SN∕T 5371-2021 国境口岸血吸虫PCR和荧光PCR检测方法.pdf

I C S1 1.0 2 0C C SC6 2中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 7 12 0 2 1 国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法D e t e c t i o n m e t h o d o f s c h i s t o s o m a b y P C R a n d r e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e P C R a t f r o n t i e r p o r t s2 0 2 1-0 6-1 8发布2 0 2 2-0 1-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法S N/T 5 3 7 12 0 2 1*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部:(0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2-7 5 3 1网址 www.c u s t o m s k b.c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0.7 5 字数2 2千字2 0 2 1年7月第一版 2 0 2 1年7月第一次印刷印数 15 0 0*书号:1 5 5 1 7 56 6 1 定价1 2.0 0元前 言 本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国成都海关、中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人:田绿波、石莹、骆星丹、何纬、黄恩炯、樊学军、辛文瀚、王俊贤。S N/T5 3 7 12 0 2 1国境口岸血吸虫P C R和荧光P C R检测方法1 范围 本文件规定了国境口岸日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫P C R和三重实时荧光P C R检测的对象、检测方法、生物安全及结果报告。本文件适用于国境口岸日本血吸虫、埃及血吸虫、曼氏血吸虫的实验室检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 S N/T 1 1 9 3 基因检验实验室技术要求 WS/T 2 3 0 临床诊断中聚合酶链反应(P C R)技术的应用3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 血吸虫 s c h i s t o s o m a 属于扁形动物门吸虫纲裂体吸虫科,也称裂体吸虫。寄生于人体的有日本血吸虫、埃及血吸虫和曼氏血吸虫等,可引起血吸虫病。其幼虫在中间宿主螺类体内发育,尾蚴通过皮肤、粘膜进入人体内,可侵及肺、胃肠道、泌尿和中枢神经系统,有些虫卵随血流进入各器官,引起各种症状,如肝肿大,严重时造成宿主死亡。日本血吸虫主要见于中国大陆、日本、中国台湾、东印度群岛和菲律宾;埃及血吸虫主要分布于非洲、南欧和中东;曼氏血吸虫主要分布于非洲和南美洲北部。血吸虫感染后会出现皮疹、发热、腹痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状,严重危害人类的健康。日本血吸虫、曼氏血吸虫成虫主要寄生于人体肠系膜下静脉,埃及血吸虫成虫主要寄生于膀胱静脉丛。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。D E P C:焦碳酸乙二酯(d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e)P AG E:聚丙烯酰胺凝胶电泳(p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s)F AM:6-羧基荧光素(6-c a r b o x y f l u o r e s c e i n)B HQ:黑洞淬灭基团(b l a c k h o l e q u e n c h e r)5 检测对象5.1 国境口岸发现的有皮疹、发热、腹痛、腹泻、乏力、肝脏不适等症状,疑似血吸虫感染病人。1S N/T5 3 7 12 0 2 15.2 来自血吸虫感染疫区人员。5.3 其他申请检验的人员。6 生物安全和P C R防污染要求 实验室生物安全和运输要求应符合G B 1 9 4 8 9的规定。P C R防污染措施按S N/T 1 1 9 3和WS/T 2 3 0的规定执行。7 主要试剂7.1 无R NA酶的D E P C水。7.2 D NA提取液(含0.9%N a C l和0.1%E D TA-N a2的混合液)。7.3 引物应用液浓度配制成2 0 m o l/L,引物和探针见表1。等效商品化试剂也可使用。表1 血吸虫P C R和实时荧光P C R检测引物及探针引物及探针名称序列(5-3)扩增片段日本血吸虫P C R检测引物S j-F 15-G G T TA T G G T T T G T T GA T G T TAG G-3S j-R 15-A C TAA T T C A C T C T C G GA C T C A C C-32 6 9 b p曼氏血吸虫P C R检测引物S m-F 15-AG T TA C T R G GAAAG G T GAAAG T G C-3S m-R 15-C A C TAAAA C A C T C C T TA TA C C R G G-33 5 0 b p埃及血吸虫P C R检测引物S h-F 15-G C G GA T GA T T T T C G T T G T TAG G-3S h-R 15-T T C AGA C T C G GAA TAG T C A C A T G G-33 9 8 b p日本血吸虫实时荧光P C R检测引物S j-F5-G G G G T T T G TA T TA TAAG T T TA T GA T G T T-3S j-R5-C A C A C GAA C AG C A C TAA T C AA T C-3S j-P5-F AM-C C AAGAA C C T C AA C C TAA C A T C AA C AA-B HQ 1-31 2 5 b p曼氏血吸虫实时荧光P C R检测引物及探针S m-F5-AG TAAG T GAGAA TAA T C G TA C G C C-3S m-R5-G GAA TAAA C A T C A TAG C A TA T T C A C A-3S m-P5-HE X-A C A C C A C T C A C AAG C T C A C T C T-B HQ 1-31 3 5 b p埃及血吸虫实时荧光P C R检测引物S h-F5-G G C A T G G T TAA TAG T R T TA T TAAGAGAG-3S h-R5-G GAA TA C T C G C AAG C AAA TA TAA C-3S h-P5-R e d 6 1 0-AG TAA T C G TA C A C C A T G T GA C TA T T C-B HQ 2-31 3 9 b p 注:引物序列中的简并碱基R表示G或A。7.4 P C R基础试剂:市售商品化试剂。7.5 电泳缓冲液(1 0T B E):称取1 0 8 g T r i s碱,7.4 4 g N a2E D TAH2O和5 5 g硼酸,溶于8 0 0 mL的d d H2O中,充分搅拌溶解后加水定容至1 L,室温保存。7.6 G o l d e n V i e w核酸染料(或其他等效核酸染料):使用浓度为5 L/5 0 mL。2S N/T5 3 7 12 0 2 18 主要仪器 主要仪器设备如下:二级生物安全柜;台式高速冷冻离心机(最高离心力1 2 0 0 0 g以上);涡旋振荡器;冰箱:4 和-2 0;超净工作台;微型离心机;P C R仪;荧光定量P C R仪;凝胶成像分析系统;电子天平(d=1 m g);微波炉;电泳仪;高压灭菌锅;超纯水器或双蒸水器;微量可调移液器一套(含以下5种规格:1 0 L、2 0 L、1 0 0 L、2 0 0 L、1 mL)。9 样品采集与运输9.1 样品采集9.1.1 粪便标本 采集新鲜粪便于一次性无菌采便管内,成形便采集5 g 8 g,水样便采集1 mL3 mL。采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检。9.1.2 尿液标本 用无菌容器采集3 mL5 mL,密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检。9.1.3 血液 用无菌容器采集2 mL3 mL抗凝血(非肝素),密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签,直接用于检测,或保存,或送检。9.2 样本的运送与保存 样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于不立即检测的样本,应保存于-2 0 及以下待检。3S N/T5 3 7 12 0 2 11 0 实验室检验1 0.1 样品处理 取黄豆大小约1 0 0 m g 2 0 0 m g的粪便,加入5 0 0 L的生理盐水,振荡混匀,制成2 0%4 0%的混悬液;或取2 mL血液,静置待自然分层,吸取上层血浆层及中层B u f f y c o a t层;或取3 mL尿液。然后1 6 2 0 0 g离心2 m i n。弃去上清。不能立即进行检测时,样本冻存于-2 0 冰箱备用。1 0.2 核酸提取 在标本的前处理沉淀中,加入1 0 0 L D NA提取液(7.2)充分混匀,沸水浴1 0 m i n(误差不超过1 m i n)。1 6 2 0 0 g 离心5 m i n,上清可直接用于P C R反应。也可以使用商品化的D NA提取试剂盒并按其说明书操作。1 0.3 空白对照和阴、阳性对照设置 检测过程中分别设空白对照和阴、阳性对照。阴性对照为不含血吸虫核酸的标本。阳性对照为日本、埃及、曼氏血吸虫阳性样本核酸,或者为克隆的日本、埃及、曼氏血吸虫部分D NA序列(必须包含扩增区域在内),序列见附录A。空白对照为d d H2O。1 0.4 P C R检测1 0.4.1 反应体系组成1 0.4.1.1 日本血吸虫反应体系为4 0 L,组成如下:M a s t e r M i x(含P C R缓冲液、d NT P、M g2+、T a p酶)干粉球 D E P C水3 5 L S j-F 1(2 0 m o l/L)0.5 L S j-R 1(2 0 m o l/L)0.5 L 模板4 L1 0.4.1.2 曼氏血吸虫反应体系为4 0 L,组成如下:M a s t e r M i x(含P C R缓冲液、d NT P、M g2+、T a p酶)干粉球 D E P C水3 5 L S m-F 1(2 0 m o l/L)0.5 L S m-R 1(2 0 m o l/L)0.5 L 模板4 L1 0.4.1.3 埃及血吸虫反应体系为4 0 L,组成如下:M a s t e r M i x(含P C R缓冲液、d NT P、M g2+、T a p酶)干粉球 D E P C水3 5 L S h-F 1(2 0 m o l/L)0.5 L S h-R 1(2 0 m o l/L)0.5 L 模板4 L1 0.4.2 P C R扩增 循环参数设置:9 4 5 m i n;9 4 1 5 s,5 8 2 0 s,7 2 3 0 s,循环4 0次;7 2 1 0 m i n;因不同P C R仪器的性能差异,可根据条件优化适当调整P C R退火温度和时间。4S N/T5 3 7 12 0 2 11 0.4.3 琼脂糖凝胶电泳 用0.5T B E电泳缓冲液配制2.0%(质量分数)的琼脂糖凝胶(含G o l d e n V i e w或其他等效核酸染料)。将琼脂糖凝胶放入水平电泳槽,使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取5 L普通R T-P C R扩增产物和1 L上样缓冲液混匀后加入糖凝胶的样品孔。在电泳时设立D NA标准分子量作对照,使用1 0 0 b p D NA 分子量标准。按8 V/c m的电压条件电泳约3 0 m i n4 0 m i n。采用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果。1 0.4.4 检验结果判断及报告1 0.4.4.1 当阳性对照出现目的片段条带,而阴性对照和空白对照没有任何核酸条带出现时才可对样本进行结果判定及报告,否则视为实验失败,需重新实验。1 0.4.4.2 本方法检验结果判定及报告如下。日本血吸虫反应体系检测样品出现2 6 9 b p条带时,报告检出日本血吸虫特异性基因(P C R法,2 6 9 b p);否则报告日本血吸虫核酸检测阴性。曼氏血吸虫反应体系检测样品出现3 5 0 b p条带时,报告检出曼氏血吸虫特异性基因(P C R法,3 5 0 b p);否则报告曼氏血吸虫核酸检测阴性。埃及血吸虫反应体系检测样品出现3 9 8 b p条带时,报告检出埃及血吸虫特异性基因(P C R法,3 9 8 b p);否则报告曼氏血吸虫核酸检测阴性。1 0.4.5 测序 对于检测阳性的样本可切下电泳分析的目的条带,用凝胶回收试剂盒回收纯化(按其说明书进行),全自动遗传分析仪进行测序,确认基因序列,也可进一步分析基因的变异情况。1 0.5 实时荧光P C R检测1 0.5.1 引物和探针 参见7.3。1 0.5.2 反应体系组成 反应体系为4 0 L,组成如下:M a s t e r M i x(含P C R缓冲液、d NT P、M g 2+、T a p酶)干粉球 D E P C水2 9.5L S j-F(2 0 m o l/L)0.6L S j-R(2 0 m o l/L)0.6 L S j-P(2 0 m o l/L)0.1 L S m-F(2 0 m o l/L)1.2 L S m-R(2 0 m o l/L)1.2 L S m-P(2 0 m o l/L)0.2 L S h-F(2 0 m o l/L)1.2 L S h-R(2 0 m o l/L)1.2 L S h-P(2 0 m o l/L)0.2 L 模板4 L5S N/T5 3 7 12 0 2 11 0.5.3 P C R扩增1 0.5.3.1 反应管置于荧光定量P C R仪上,推荐循环参数设置:3 7 2 m i n,9 4 2 m i n;9 3 1 5 s,6 0 6 0 s,循环4 0次;单点荧光检测在6 0。1 0.5.3.2 荧光通道检测选择:选择F AM、HE X和C Y 5通道。1 0.5.3.3 因不同荧光P C R仪的性能差异,可通过条件优化适当调整P C R循环的温度和时间。1 0.5.4 检验结果判断及报告1 0.5.4.1 基线和阈值设定 基线一般设定取61 5个循环,具体可根据实际情况调整,调整原则为选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域,起点避开荧光采集起始阶段的信号波动,终点比最早出现指数扩增的样本C t值减少12个循环。阈值设定原则以阈值线刚好超过空白对照品的检测荧光曲线的最高点,也可根据仪器噪音情况调整。1 0.5.4.2 质量控制 空白对照和阴性对照在F AM、V I C和C Y 5通道检测结果应为UN D E T,且无明显的扩增曲线;阳性对照在F AM、HE X和R e d 6 1 0通道检测结果C t值均3 5,且有明显的扩增曲线;否则实验视为无效。1 0.5.4.3 检测结果的判定 检测结果的判定应见表2。表2 血吸虫三重实时荧光P C R检测结果判定通道C t值结果判断F AM3 5报告为日本血吸虫荧光P C R检测阳性UN D E T或4 0检测样品低于检测限,报告为日本血吸虫荧光P C R检测阴性3 54 0待检标本C t值在3 54 0之间时,重复检测一次,若重新检测的C t值仍介于3 5和4 0之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光P C R检测,若重新检测的C t值有明显减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性HE X3 5报告为曼氏血吸虫荧光P C R检测阳性UN D E T或4 0检测样品低于检测限,报告为曼氏血吸虫荧光P C R检测阴性3 54 0待检标本C t值3 54 0之间时,重复检测一次,若重新检测的C t值仍介于3 5和4 0之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光P C R检测,若重新检测的C t值有明显减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性C Y 53 5报告为埃及血吸虫荧光P C R检测阳性UN D E T或4 0检测样品低于检测限,报告为埃及血吸虫荧光P C R检测阴性3 54 0待检标本C t值3 54 0之间时,重复检测一次,若重新检测的C t值仍介于3 5和4 0之间,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性;否则建议采用浓缩方式处理核酸样本,再重新进行荧光P C R检测,若重新检测的C t值有明显减少趋势,且曲线有明显的对数增长期,判为阳性,否则判为阴性6S N/T5 3 7 12 0 2 11 0.6 检测注意事项1 0.6.1 血液样本可检测日本血吸虫、埃及血吸虫、曼式血吸虫;粪便标本可检测日本血吸虫和曼式血吸虫;尿液标本可检测埃及血吸虫。1 0.6.2 实验室环境污染,试剂污染,样品交叉污染会出现假阳性结果;试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或检测不准确的结果。S N/T5 3 7 12 0 2 1S N/T 5 3 7 12 0 2 1附 录 A(资料性)阳性对照基因合成序列及G e n B a n k参考序列编号A.1 日本血吸虫 G e n B a n k参考序列编号:KU 1 9 6 3 7 9.1。阳性对照基因合成序列如下:G G G G T T T G TAT TATAAG T T TAT GAT G T T G TA C AT T T TAAT T T T G T C TA C T T T TA C T G G T TAT G G T T T G T T GAT G T TAG G T T GAG G T T C T T G GAAAAAG TATAGAT T GAT TAG T G C T G T T CG T G T G G C T T T T G C TAGAATAAG G T T T GAAG C TA C T T T TAT G T G T T TAG TAT TAG TAT T G GG T G T AAT ATATAAT GAT TAT G G TAAAT T G GATAT TA C T TAT T T GAT T G T TAT T G C T C C ATT AAAT T AT T T T G C T T G G T C T G T T T C T T T G C T T G C T GAAAGAAAA C G T T C T C C AT T T GAT TAT G G T GAG T C C GAGAG T GAAT TAG TA.2 曼氏血吸虫 G e n B a n k参考序列编号:HE 6 0 1 6 1 2.1。阳性对照基因合成序列如下:AG T AAG T GAGAATAAT C G TA C G C C C T TAGAT TAT G G G GAG T G T GAGAG T GAG C T T G T GAGT G G T G T AA C AG T G GAG TATAGAAG T G TAT T G T T C T TAG T GATAT T T G C T T G T GAATAT G CT AT GAT G T T TAT T C C AG T TA C T GAGAAAG G T GAAAG T G C AT G G T T T C AAT T T T C GAAG G TGAT T T T C AG TAT T T G G G T G TATAG T TAT G G TAG TAT G T T T T T TAG T TAG G G T T GAGAT T TA C G GAAT G T T T C AAAG T G G TAT C GATAG G T G G TAT G C G T TAT TATAT T T T T TAG T T G T T TT T T C T T T T T T G G G T TAT G G TATA C T G T TAT TAG G G T GAT G T T C AT GAT C TAAG TATAG G TT AAT AAG G T G TAT T C G G G T T T C T T T T T C TAAAG T GAT G T T T GAAAT GATAT T TAT G T G TAT AT T AAT C T T G T T T G G T TAT T TATAT T T T G G T TAT G G T GAT C C T G G TATAAG GAG T GT T T T AG T GA.3 埃及血吸虫 G e n B a n k参考序列编号:GU 2 5 7 3 9 2.1。阳性对照基因合成序列如下:G C G GAT GAT T T T C G T T G T TAG G T T G TATAAT T T TAAT T T C AT G T T C AG TAT C AAT G G TAGT AG T T T AT AGAT TAATAAATAG GAATATAT GAT G TAAT T GAATAT TA C T T TAT T T T T TAG T AG T AG G T T C TATAG TAAG T TATAGAA C T T TAT TAATAG G C T GAT G T T C G T GAT C AAAGT A C AG T C T AAT C AG T T C TAT T C G T G T T T C T T T T T C TAG T G T GAT G T T C GAAAT GATA C T GAT G T G C AT TATAAT T T T G T T T G G T T TAAT G TAT G G T G G T TATAGAAAA C C TAGAAT TAGAAGAG T AAT GATAT T TATAG C A C C T T TAG T T T T TAT T G C AT G G T TAATAG TAT TAT TAAGAGAGAG T AAT C G TA C A C C AT G T GA C TAT T C C GAG T C T GAAAG T GAAT TAG TAAGAG GAAT T AGAG T G GAATATAG GAGAG TAT TAT T T T TAG T TATAT T T G C T T G C GAG TAT T C C12021735 T/NS版权专有 侵权必究*书号:1 5 5 1 7 56 6 1定价:1 2.0 0元