基于加权基因共表达网络分析探究养肺方治疗非小细胞肺癌的作用机制及实验验证.pdf

年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.实验研究基金项目:国家自然科学基金面上项目()北京中医药大学重点攻关项目()首都卫生发展科研专项项目()国家重点研发项目()基于加权基因共表达网络分析探究养肺方治疗非小细胞肺癌的作用机制及实验验证庄垚雪林事成刘殿娜高磊孙静宜魏佳李泉旺.北京中医药大学北京 .北京中医药大学东方医院北京 摘要:目的:基于网络药理学联合加权基因共表达网络分析()及实验验证初步探究养肺方治疗非小细胞肺癌()的作用机制 方法:在中药系统药理学数据库与分析平台()筛选养肺方组方中药的化学成分 利用中医药百科全书()预测养肺方活性成分相关靶点 运用 平台下载基因芯片 采用 归一化数据并分析差异基因 采用 进行基因模块分析并筛选疾病靶点基因利用 .软件构建的“药物 活性成分 靶点”网络并进行拓扑分析筛选有效药效成分 将 筛选出核心基因与药物靶点取交集得到治疗靶点并构建蛋白质互作()网络通过 .中的 筛选出核心治疗靶点 利用 软件进行基因本体()功能富集分析和京都基因与基因组百科全书()信号通路富集分析 只雄性 大鼠随机分为养肺方组()和空白组每组 只大鼠连续灌胃给药 天每天 次灌胃结束后腹主动脉取血制备含药血清 采用不同浓度含药血清干预人肺腺癌 细胞株后 试剂检测细胞活力 检测 蛋白激酶()、磷脂酰肌醇 激酶()蛋白表达水平实时定量荧光 分析 、表达水平 检测细胞凋亡水平结果:在 数据库中筛选出 个养肺方活性成分通过 数据库获得 个药物靶点利用 分析得到差异基因 个 基因模块分析得到核心基因 个与药物靶点取交集获得交集靶点基因 个 网络分析得到核心靶点 个 富集分析得到 个 条目及 条信号通路 检测发现养肺方含药血清浓度为 时细胞活力最差 与空白组比较养肺方组 、蛋白表达水平及、的 表达水平明显降低(.)染色阳性细胞数显著增加(.)结论:养肺方可能通过抑制/通路诱导 肿瘤细胞凋亡进而改善 关键词:非小细胞肺癌养肺方/通路细胞凋亡网络药理学加权基因共表达网络分析:./.中图分类号:.文献标志码:文章编号:().:()年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.().:().().().()().().()().:.(.)(.作为筛选标准获得养肺方的总靶点.差异基因分析运用 平台下载基因芯片 采用 归一化数据并分析差异基因差异基因筛选标准:且 倍中位数”筛选养肺方治疗 的有效药效成分.蛋白相互作用()网络的构建将 中筛选出的 基因与药物靶点取交集得到治疗靶点导入.平台进行 网络构建通过 .中的 筛选出核心治疗靶点.富集分析 利用 包进行基因本体()功能富集分析和京都基因与基因组百科全书()信号通路富集分析.包用于 转换 分析主要包括生物过程()和分子功能()及细胞组分()以.为筛选标准选取前 条 条目及 信号通路进行可视化并采用 包进行气泡图绘制.结果.养肺方活性成分及靶点 在 数据库中筛选出 个养肺方活性成分通过 数据库对活性成分靶点进行进一步预测共获得 个药物靶点表 养肺方治疗 有效药效成分信息化合物代码化合物名称度值()槲皮素()山柰酚()木犀草素()甲氧基 甲基异黄酮()谷甾醇()黄芩苷()豆甾醇()卡维定()西延胡索碱()前列腺素/合酶(/)金合欢素()()羟基 (三甲氧基苯基)铬 酮()()芝麻素()甘氨酸()松柏苷()薯蓣皂苷元()羟甲基乙醇醌()果皮酮()天竺葵素()人参皂苷().差异基因分析 运用 平台下载基因芯片 后利用 归一化数据并分析差异基因以 且 最终获得 个不同表达类型归纳的模块 模块被认为是无法被分配给任何模块的基因集合 以模块特征属性为基础计算其与临床表型关联发现 模块与吸烟表型的相关性最大其中差异基因 个相关系数为.(.及 .为筛选条件对 模块中的 个核心基因进行筛选共筛选出 个基因 将 个药物靶点与 筛选出的 个核心基因取交集获得交集靶点基因 个见图 注:标度独立性图:平均连通性图:模块特征向量聚类图:基因聚类图:模块与表型相关热图:样本聚类图:与 相关散点图:差异基因图:养肺方靶点及核心差异基因韦恩图图 图 年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.“药物 成分 靶点”网络 利用 软件构建“药物 成分 靶点”相互作用关系网络见图 该网络包括 个节点和 条边其中靶基因节点 个活性成分节点 个图 “药物 成分 靶点”网络图.网络将 个交集靶点导入 网络平台构建 网络该网络共有 个节点及 条边下载网络文件导入 软件进行可视化运用 计算核心靶点选取 值前 位的靶点得到核心靶点基因为 、见图 图 网络图及核心靶点图.富集分析 将 个基因利用 包进行 和 分析.作为筛选标准共筛选出 个 条目 个 条目(未能富集出符合标准的细胞组分)及 个 富集条目前 个条目见图 主要涉及对炎症反应的调节作用()、类固醇激素反应()、细胞对环境刺激的反应()、白 细 胞 凋 亡 过 程()等 主要涉及磷酸酶结合()、蛋白磷酸酶结合()、泛素 样蛋白连接酶结合()、泛素蛋白连接酶结合()及 聚合酶 转录因子结合()等 富集通路主要为 信号通路()、信号通路()、信号通路()、信号通路()等注:富集分析 条目气泡图:富集分析 条目气泡图:富集分析气泡图图 富集通路图 年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.基于/通路研究养肺 方 对 细胞凋亡的影响.材料.动物与细胞人肺腺癌 细胞株(浙江美森细胞科技有限公司货号:)大鼠雄性 只体质量为()购自斯贝福生物技术有限公司许可证号为(京)大鼠购回后饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心 级动物房饲养条件:温度()湿度 标准饲料喂养自由进食水昼夜 交替 本次实验得到北京中医药大学东方医院实验动物伦理委员会批准伦理审查号为.药物与试剂 养肺方(颗粒剂北京康仁堂药业有限公司)胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素/链霉素(美国 公司货号:、)高糖培养基(美国 公司货号:.)(强)裂解液(上海碧云天生物技术有限公司货号:)蛋白定量试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司货号:)试剂盒(美国 公司货号:)试剂盒(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司货号:)提取试剂(基因科技公司货号:.)检测试剂盒(北京基谱生物科技有限公司公司货号:)蛋白激酶()多克隆抗体(美国 公司货号:)磷脂酰肌醇 激酶()多克隆抗体(美国 公司货号:)山羊抗兔、山羊抗鼠(美国 公司货号:、).仪器 荧光定量 仪(美国 公司型号:)小型垂直电泳转印系统(美国 公司型号:)多功能酶标仪(美国 公司型号:).方法.含药血清制备党参 天冬 麦冬 五味子 浙贝母 清半夏 细辛 干姜 竹茹 三七 桔梗 颗粒冲泡制成浓度为 的药液 适应性喂养大鼠 随机分为养肺方组和空白组每组 只 养肺方组大鼠每日灌胃养肺方溶液空白组大鼠每日灌胃蒸馏水每日灌胃 次灌胃体积为 连续灌胃 最后 次灌胃 后腹主动脉取血末次给药灌胃前一晚禁食不禁水 腹主动脉取血离心灭菌后获得含药血清.细胞培养 培养条件为、根据实验安排将细胞随机分为对照组及养肺方组完全培养基含 胎牛血清或不同比例含药血清及 青霉素/链霉素 待细胞生长 时以 比例传代 取对数生长期的细胞进行实验.细胞活力测定 将 细胞接种到 孔板中每孔 个细胞每组设置 个重复孔并设空孔组 培养 后细胞分别用不同浓度含药血清(空白组大鼠血清、.含药大鼠血清 空白组大鼠血清、含药大鼠血清 空白组大鼠血清、含药大鼠血清 空白组大鼠血清、含药大鼠血清 空白组大鼠血清、含药大鼠血清)的培养基处理 在处理 后弃培养基并向每个孔中加入含 试剂的新鲜培养基 继续培养 后采用酶标仪检测每组细胞在 处的光密度()值计算各组细胞的细胞活力 细胞活力()(实验组 值 空白孔 值)/(对照组 值 空白孔 值).蛋白质免疫印迹分析细胞分为对照(空白组大鼠血清)组及养肺方组(含药大鼠血清 空白组大鼠血清)培养于 孔板中给药完毕后将裂解溶液加入孔中以收集样品 在 离心 后采用 蛋白浓度测定法测定各样本蛋白浓度依据测定结果将所有样本总蛋白浓度统一调至 高温煮沸 使蛋白变性以便于保存 电泳取 样本上样 恒压电泳条带至底部时停止电泳 恒流电转 已完成电泳电转的 膜加入快速封闭液封闭 结合 膜上无关蛋白反应位点加入 、稀释的 、一抗工作液及 稀释的 过夜加入 稀释 年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.的山羊抗兔(鼠)二抗室温孵育 超敏 发光液孵育后显影 软件分析条带灰度值.实时定量荧光 分析 细胞分为对照组(空白组大鼠血清)及养肺方组(含药大鼠血清 空白组大鼠血清)总 提取及浓度测定依据 提取试剂说明书完成 反转录获得 后进行扩增扩增反应体系为 上下游引物各 模版 .使用 系统检测相关 的表达反应条件:共 个循环最后一步 时记录荧光信号依程序设定溶解曲线按照 计算 的相对表达量 引物序列为:上 游 引 物:下 游 引 物:上游引物:下游引物:上游引物:下游引物:.细胞凋亡检测细胞分为对照组(空白组大鼠血清)及养肺方组(含药大鼠血清 空白组大鼠血清)分组给药后收集细胞制备细胞爬片 多聚甲醛固定 漂洗后加入 透膜液室温水平摇床孵育 漂洗后滴加 检测液 孵育 弃去检测液 漂洗滴加 试剂于湿盒内 孵育 弃掉 试剂 漂洗滴加 试剂工作液 避光孵育 漂洗爬片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂(含)封片 样本于荧光显微镜下观察每个样本随机挑选 个视野计算细胞总数及阳性细胞数 染出来的细胞核为蓝色 阳性表达的细胞为绿色.统计分析数据处理及统计图绘制选用 .构建正态分布计量资料以均数 标准差()表示两组间比较用最小显著性差异()验检多组比较采用单因素方差分析进一步两两比较采用图基法差异具用统计学意义以 .表示差异具有极显著统计学意义以.表示.结果.结果 各实验组 细胞经过 不同浓度养肺方含药血清干预后与对照组比较细胞活力明显下降(.)且不具有浓度依赖性养肺方含药血清浓度为 时细胞活力最差且具有统计学差异(.)因此后续实验选定养肺方组的药物干预方式为 含药血清 见图 及表 图 细胞活力图表 法检测细胞活力()组别细胞活力/对照组.养肺方组.养肺方组.养肺方组.养肺方组.养肺方组.注:与对照组比较 .与 养肺方组比较.养肺方降低 细胞 及 表达并诱导细胞凋亡与对照组比较养肺方组 、蛋白及、的 表达水平均降低且差异具有统计学意义(.、)见图、表 及表 与对照组比较养肺方组 染色阳性细胞数增加()见图 及表 图 /通路相关蛋白条带图 年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.表 、蛋白及 表达水平比较()组别 /对照组.养肺方组.注:与对照组比较.图 细胞凋亡图表 两组细胞凋亡率比较()组别细胞凋亡率/对照组.养肺方组.注:与对照组比较.讨论肺癌为难治性、高发性、高致死性的一类恶性肿瘤主要治疗手段仍为外科手术联合放、化疗然而放化疗在杀灭肿瘤细胞、控制与缩小肿瘤的同时其严重的毒副反应常给患者带来极大的痛苦且有效率仍不理想使患者身心受到严重的打击 因此在保证一定生存质量的前提下寻求有效延长生存期的治疗方案尤为迫切 前期临床研究表明养肺方联合治疗可延长患者生存期改善临床症状并有效提高生存质量然其作用机制尚不明晰 故本研究选用人肺腺癌细胞株 探讨养肺方抑制 发展的机制肺癌在中医中属于“积病”“癥瘕”等范畴治疗时可以扶正益气、化痰散结、养阴生津为基本治则王沛教授以沙参麦冬汤为基础方进行加减化裁以益气养阴为基础佐以扶正化痰之品最终形成以党参、麦冬、天冬、五味子、干姜、细辛、清半夏、浙贝母、竹茹、桔梗、三七粉为主要成分的养肺方 方中党参味甘、性平主归脾、肺二经具有补脾益肺、养阴生津之效补而不燥故为君药 麦冬、天冬甘寒质润主入肺经与党参同用增润肺生津之效、清甘补之燥烈故为臣药 五味子酸甘性温主入肺、肾、心经为补虚强壮收涩之要药上可敛肺止咳、下可固肾平喘、内能生津安神、外能固表止汗与党参、麦冬、天冬相合则津液得生、诸气得复正气存内而邪不可干癌多为痰、瘀互结而成故予半夏燥湿化痰、消痞散结浙贝母清热化痰、解毒散结竹茹清热化痰、止咳平喘以增强化痰散结之力然而痰邪久羁最易耗气伤血故纯用散痰消积之品唯恐耗伤肺气取张仲景“病痰饮者当以温药和之”的治疗原则以干姜、细辛温化痰饮又合五味子以敛肺止咳平喘则痰饮消、咳喘止、肺气不伤三七粉活血而不耗气、止血而 年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.不留瘀诸药相合共奏化痰散结、止咳化瘀之效共为佐药 桔梗以其升散之力载诸药上行主归肺经引诸药入肺又有宣肺化痰之效故为佐使药 半夏、贝母、三七均被证明有较好的抗肿瘤疗效然作用机制繁杂据此本研究先以加权基因共表达联合网络药理学挖掘养肺方治疗 的机制进而进行体外实验验证通过挖掘养肺方活性成分及靶点发现除中药中常见成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩苷等发挥作用薯蓣皂苷元、金合欢素及人参皂苷 同样作为主要活性成分发挥重要药理作用可以抗血管生成、抑制肿瘤细胞侵袭迁移、抗肿瘤细胞增殖并诱导肿瘤细胞凋亡且主要通过/信号通路发挥相关作用 核心靶点 、的高表 达 与 的 不 良 预 后 密 切 相 关、的高表达被证明可抑制 的发生发展 通过对交集靶点的 富集分析发现主要包括/、等通路其中/通路不仅对肿瘤细胞的增殖凋亡、侵袭迁移起到重要作用并且可以干预上下游靶点或通路以促进肿瘤细胞的增殖及相关药物耐药靶向/通路的药物部分已被批准于临床使用并取得一定疗效 在肺腺癌中 被认为可能是/通路的上游因子抑制 /信号通路可以抑制肺腺癌细胞的增殖 刘晓丽等研究发现沉默 基因表达可介导/信号通路从而抑制肾透明细胞癌侵袭转移 等研究发现/、/及 下游靶点具有相互串扰的作用 及/信号通路在肿瘤中起到协同作用/通路的高表达可以激活 通路/通路可以诱导糖原合成激酶 ()磷酸化磷酸化的 可以与 结合并促进/通路的激活进而促进肺癌的发生发展并诱导上皮间充质转化 在 中 和 的激活突变会促进肿瘤的发生发展及诱导转移同时抑制 的表达从而抑制肿瘤细胞凋亡 信号中的细胞内结构域()则可以在细胞质或细胞核内与、等途径相互作用以调节靶基因的转录 由此推断/通路为本研究富集通路中的关键通路故本研究针对/通路应用 细胞初步验证养肺方抗非小细胞肺癌的作用机制 结合/通路可以串扰其他相关通路及诱导肿瘤细胞凋亡的作用推测养肺方可能通过抑制/通路诱导细胞凋亡综上所述养肺方治疗 的主要成分分别为槲皮素、山柰酚、木犀草素、黄芩苷、薯蓣皂苷元、金合欢素及人参皂苷 主要靶点为 、主 要 通 路 包 括/、等通路 体外实验证明养肺方可以抑制 细胞活性并可能通过抑制/通路诱导肿瘤细胞凋亡 的发生发展为多条信号通路的协同串扰作用并涉及多种细胞因子本研究初步检测养肺方发挥抑癌作用的关键通路后续仍需进一步检测养肺方化合物并分析有效成分并深入探析相关信号通路间的机制进一步探究癌细胞凋亡机制依次验证活性成分 预测靶点 预测细胞通路的分子机制并进行体内验证参考文献:.():.王娟.对非小细胞肺癌预后价值的系统评价及中西药成分筛选研究.北京:中国中医科学院.:.:.():.:.():.:.():.年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.():.:.何佩珊胡凯文杨公博等.中药“养肺方”联合氩氦刀冷冻治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床研究.中华中医药杂志():.():.何佩珊冯兴中杨公博等.养肺方治疗老年晚期非小细胞肺癌氩氦刀冷冻术后并发症的临床研究.世界中医药():.():.:.:.杜毅王晓芸陈伦等.基于网络药理学探讨牛蒡子药理作用机制.中医学报():.():.孟祥文贾晓益陆志远等.基于网络药理学联合加权基因共表达网络分析探究雷公藤治疗系统性红斑狼疮的免疫作用机制.现代药物与临床():.():.:.():.():.:.():.:.():.:.():.:./.():.:.:.():.:./.:./.():.:.:.():.:.():年 月 日 第 期.中 医 学 报 第 卷 总第 期.:.():./.():./.:./.():.刘思远.基于 /通路探究肺抑瘤合剂抑制肺腺癌的临床与机制研究.济南:山东中医药大学./.:.刘晓丽庞文帅黄朝康等.基因沉默介导/信号通路对肾透明细胞癌侵袭转移的调控机制.中国药业():./.():.:.():.():./.():./.:.:.():.收稿日期:作者简介:庄垚雪()女黑龙江牡丹江人硕士研究生主要从事中西医结合肿瘤防治研究通信作者:李泉旺()男教授博士研究生导师主要从事中西医结合肿瘤防治研究 :.编辑:孙亚萍