was a significant difference in the occurrence frequency ofrs42935035 allele T(genotype TT)and rs466132550 allele A(genotype GA)between the bovine tuberculosis group and thecontrol group(P0.05).The 95%CI values contained intervals less than 1or greater than 1,indicating that they were not loci related to bovine tuberculosis susceptibility.RNAfold software was used todetermine the free energy of the mRNA secondary structure of the NODI gene after the SNP locus rs42935035 allele was changedto T and the rs466132550 allele was changed to A(compared to the corresponding SNP allele of the reference NOD1 gene).Theresults of ExPasy software analysis showed that only rs42935035 could cause the change of NOD1 amino acid,and when its allelechanged from C to T,the NODI amino acid changed from cysteine(Cys)to arginine(Arg),which was a missense mutation.However,the change of the allele at the rs466132550 locus(from G to A)could not lead to the change of NOD1 amino acids,which is a synonymous mutation.The results of SOPMA software and AlphaFold 2 software showed that the secondary and tertiarystructure of NOD1 protein did not change when the allele of SNP site rs42935035 changed from C to T.This study elucidated thepathogenesis of bovine tuberculosis from the perspective of host molecular genetics and provided a new method to distinguishhigh-risk tuberculosis herds.Key words:bovine tuberculosis;NODI gene;SNPs;susceptibility牛结核病(Bovine tuberculosis，BT B)主要是由牛型结核分枝杆菌（Mycobacteriumbovis，M B)引起牛的一种慢性、消耗性传染病。MB还可感染人、哺乳动物和禽类-。在家畜中，牛是最易感的动物，尤其是奶牛3。世界动物卫生组织(WOAH)将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。多年来，动物结核病的研究主要侧重于病原方面，一定程度上忽视了宿主方面，特别是宿主免疫系统的遗传因素在结核病中的作用46 。基因单个点突变广泛存在于人类和动物中，称为单核苷酸多态性(Singlenucleotide polymorphism，SNP)。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。近年来，SNP与结核病易感性及结核病发病特征之间的联系逐渐引起了人们的关注。在人结核病的研究中，采用家系遗传学分析、随机病例-对照和全基因组关联分析等方法，已经证实一些SNP基因多态性位点的改变能导致结核病患病率的增加或降低，甚至会影响患者的临床症状7 。这些SNP位1234中国预防兽医学报2023年点多位于与宿主天然免疫相关的基因中18 。结核分枝杆菌为胞内寄生菌，主要寄生在宿主的巨噬细胞中。因此，机体的单核/巨噬细胞系统是抵抗结核分枝杆菌感染的第一道防线，也是最关键的一道防线9。核苷酸结合寡聚化结构域(Nucle-otide-binding oligomerization domain，NO D)样受体是一种重要的模式识别受体(Pattern-recognition recep-tors，PRR)，主要位于巨噬细胞内，是最早接触结核分枝杆菌的抗原递呈分子之一10 。NOD及其信号通路是机体产生针对结核分枝杆菌非特异性和特异性免疫应答的最重要的途径之一，其意义甚至超过了胞外受体Toll样受体家族(TLR1、T LR2、T LR6 及TLR9)。从人和哺乳动物中已发现2 0 多个NOD样受体家族的成员，其中NOD1、NO D 2 及其信号通路在抗结核免疫中起核心作用12 。结核分枝杆菌细胞壁的多种成分(如肽聚糖等)能够活化单核/巨噬细胞内的NOD1和NOD2，激活核转录因子kB（Nu c l e a rfactorkappa B，NF-k B)和丝裂原活化蛋白激酶(Mi-togen-activated protein kinase，M A PK)等，促使一系列细胞因子的表达并调控机体的免疫应答13。尽管NOD基因的多态性对人结核病易感性的影响已经逐渐明确，但关于牛NOD基因SNP与BTB相关性的研究鲜见报道。基于此，本研究以提取的BTB组(130 份)与对照组(130 份)共2 6 0 份牛全血样品基因组DNA为模板，利用PCR方法分段扩增NOD1基因的编码区，并分别测序，采用Chromas软件筛选NOD1基因编码区的SNP位点，采用软件SPSS.16.0分别统计BTB组与对照组牛NOD1基因编码区SNP的等位基因与基因型出现频率的差异。并通过两组牛NOD1基因编码区SNP出现频率差异的P值、OR值（风险比值）、9 5%CI(95%置信区间)值，鉴定与BTB易感性相关的NOD1基因SNP位点。利用生物信息学软件预测BTB易感性相关的SNP位点对NOD1基因mRNA二级结构，其编码的氨基酸序列、蛋白质二级结构、三级结构的影响，以期从宿主天然免疫基因的角度阐释BTB的分子发生机制，也为筛选天然抗结核病牛提供参考依据。1材料与方法1.1样品采集与BTB检测2 0 18 年2 0 2 1年采集华中、华北及华南部分地区奶牛养殖场的中国荷斯坦奶牛全血样品，BTB组奶牛经结核菌素变态反应试验(PPD)和ELISA反应均为阳性。采集该组130 份ED-TA抗凝血样品作为BTB组。对照组奶牛经PPD和ELISA反应均为阴性，采集该组130 份EDTA抗凝血样品作为对照组。1.2主要实验材料血液DNA提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；琼脂糖购自赛文创新(北京)生物科技有限公司；核酸染料SuperRed/GelRed购自兰杰柯科技有限公司；2 xEs Taq Master-MixDye和DL2000 DNAMarker购自北京康为世纪生物科技有限公司；50 TAE（p H 8 0)购自北京索莱宝科技有限公司。1.3引物的设计与合成根据GenBank中登录的中国荷斯坦奶牛NOD1基因序列(NC_037331.1)，利用Premier5.0软件对NOD1基因的13个外显子的编码区设计引物，分15段扩增(表1)，引物由安徽通用生物工程技术有限公司合成。表1中国荷斯坦奶牛NOD1基因13个外显子编码区的引物序列Table 1 Primer sequences of 13 exon coding regions ofNOD1 gene in Chinese Holstein cows基因名称引物序列(5-3)Gene namePrimer sequence(5-3)NODI-F1F:TCATTTGTTTCTTCAGGCGR:GAGGGGATCAGAGGAGTTTNODI-F2F:CCTTCAGGCTGTAGCATCTCACR:TACACGTAGGCAGTTCAATCACAGNODI-F3F:GCTGTGGGTTTGTCTGTCTGTGTAR:AAGAAGAACTTGATTCCTGGGTCCNODI-F4F:ACGGTGGTGGAGCTGGTCAACTTR:ACGGCGTGCTCGGGGAACATCNOD1-F5F:CTTCCTGCTGCGCTTTCCCCACACGR:CCACCCGGCCCAGCGAGCACAGNODI-F6F:CGGTGACGCTGACTGACATCTTCCTCTTR:CCGCCAGCTGCCCCACCTTTTCACNOD1-F7F:TACGAGACACAGAGTGAAAAGGR:GTGGTCATGCCCAGGATAANODI-F8F:CCATTCTCTCTGGGGGCAR:GGAAGGGCAATTTCCTGCTACTCTNOD1-F9F:CTCCACATGCCCTTCCTTTCTCCR:CTAAGCCTCACCCACAGTTCACCNOD1-F10F:GGGTCCCAGGAGAAAGAGGR:CCCAAGACTAAACCAGGAAGAANOD1-F11FF:GCCTGTTGAGATTACACACCATR:ACCACACACACAAATACCTTCCNOD1-F12F:GCCAAAGGCAAATGTAGACR:TGGAAAATCCCATAGTCAGNOD1-F13FF:GGAACACAATGAAGGAAGGGTAR:CAAGTTTTGGGGGAATAGGAGANODI-F14F:CATCATACCCTTCCAACCCCCTAR:CAGCCTTGAACTTCAGCTTCTCCNODI-F15F:GTCCCTCACTTGTGTTCTTTTTCR:CATTCCTCTGGGTGCAGATT扩增长度/bp退火温度/AmpliconAnnealingsize/bptemperature/C46655.552953441596266259067.57656333754.52835735959524553155634051625563905936858第12 期王坤，等.NOD1基因单核苷酸多态性与牛结核病易感性的相关性研究12351.4BTB组与对照组牛血液样品NOD1基因编码区的PCR扩增采用血液DNA提取试剂盒提取BTB组与对照组中国荷斯坦奶牛共2 6 0 份全血样品基因组DNA为模板经PCR扩增NODI基因的13个外显子的编码区基因。PCR反应条件：942 min；9430s，退火30 s（温度依引物而定），7 2 30 s，35个循环；7 2 2 min，4保存。PCR产物由安徽通用生物技术有限公司测序。1.5牛NOD1基因SNP位点及其等位基因、基因型的筛选通过Chromas软件(DNA序列分析软件)读取260份牛全血样品每段PCR产物的测序结果，筛选SNP位点，若对照组与BTB组牛各PCR产物测序结果的同一位点存在不同的碱基单峰或双峰(套峰)，则该位点即为SNP位点。基因型及等位基因的确定：牛的基因组是双倍体，若测序峰图为单峰，则该SNP位点只有一种碱基，其等位基因则为该碱基，其基因型则为纯合子；若测序峰图为双峰，则该SNP位点有两种碱基，其等位基因则为该两个碱基，其基因型则为杂合子。1.6BTB易感性相关SNP位点的鉴定采用软件SPSS.16.0分别统计BTB组与对照组牛NOD1基因中SNP等位基因与基因型出现频率的差异。以这两组牛NOD1基因SNP位点出现频率最高的等位基因、纯合子基因型为参考序列，以这两组牛中其他的等位基因、纯合子及杂合子基因型为变数，采用卡方检验，计算两组牛NOD1基因中SNP等位基因、基因型出现频率差异的P值、OR值及95%CI值，通过上述值确定与BTB易感性相关的SNP位点。若P0.05时二者则无显著性差异。P值最重要，P0.05后面的值则无参考意义。OR=1，表示该因素与疾病的发生无关；OR1，表示该因素是疾病易感高风险因子；OR1，表示该因素是疾病易感低风险因子。9 5%CI最高值1时，表示该因素是疾病易感高风险因子。1.7BTB易感性相关SNP位点的生物信息学分析以GenBank登录的NOD1基因(XM-005205508.5)为参考序列，采用RNAfold软件(http:/na.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)测其mRNA二级结构的自由能，同时测定其SNP位点等位基因改变后NOD1基因mR-NA二级结构的自由能，判定SNP等位基因变化后对NOD1基因mRNA二级结构的影响。采用ExPasy软件(https:/web.ExPasy.or)分析BTB易感性相关SNP位点等位基因的改变对NOD1蛋白氨基酸的影响。采用SOPMA 软 件(https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au-tomat.pl?page=npsa_sopma.html)预测牛结核病易感性相关的SNP位点对NOD1蛋白二级结构的影响；采用AlphaFold 2(https:/www.uniprot.org/)软件预测BTB易感性相关SNP位点对NOD1蛋白三级结构的影响。2 结 果2.1EBTB组与对照组牛全血样品NOD1基因编码区的PCR扩增以提取的BTB组与对照组共计2 6 0 份牛全血样品的基因组DNA为模板，采用PCR扩增奶牛NOD1基因的编码区基因序列。结果显示：从2 6 0 份牛全血样品中均扩增到NOD1基因15个编码区目的片段，均与预期大小相符(一份牛全血样品NOD1基因15个编码区的PCR扩增结果见图1)。表明，无论是健康牛还是结核病牛均能扩增到NOD1基因15个编码区的基因。2 6 0 份牛全血样品的NOD1基因15个编码区的PCR产物均由安徽通用生物技术有限公司测序。这为中国荷斯坦奶牛BTB易感性相关SNP位点的鉴定及功能分析奠定基础。M 1 M 2 M 3 M 4M5 M 6 M 7 M 8 M 9 M 10 M 11M 12 M13 M 14 M 152000bp1000bp750bp500bp250bp100bpM:DL2000 DNA Marker;1-15:Amplification of NODI gene encoding areas by PCR,respectively图1NOD1基因编码区的PCR扩增结果Fig.1Amplification of NOD1 gene coding region by PCR1236中国预防兽医学报2023年2.2牛NOD1基因SNP位点及其等位基因、基因型的筛选先通过Chromas软件读取2 6 0 份牛全血样品NOD1基因编码区的分段PCR扩增产物的测序结果，并筛选SNP位点。结果显示：在中国荷斯坦奶牛NOD1基因编码区共筛选出7 个SNP位点。通过En-sembl网站获得各SNPrs编号，分别为rs42935035、rs136134504、r s 46 6 132 550、r s 452 0 548 58、r s 110 317 7 6 0、rs382108710、r s 42 93417 1(图2)。根据1.5SNP等位基因及基因型的确定原则，确定7 个SNP位点的等位基GGCCGCAGGCCGCAGGCTGCA因分别为C/T、A/C、T/A、G/C、C/T、C/G 和G/A。7个SNP位点共包含18 种基因型，其中rs42935035、rs136134504、r s 110 317 7 6 0 和rs42934171 4个SNP位点均包含3种基因型，均包括2 个纯合子基因型和1个杂合子基因型；rs466132550、r s 452 0 548 58 和rs3821087103个SNP位点均包含2 种基因型，均包括1个纯合子基因型和1个杂合子基因型(图2)。表明NOD1基因编码区呈明显的多态性分布，具有一定的遗传多样性。CCGCAGACCGAAGACCGCAGA不CCCGCTTAT个CTrs42935035CGCTTAT不TT个AATGAGAGC个ACrs136134504TGACAGC个CC不TTCCCCGTC不ATrs466132550CCCCGTC不NoAAGGCCCTGTCCCTCTCCCCTCTCC不CGrs452054858No.CC个CC个CTTTrs110317760不CG不CCrs382108710No GGGAAGAACGAAAAACGAAAAAC不GG2.3BTB易感性相关SNP位点的鉴定SPSS.16.0分别统计BTB组与对照组牛NOD1基因不AGrs42934171图2NOD1基因SNP位点等位基因及其基因型的检测结果Fig.2Detection results of SNP allele and genotype in NOD1 gene采用软件SNP位点等位基因及基因型出现频率的差异。通过SNP位点在两组牛NOD1基因出现频率差异的P值、不AA第12 期王坤，等.NOD1基因单核苷酸多态性与牛结核病易感性的相关性研究1237OR值、95%CI值确定与BTB易感性相关的SNP位点。结果显示：rs42935035等位基因T和rs466132550等位基因A的P值在两组牛NOD1基因出现的频率存在显著差异(P0.05)，且95%CI值均包含小于1大于1的的范围(表2)，表明它们均不是BTB易感性相关的SNP位表2 7 个SNP位点等位基因在各组牛NOD1基因编码区中出现的频率及卡方检验结果Table 2Occurrence frequency and chi-square test of seven SNPs alleles of NOD1 coding region in sick and control cowsSNPs位点等位基因SNPs siteAllelers42935035CTrs136134504CArs466132550GArs452054858GCrs110317760CTrs382108710CGrs42934171GA注：C:对照组；TB：牛结核病组；下同。Notes:C:Control group;TB:Sick group,the same as below.表3NOD1基因7 个SNP位点基因型在各组牛NOD1基因编码区中出现的频率及卡方检验结果Table3Occurrence frequency and chi-square test of seven SNPs genotype of NOD1 coding region in sick and control cowsSNP位点基因型SNPs siteGenotypers42935035CCCTTTrs136134504CCACAArs466132550GGGArs452054858GGCGrs110317760CCTCTTrs382108710CCGCrs42934171GGAGAA点。基因型分析结果显示：rs42935035基因型TT和rs466132550基因型GA的P值在两组牛NOD1基因出现的频率存在显著差异(P0.05），且95%CI值均包含小于1大于1的范围(表3)。表明它们均不是BTB易感性相关的SNP位点。由此可知，只有rs42935035和rs466132550为BTB易感性相关的低风险SNP位点。个数(频率)(C)个数(频率)(TB)Quantity and frequencyQuantity and frequency149(57.57%)173(66.49%)111(42.42%)87(33.51%)187(72.06%)191(73.44%)73(27.94%)69(26.56%)244(94.12%)256(98.83%)16(5.88%)4(1.17%)252(97.01%)258(99.18%)8(2.99%)2(0.82%)176(69.4%)182(69.91%)84(30.59%)78(30.09%)224(86.21%)210(81.25%)36(13.79%)50(18.75%)153(59.09%)149(57.61%)107(40.91%)111(42.39%)数量(频率)(C)数量(频率)(TB)Quantity and frequencyQuantity and frequency47(36.36%)54(41.76%)55(42.42%)65(49.45%)28(21.21%)11(8.79%)63(48.53%)65(50.00%)61(47.06%)61(46.88%)6(4.41%)4(3.12%)115(88.24%)127(97.66%)15(11.76%)3(2.34%)122(94.03%)128(98.36%)8(5.97%)2(1.64%)62(47.76%)59(45.37%)52(43.28%)64(49.07%)16(8.95%)7(5.56%)94(72.41%)81(62.50%)36(27.59%)49(37.50%)44(33.33%)35(27.17%)67(51.51%)79(60.29%)20(15.15%)16(11.90%)P值Pvalue0.0300.6940.0490.1760.5700.2540.722P值Pvalue0.9170.0050.9020.5110.0030.0740.3230.1060.0860.3090.707风险比值OR0.6750.9250.1900.2440.8981.4681.065风险比值OR0.9720.3320.9690.6460.1810.2631.2930.4601.5801.3300.85695%置信区间95%CI0.473-0.9640.629-1.3610.055-0.6590.027-2.2150.619-1.3020.757-2.8840.752-1.50995%可信区间95%CI0.572-1.6530.169-0.8430.590-1.5920.174-2.3990.051-0.6420.055-1.2610.776-2.1560.177-1.1770.936-2.6650.767-2.3050.308-1.9281238中国预防兽医学报2023年2.4BTB易感性相关SNP位点对NOD1基因mRNA二级结构的影响利用RNAfold软件测定NOD1参考基因(XM-005205508.5，其SNP位点rs42935035的等位基因为C、r s 46 6 132 550 的等位基因为G)mRNA二级结构的自由能为-1116.8 0 Kcal/mol；利用RNAfold软件测定本研究测序获得的NOD1基因rs42935035等位基因变为T和rs466132550的等位基因变为A后mRNA二级结构的自由能分别为-1116.0 0 Kcal/mol、-1111.40 Kcal/mol（图3)；两者较NOD1参考基因mRNA二级结构的自由能均有所升高，表明本研究测序获得的NOD1基因mRNA二级结构的稳定性降低，可能会引起对应NOD1蛋白质结构的改变，进而影响NOD1的生物学功能。XM-005205508.5-1116.80Kacl/mol图3SNP位点rs42935035和rs466132550对NOD1基因mRNA二级结构的影响Fig.3 Effects of SNPs rs42935035 and rs466132550 on the mRNA secondary structure of NOD1 gene2.5BTB易感性相关SNP位点对NOD1氨基酸及蛋白质结构的影响采用ExPasy软件分析BTB易感性相关SNP位点等位基因的改变所导致NOD1蛋白氨基酸的变化，结果显示，仅rs42935035能够引起NOD1氨基酸的改变，当其等位基因由C改变为T时，其编码的对应NOD1氨基酸由半胱氨酸(Cys)变为精氨酸(Arg)，为错义突变；而rs466132550等位基因(由G变为A)并未引起其编码对应NOD1氨基酸的改变，为同义突变。采用SOPMA软件预测SNP位点对NOD1蛋白二级结构的影响，结果显示NOD1蛋白质的二级结构主要由-螺旋(Hh)(42.56%)、-折叠(Ee)(12.26%)及无规则卷曲(Cc）（45.18%)组成；当SNP位点rs42935035的等位基因由C改变为T，并导致NOD1对应编码的半胱氨酸(Cys)变为精氨酸(Arg)时，NOD1蛋白质的二级结构并未改变。采用AlphaFold2软件预测结果显示，SNP位点rs42935035等位基由C改变为T时也不能导致NOD1蛋白质三级结构的改变(图4)。表明SNP位点rs42935035等位基因的变化并未导致NOD1蛋白质二级结构和三级结构的改变，推测该SNP位点可能通过更精细的分子免疫机制调控牛结核病的发生，也与其为BTB感染的低风险rs466132550-1111.40Kacl/molSNP有关。rs42935035 C(Cys)图4SNP位点rs42935035对NOD1蛋白质三级结构的影响Fig.4Effect of SNP rs42935035 on the tertiary structure of3 讨 论结核病的发生和发展受多种因素影响，包括病原体、宿主免疫水平和环境。在这些因素中，宿主中的易感基因发挥重要作用14,2 。本研究从BTB组与对照组共计2 6 0 份牛的全血样品基因组DNA中经PCR分段扩增NOD1基因的15个外显子的编码区基因，通过Chromas软件读取2 6 0 份牛全血样品NOD1基因编码区分段PCR扩增产物的测序结果并筛选SNP位rs42935035-1116.00Kacl/molrs42935035 siteNOD proteinrs42935035 T(Arg)第12 期王坤，等.NOD1基因单核苷酸多态性与牛结核病易感性的相关性研究1239点。结果在中国荷斯坦奶牛NOD1基因编码区共筛选出7 个SNP位点，鉴定出2 个BTB易感性相