GH∕T 1397-2022 荷花粉及其制品中荷花源成分检测 实时荧光PCR法.pdf

ICS 67.050CCS B47GH中华人民共和国供销合作行业标准GH/T 13972022荷花粉及其制品中荷花源成分检测 实时荧光PCR法Identification of lotus derived ingredients in lotus pollen and its products-Real-time PCR method2023-02-09 发布2023-03-01 实施中华全国供销合作总社 发布GH/T 13972022前言本文件按照GB/T 1.L2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起 草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华全国供销合作总社提出。本文件由全国蜂产品标准化工作组(SAC/SWG2)归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、安徽王巢食品有限公司、中检国控科技集团有限公司、中国蜂产品协会。本文件主要起草人：张紫娟、杨艳歌、刘鸣畅、张佳琳、吴亚君、王洪越、谭丽蕊、王迎春、范春 林、黄文胜、李涛、李红娜、赵磊。GH/T 13972022荷花粉及其制品中荷花源成分检测 实时荧光PCR法1范围本文件规定了荷花粉及其制品中荷花源成分检测的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于荷花粉及其制品中荷花源成分的定性检测。本文件的检出限（LOD）为1%（质量分数）。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 274032008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1荷花lotus又名莲（NelumbonuciferaGaertn.）,属睡莲科莲属多年生水生植物。3.2花粉pollen由一个营养细胞和一个至二个生殖细胞由成的显花植物的雄性种质。来源：GB/T 303592021,3,13.3荷花花粉lotus pollen工蜂采集荷花花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物质。注：包括采集产品和加工产品。3.4实时荧光 PCR real-time PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现时起始 模板的定量及定性分析。3.51GH/T 13972022Ct 值 cycle threshold value每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp：碱基对(Basepair)CTAB：十六烷基三甲基澳化钱(Cetyltrithyl ammonium bromide)dATP：脱氧腺甘三磷酸(Deoxyadenosinetriphosphate)dCTP：脱氧胞昔三磷酸(Deoxycytidinetriphosphate)dGTP：脱氧鸟甘三磷酸(Deoxyguanosinetriphosphate)DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)dNTP：脱氧核仃酸三磷酸(Deoxyribonucleosidetriphosphate)dTTP：脱氧胸背三磷酸(Deoxythymidinetriphosphate)EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylene diamine tetraacetic acid)FAM：竣基荧光素(Carboxyfluorescein)OD：光密度(Optical density)PCR：聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)TAMRA：竣基四甲基罗丹明(Carboxy-tetramethyl-rhodamine)Taq：水生栖热菌(Thermus aquaticus)Tris：三(羟甲基)氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)UNG：尿喀咤 N-糖基化酶(Uracil Nglycosylase)5方法原理提取样品DNA并以其为模板，分别以显花植物内参照NADH脱氢酶B亚基(NADH dehydrogenase subunit B,ndhB)基因和荷花内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS2)基因设计弓I物和Taqman 探针，以荷花源DNA为卬性对照.以非显花植物DNA为阴性对照，以无菌水为空白对照，进行实时 荧光PCR扩增，通过观察实时荧光PCR的增幅现象，判定样品中是否含有荷花源成分。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用 无DNA酶污染的容器分装。6.1 检测用引物和探针荷花成分和内参基因扩增引物和探针信息详见表1,荷花引物扩增的靶标序列见附录A。表1荷花粉中荷花源成分检测引物探针序列物种名称引物/探针序列扩增片段K度靶基因内参照(显花植物)F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA138 bpndhBR:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA2GH/T 13972022P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-TAMRAF：TGGACGTTGTGCACGTTGTGTTG荷花 R：CTCCGTCAACAACGGATCCCTAA 74 bpP:FAM-CATTGGGGTGTCGAGTGTGTGACCCG-TAMRAITS26.2 三氯甲烷(氯仿)。6.3异丙醇。6.4 蛋白酶K缓冲液。6.5 灭菌水：在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.6 乙醇溶液(70%,V/V)o6.7蛋白酶K(lOmg/mL)：在100 mg蛋白酶K中加入10 mL蛋白酶K缓冲液，分装成1 mL/管，-20。(：储存。6.8 NaOH溶液(10 mmol/L)：在160 mL二级水中加入80.0 g NaOH溶解后冷却至室温，再用二级 水补充至200 mLo6.9 Na2EDTA 溶液(500 mmol/L,pH 8.0)：称取 18.6 g Na2EDTA,加入 70 mL 二级水，再加入 NaOH 溶液加热至完全溶解后，冷却至室温，NaOH溶液调pH至8.0,加二级水补充至100 mL,在103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.10 Tris-HCI 溶液(1 mol/L,pH 8.0)：称取 121.1 g Tris 溶解于 800 mL 二级水，用 HCI 调 pH 8.0,加二级水补充至 1000 mL,在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.11 CTAB 提取缓冲液(pH 8.0)：称取 4.0gCTAB,16.364 g NaCI,AQA 20 mL 1 mol/L Tris-HCI 溶液(pH 8.0),8 mL 500 mmol/L NazEDTA 溶液(pH 8.0),先用 70 mL 二级水溶解，再补充至 200 mL,在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.12 CTAB沉淀液：称取LOgCTAB,0.467 g NaCI,先用70 mL二级水溶解，再补充至200 mL,在 103.4 kPa(121)灭菌 20 min。6.13实时荧光PCR反应混合液：12.5 pL反应体系包括：1 U2 U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1WCR 缓冲液、2.5 mmol/L4.0 mmol/L 的 0.2 U1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A,C,G)TPs、0.2 mmol/L-0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX染料，也可使用等效的实时荧光PCR预混液。7仪器设备7.1实时荧光PCR仪。7.2超微量分光光度计或紫外分光光度计。7.3组 织研磨器。7.4冷 冻离心机：离心力N15000g,制冷范围-20七室温。7.5 微量移液器：0.5|X10 100 20 200(JL,200 pL-1000 pLo3GH/T 139720227.6恒 温混匀仪。7.7涡 旋震荡器。7.8 pH计：精度为0.01。7.9 天平：感量 0.1g,0.01g,0.001g。8样品制备取至少50 g样品充分混匀，分成检样和留样，样品的制备应防止交叉污染和组分改变。检样混匀 后用组织研磨器粉碎，过60目样品筛，收集到15 mL离心管或密封袋中，2毛8t保存。9检测步骤9.1 实验设置每个样品应有2个平行试验，同时每次检测必须设立3个对照，对照品设置如下:a）阳性对照为荷花源性基因组DNA或包含荷花源性基因的质粒DNA；b）阴性对照为不含目标DNA片段的显花植物NADH基因；c）空白对照为灭菌水。9.2 DNA提取9.2.1样品DNA提取9.2.1.1取100 mg样品于2 mL离心管，加入1 mL CTAB提取缓冲液，同时加入10 pL 10 mg/mL蛋 白酶K溶液，颠倒混匀后置于倒。C恒温混匀仪,650“min混匀lh后,13 000 g离心10 min。9.2.1.2取80（）吐上层清液至2 mL离心管中；加入56（）卜1三氯甲烷,涡旋混匀后13 000 g离心10 min。9.2.1.3取600 rL上层清液至2 mL离心管中，加入600 pL CTAB沉淀液，泯旋混匀后13000 g离心10 min。9.2.1.4弃去上清液，加入350rL1.2 mol/LNaQ溶液，充分溶解沉淀物。9.2.1.5力口入280 rL4预冷的异丙花充分混匀，/C静置0.5h,13 000 g 4离心10 min。9.2.1.6弃去上清液，用600四4七预冷的70%乙醇洗涤沉淀物一次，13 000 g 4。（3离心10 min。9.2.1.7弃去上清液，室温下晾干。加入100 HL灭菌水，溶解沉淀物（DNA）,-20。（2保存供测。注：上述方法可使用等效植物DNA提取试剂盒提取模板DNA。9.2.2 DNA浓度和纯度的测定使用超微量分光光度计或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值A260和Azao。DNA的 浓度按照公式（1）计算：C=Ax N x 50/1000.-.（1）式（1）中：CDNA浓度，单位为纳克每微升（ng/pL）；A260 nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当A260/A280比值在L72.0时，DNA模板较适用于PCR扩增。4GH/T 139720229.3实时荧光PCR扩增9.3.1实时荧光PCR反应体系表2实时荧光PCR反应体系试剂体积实时荧光PCR反应混合液12.5|J_正向引物(10pnol/L)0.5 jX反向引物(10 pnol/L)0.5探针(lOpwl/L)0.5DNA模板(550ng/|X)5.0 无菌水补足至总体积259.3.2实时荧光PCR反应程序50 2 min；95%：预变性10 min；95 15 s,60 1 min,40个循环。具体反应程序可参考仪器型 号和试剂说明书略做调整。10质量控制以下条件有一条不满足时，实验视为无效：10.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0。10.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0。10.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值W30.0。10.4 内参基因：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值W30.0。11结果判断与表述11.1结果判定在符合10的情况下，根据两个平行试验进行结果判定：11.1.1平均Ct值W35,则判定为阳性。11.1.2平均Ct值N40,则判定为阴性。11.1.3 35平均Ct值40,则重复实验一次。再次扩增后Ct值40,则判定为阳性;平均Ct值240,则判定为阴性。11.2结果表述11.2.1 内参基因阴性，目标成分阴性，表述为“未提取到植物DNA组分”。11.2.2 内参基因阳性，目标成分阳性，表述为“检出荷花源成分”。11.2.3 内参基因阳性，目标成分阴性，表述为“未检出荷花源成分”。12检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 27403-2008中附录D的规定执行。5GH/T 13972022附录A(资料性)荷花源成分的基因扩增靶标参考序列(GenBank:FJ599761.1)CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGArGCCTGCCCCACGGAAAGACCTGTGAACATGTGATGCCCGCAAGGGCCCATGAGGGGTGGTCTTGGGGTATGACCTCCATGGCCACCTCTCGCTTGTTAGGGGTTGCTCTTGACACATTGTCTCGTGGCCTCCTAGCTAACAACCAACTCCGGGCGTGGATGGCGCCAAGGAArCTCCZYTGGAAGGGTGCATAATCCCAACATTGTTGGGTGTTTTGCCTCTATATTCAAAAAACGACTCTCGGCAACGGATArCTCGGCTCTCGCArCGATGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAAFTGCAGAArCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAGGCCTTTGGGCCAAGGGCATGCCTGCCTGGGCGTCACGCATCGTTGCCCTTCCCTCCCTTTCCCCATTAGGTGTTGGAGAGTTGGTGCAGATGTTGGCCTCTCGTTCCGTTTTGGTGCGGTTGGCCCAAATGATGGCCCCCGACAACAAAGTGCCACGACGGTTGGTGGTTCAArCTTAGGTGGTGGAATGCTGGACGTTGTGCACGTTGTGTTGTCATTGGGGTGTCGAGTGTGTGACCCGATTAGGGATCCGTTGTTGACGGAGCCTGCCTTGCGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACCCGCTGAATTTAAGCArArCAATAAGCGGAGGAAAAG注：序列方向为注：5,端下划线部分为荷花上游引物序列，3,端下划线部分为荷花下游引物序列，波浪线部分为荷花探针序列，6