基于流产布鲁氏菌重组BvrS蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 11 期2023 年 11 月Vol.45，No.11Nov.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202303010基于流产布鲁氏菌重组BvrS蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立田雪1,2覮，焉鑫1,4覮，范颖1,2，孙明军1，南文龙1，刘建柱2，孙淑芳1,4*，胡莉萍3*(1.中国动物卫生与流行病学中心 人兽共患病监测室，山东 青岛 266032；2.山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271000；3.山东省动物疫病预防与控制中心，山东 济南 250100；4.农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方)，山东 青岛 266032)摘要：为建立检测流产布鲁氏菌()抗体的间接ELISA方法，本研究将表达该菌BvrS蛋白的重组质粒pET28a-BvrS转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经诱导后获得了可溶性表达的重组BvrS蛋白(rBvrS)。Western blot检测结果显示，BvrS能与布鲁氏菌阳性血清结合，具有较强的反应原性，可作为建立间接ELISA(iELISA)检测方法的包被抗原。采用棋盘滴定法对以该蛋白为包被抗原的iELISA方法各条件优化，结果显示，最优的反应条件为：BvrS包被浓度为3.125 滋g/mL，4 包被过夜；商品化封闭液 37 封闭2 h；待检血清稀释度为1颐100，37 孵育1 h；辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗鼠SPG稀释度为1颐8 000，37 孵育40 min。特异性试验结果显示，除布鲁氏菌阳性血清外，该iELISA与大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱孤菌、军团菌、结核杆菌的阳性血清均无明显交叉反应；将牛布鲁氏菌阳性血清2倍倍比稀释(1颐501颐6 400)后，利用建立的iELISA检测，结果显示，该iELISA方法对阳性血清的检测限为1颐400，敏感性高于试管凝集试验(SAT)检测结果(1颐100)，该方法敏感性较高；分别利用同一批次和不同批次rBvrS包被的酶标板，按照本研究建立的方法对已知血清进行重复性试验，结果显示，批内批间重复性试验的变异系数均小于10%，该方法重复性较好。利用本实验建立的iELISA方法与国外商品化试剂盒ID-VET同时检测220份临床牛血清样品，结果显示，二者检测结果符合率为99.5%。本研究建立的iELISA方法为牛布鲁氏菌病的血清学诊断提供了可行方法。关键词：布鲁氏菌病；间接酶联免疫吸附试验；BvrS中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)11-1135-06Establishment of indirect ELISA forcoatingwith rBvrS proteinTIAN Xue1,2覮,YAN Xin1,4覮,FAN Ying1,2,SUN Ming-jun1,NAN Wen-long1,LIU Jian-zhu2,SUN Shu-fang1,4*,HU Li-ping3*(1.Division of zoonosis diseases surveillance,China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao 266032,China;2.College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian 271000,China;3.Shandong Provincial Center forAnimal Disease Control and Prevention,Jinan 250100,China;4.Key Laboratory of Animal Biosafety Risk Prevention and Control(South),Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Qingdao 266032,China)收稿日期：2023-03-06基金项目：中心科技创新基金项目(DW2021002)；国家现代农业(奶牛)产业技术体系建设专项(CARS-36)覮 共同第一作者：田雪(1998-)，女，天津人，硕士研究生，主要从事人兽共患病研究；焉鑫(1992-)，男，山东乳山人，博士，助理研究员，主要从事人兽共患病研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author;覮Equal contributorsAbstract:In order to establish an indirect ELISA serological assay for(),the recombinant plasmidpET28a-BvrS expressing BvrS protein was transformed intoBL21(DE3)receptor cells in this study,and the solubleexpressed recombinant BvrS protein(rBvrS)was obtained after induction.Western blot results showed that BvrS showed goodreactogenicity with brucellosis positive serum and could be used as an encapsulated antigen for the establishment of indirect ELISA(iELISA)assay.The conditions were optimized to establish an iELISA method using this protein as the encapsulated antigen.Theoptimal reaction conditions were as follows:BvrS encapsulation concentration of 3.125滋g/mL,overnight encapsulation at 4;commercialized blocking solution at 37for 2 hours;serum to be tested at a dilution of 1颐100 and incubated at 37for 1 hour;horseradish peroxidase(HRP)-labeled rabbit anti-mouse SPG at a dilution of 1颐8000 and incubated at 37for 40 minutes.Theresults of the specificity test showed that the iELISA had no significant cross-reactivity with positive sera of,and,except for brucellosis positive sera;the results of the sensitivity testshowed that the detection of brucellosis positive sera was negative at 1颐200 dilution of the sera,indicating a high sensitivity;theresults of the reproducibility test showed that the intra-batch and inter-batch coefficients of variation were less than 10%,whichwere good reproducible.The results of the clinical samples showed that the iELISA method established in this experiment for BvrSprotein antibodies was 99.5%consistent with the results of the foreign commercial kit ID-VET.The iELISA method established inthis study provides a feasible method for the serological diagnosis of bovine brucellosis.Key words:Brucellosis;iELISA;BvrS布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(.abortus)引起的慢性多器官损伤性人兽共患传染病。动物感染布鲁氏菌后会引起流产和不育，人感染会引起发热、肌肉和关节疼痛等，严重者完全丧失劳动能力1-2。该病严重威胁养殖业健康发展、人类食品安全和公共卫生安全。布鲁氏菌病是当前我国重点防控的人畜共患传染病之一，根据农业农村部发布的 畜间布鲁氏菌病防控五年行动方案(20222026年)，建立高通量、高灵敏度的检测方法对该病的防控具有重要意义。双组份调控系统主要参与调控细菌感知外界环境信号，通过组氨酸激酶(HK)磷酸化反应调节子(RR)完成信号转导。其中，双组分调控系统BvrS/BvrR是布鲁氏菌重要毒力因子，BvrS是位于细胞膜上的组氨酸激酶传感器，BvrR是细胞质调控蛋白3-4。研究发现，胞质调控蛋白BvrR可以直接与布鲁氏菌T4SS VirB操纵子的启动子区域结合，同时还可以激活vjbR的转录5-6。齐梦竹等对布鲁氏菌BvrS蛋白进行生物信息学分析，预测该蛋白共有23个抗原决定簇，可能具有反应原性，但尚无实验验证7。动 物 布 鲁 氏 菌 病 诊 断 技 术 国 家 标 准(GB/T18646-2018)规定了虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)等血清学诊断方法，其中iELISA是测定抗体最常用的一种方法，由于一抗有多个可结合表位，因此相对于ELISA具有更高的灵敏度与准确度8-9。但以往建立的多个iELISA方法由于检测靶蛋白抗体的不同，存在特异性差，敏感性低等缺点。因此，本研究通过原核表达制备布鲁氏菌重组BvrS蛋白(rBvrS)，利用布鲁氏菌标准阳性血清证实rBvrS具有良好的反应原性，并将该蛋白作为包被抗原，建立检测牛血清中布鲁氏菌抗体的iELISA方法，为布鲁氏菌病的诊断提供新的检测技术。1材料与方法1.1主要实验材料pET-28a(+)-BvrS/BL21(DE3)由中国动物卫生与流行病学中心人兽共患病监测室构建并保存。牛布鲁氏菌标准阳性血清和阴性血清购自中国兽医药品监察所；HRP标记的兔抗鼠SPG、HRP标记的山羊抗牛IgG(IgG-HRP)、TMB显色试剂盒、蛋白浓度定量试剂盒购自睿博兴科生物技术有限公司；Protein Ladder购自Thermo Fisher公司；布鲁氏菌ELISA抗体检测试剂盒(ID-VET)购自百沃特生物有限公司；脱脂乳购自生工生物工程(上海)有限公司；商品化封闭液、样品稀释液购自北京中科锐进科技有限公司；鱼胶、终止液购自北京索莱宝科技有限公司。330份临床血清(其中34份阴性血清来自无疫区，用于临界值确定；76份经过RBT+SAT以及病原学检测确定为阳性的牛血清用于阳性血清中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1136验证，剩余220份临床牛血清用于临床样品检测)，以及大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱孤菌、军团菌、结核杆菌阳性血清，均由中国动物卫生与流行病学中心人兽共患病监测室提供。1.2rBvrS的诱导表达、纯化及反应原性的鉴定将重组菌pET28a(+)-BvrS/BL21(DE3)37 培养至OD600nm值达0.6时加入IPTG诱导，分别在20 培养16 h和37培养4 h，取2 mL菌液经超声破碎处理后12 000 r/min离心30 min，分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达形式，以未加诱导剂的重组菌菌液为阴性对照。将表达的rBvrS利用Ni柱纯化后，经蛋白浓度定量试剂盒测定其浓度。以牛布鲁氏菌标准阳性血清(1颐100)和阴性血清(1颐100)作为一抗，山羊抗牛IgG-HRP(1颐10 000)作为二抗，经western blot鉴定rBvrS的反应原性。1.3iELISA方法反应条件的优化采用棋盘滴定法，对纯化的rBvrS包被浓度(12.5 滋g/mL、6.25 滋g/mL、3.125 滋g/mL、1.56 滋g/mL)，抗原最适包被条件(4 过夜；37 2 h后4 过夜；37 1 h；37 2 h)，牛布鲁氏菌阳性血清稀释度(1颐50、1颐100、1颐200、1颐400、1颐800、1颐1 600、1颐3 200、1颐6 400)，封闭液(4%脱脂乳的PBST溶液、含4%BSA的PBST溶液、鱼胶溶液、商品化封闭液)及其作用条件(37 1 h、37 2 h、37 3 h、37 4 h)，待检血清作用时间(30 min、60 min、90 min、120 min)，HRP标记兔抗鼠SPG浓度(1颐2 000、1颐4 000、1颐6 000、1颐8 000、1颐10 000、1颐12 000)及其作用时间(30 min、40 min、50 min、60 min)进行优化。1.4临界值的确定采用优化后的iELISA方法检测34份阴性血清，测定其OD450nm值，并计算34份阴性血清的OD450nm平均值()、标准差()。按照+2 计算出阴、阳性结果的临界值，OD450nm值大于临界值时判为阳性，否则判定为阴性。1.5特异性试验利用已建立的iELISA方法检测布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱孤菌、军团菌和结核杆菌阳性血清，以布鲁氏菌阴性血清作为阴性对照，每组血清设两个重复，按照判定标准判定实验结果，评估本研究建立方法的特异性。1.6敏感性试验将牛布鲁氏菌阳性血清2倍倍比稀释(1颐50、1颐100、1颐200、1颐400、1颐800、1颐1 600、1颐3 200、1颐6 400)，采用SAT和本研究建立的iELISA检测，每个稀释度血清做2个重复，比较二者的检测结果，评估本实验建立方法的敏感性。SAT判定：“-”无凝集物，液体均匀浑浊；“+”有凝集物沉淀，液体25%清亮；“+”菌体凝集显著，液体50%清亮；“+”菌体几乎完全凝集，上层液体75%清亮；“+”菌体完全凝集，100%下沉，上层液体100%清亮。1.7重复性试验选取3个同一批次rBvrS包被的酶标板，采用建立的iELISA方法检测3份流产布鲁氏菌阳性血清和3份阴性血清，每份样品重复检测3次，计算其变异系数CV；选取3个不同批次rBvrS包被的酶标板，采用建立的iELISA方法检测上述血清样品，每份样品重复检测3次，计算批内批间的变异系数CV，评价该方法的重复性。1.8临床样品检测取220份临床牛血清样品，利用 本 实 验 建 立 的 iELISA方 法 与 ID-VET 布 鲁 氏 菌iELISA抗体检测试剂盒同时检测，比较二者的检测结果，并计算二者的符合率。2结果2.1rBvrS 的 表 达 及 鉴 定 结 果将 pET28a-BvrS/BL21(DE3)经IPTG诱导后超声波破碎，SDS-PAGE检测结果显示，在上清和沉淀中均出现36 ku的目的条带(图1A)，20、37 上清和20 沉淀中含有较多非目的蛋白，而37 沉淀中目的蛋白量最高，且非目的蛋白少，因此选用 37 沉淀进行蛋白纯化。Ni柱纯化后获得纯度较高的重组蛋白，经测定其浓度为1.8 mg/mL。Western blot检测结果显示，在36 ku处出现特异性条带(图1B)，表明rBvrS能与牛布鲁氏菌标准阳性血清发生反应，具有良好的反应原性，可用于iELISA方法的建立。2.2iELISA方法的优化结果对该iELISA方法的优化结果显示，包被浓度在3.125 滋g/mL，待检血清比例在1颐100时，P/N值最大，所以确定rBvrS的最佳包被浓度为3.125 滋g/mL，4 包被过夜；商品化封闭液于37 封闭2 h；血清最佳稀释度为1颐100，37 孵育1 h；HRP标记的兔抗鼠SPG稀释度为1颐8 000，37 孵育40 min。2.3临界值的确定根据上述优化的iELISA抗体检测方法对34份确定的阴性血清样品检测，确定临界值，结果显示，34份阴性血清样品的 为0.270026，s为0.0791，经计算阴阳性临界值=阴性样品+2=田雪，等.基于流产布鲁氏菌重组BvrS蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立第 11 期1137A.M：Protein Marker；1：诱导前的pET28a-BvrS/BL21(DE3)总蛋白；23：20 时的上清与沉淀；45：37 时的上清与沉淀B.M：Protein Marter；1：纯化的rBvrS；2：牛布鲁氏菌病标准阳性血清；3：牛布鲁氏菌病标准阴性血清A.M:Protein Marker;1:Total protein of pET28a-BvrS/BL21(DE3)before induction;2-3:20 supernatant and precipitation;4-5:37 supernatant and precipitation;B.M:Protein Marter;1:Purified rBvrS protein;2:Bovine brucellosisstandard positive serum;3:Bovine brucellosis standard negative serum图1rBvrS原核表达的SDS-PAGE(A)、蛋白纯化及反应原性的western blot鉴定(B)A75kuM1234560ku55ku40ku25kuBM12375ku60ku55ku40ku25ku15ku0.4282。即当待检样品的OD450nm值0.4282时，判定为阳性；当待检样品的OD450nm值0.4282时，判定为阴性。所有阴性血清样品的正态分布图如图2。2.4特异性试验结果利用上述优化的iELISA方法分别检测布鲁氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱孤菌、军团菌、结核杆菌阳性血清，结果显示，除布鲁氏菌阳性血清检测结果为阳性，其它病原检测结果均为阴性(图3)，表明该检测方法的特异性较强。2.5敏感性试验结果将布鲁氏菌阳性血清2倍倍比稀释后利用该iELISA方法检测，结果显示，该iELISA方法对阳性血清的检测限为1颐400，而SAT对阳性血清的检测限为1颐100(表1)。表明该iELISA检测方法敏感性较高。2.6重复性试验结果分别选用同一批次和3个不同批次rBvrS包被的酶标板，对阳性血清、阴性血清进行批内批间重复性检测，结果显示，批内检测变异 系 数 为 6.11%9.12%，批 间 检 测 变 异 系 数 为6.83%9.99%，均小于10%(表2)。表明该iELISA检测方法重复性较好。2.7临床样品检测利用本研究建立的iELISA方法与ID-VET商品化试剂盒同时检测220份牛临床血清样品，结果显示，建立的iELISA方法检测为阳性的表1BvrS iELISA方法和SAT的敏感性试验结果阳性血清稀释度Positive serum dilution1颐501颐1001颐2001颐4001颐8001颐16001颐32001颐64001.346(+)1.217(+)0.892(+)0.510(+)0.320(-)0.172(-)0.119(-)0.103(-)+-图3BvrS iELISA方法的特异性试验结果1.51.00.50图2阴性样品结果正态分布图864200.450.340.310.270.240.230.160.23OD450nmvalueSerum中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1138BvrS iELISASAT表2BvrS iELISA方法的重复性试验结果(=3)样品序号Sample No.P1P2P3N1N2N3平均数+0.611依0.0550.583依0.0490.580依0.0350.132依0.0100.190依0.0120.202依0.012变异系数CV%9.128.396.118.176.726.32平均数+0.599依0.0440.551依0.0610.647依0.0480.165依0.0110.221依0.0310.227依0.031变异系数CV%7.428.117.516.839.999.31批内重复性试验Intra batch repeatability tese批间重复性试验Inter batch repeatability tese田雪，等.基于流产布鲁氏菌重组BvrS蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立第 11 期1139血清27份，阴性血清193份，阳性率为12.2%。商品化试剂盒ID-VET检测结果显示，阳性血清28份，阴性血清192份，阳性率为12.7%。二者的阳性符合率为96.4%，阴性符合率为100%，总符合率为99.5%(表3)。kappa是一致性检验的指标，也用于衡量分类的效果。kappa值为0.610.80表示高度的一致性，kappa值为0.811表示几乎完全一致。利用一致性计算方法，本实验kappa值为0.985，具有极高的一致性。表明本研究建立的iELISA方法可用于临床血清样品的检测。3讨论布鲁氏菌病在世界范围内危害严重，近年来我国畜间和人之间布鲁氏菌病感染率有升高趋势，给畜牧业和公共卫生健康造成巨大威胁10。控制人患布鲁氏菌病最直接有效的办法就是降低畜间布鲁氏菌病的流行率，而阐明畜间该病的发生和流行规律，正确的选择检测方法、合理使用疫苗以及对阳性动物的综合诊断均非常重要11。动物布鲁氏菌病诊断技术国家标准(GB/T 18646-2018)中规定的RBT、SAT和iELISA等血清学诊断方法，大都针对检测血清中布鲁氏菌LPS的抗体12-13。而牛种布鲁氏菌属于光滑型布鲁氏菌，光滑型布鲁氏菌LPS作为血清学诊断靶标常与耶尔森菌、大肠杆菌等病原的抗体发生交叉反应14-15。研究表明，布鲁氏菌抗原蛋白OMP10、VirB5均能够很好诱导宿主体液免疫和细胞免疫应答，且基于布鲁氏菌抗原蛋白建立的血清学检测方法已被证实具有良好的特异性和敏感性16-19。因此，亟需基于布鲁氏菌其他抗原蛋白建立牛布鲁氏菌病检测的血清学新方法。本实 验室前 期对布 鲁氏 菌双组 分调控 系 统BvrR/BvrS中的组氨酸激酶传感器BvrS经生物信息学预测分析发现，该蛋白氨基酸序列中有多个B细胞和T细胞表位7。本研究对原核表达的rBvrS进行免疫印迹检测，发现该rBvrS可以与布鲁氏菌标准阳性血清发生反应，证实rBvrS具有良好的反应原性，可以用来作为布鲁氏菌病抗体检测的诊断靶标。本研究经条件优化后建立了基于rBvrS蛋白的iELISA方法，经试验该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。利用该方法检测220份临床牛血清，与商品化试剂盒ID-VET相比，阳性符合率为96.4%；阴性符合率为100%；总符合率为99.5%。二者敏感性存在差异的原因是商品化试剂盒ID-VET的包被抗原是LPS，LPS与本研究使用的抗原BvrS引起的抗体水平在时间上可能不完全一致。流产布鲁氏菌BvrS蛋白与感知细胞内pH值和营养物质的变化有关20，但流产布鲁氏菌在感染牛的过程中，BvrS蛋白的表达及诱导机体产生抗体的时期和水平并不清楚，下一步应对BvrS蛋白在动物机体内表达调控及抗体产生的时期和水平进行系统研究，进而优化检测样品和检测的时间段，进一步完善该iELISA方法。本研究基于流产布鲁氏菌rBvrS初步建立了检测该菌抗体的iELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，为布鲁氏菌血清学检测提供了新的可行手段。参考文献：农业部兽医局.动物布鲁氏菌病防治指导手册M.北京：中国农业出版社，2012.肖 延 仁.布 鲁 氏 菌 调 控 系 统 的 研 究进 展 J.疫 病防控，2020，36(8)：4-16.表3ID-VET与BvrS iELISA对临床血清样品检测结果的比较阳性样品Positive samples阴性样品Negative samples总计Total样品数Samplenumber28192220阳性样品Positivesamples27028阴性样品Negativesamples1192192符合率(%)Coincidencerate(%)96.4%100%99.5%BvrS iELISA检测结果BvrS iELISA detection resultsID-VET检测结果ID-VET detection results血清Serum1234567891011121314151617181920MANTEROLA L,MORIYON I,MORENO E,et al.Thelipopolysaccharide of Brucella abortus BvrS/BvrR mutants con-tains lipid A modifications and has higher affinity for bacterici-dal cationic peptides J.J Bacteriol,2005,187(16):5631-5639.刘宝山.布鲁氏菌BvrR蛋白免疫活性的鉴定J.黑龙江畜牧兽医，2016，34(4)：143-144.焉鑫，李干武，胡森，等.布鲁氏菌分泌系统及其底物蛋白 的 研 究 进 展 J.中 国 预 防 兽 医 学 报，2021，43(9)：1019-1024.L譫PEZ-GO譙I I,GUZM魣N-VERRI C,MANTEROLA L,et al.Regulation of Brucella virulence by the two-component systemBvrR/BvrS J.Vet Microbiol,2002,90(1):329-339.齐梦竹.马耳他布鲁菌淄博分离株遗传进化分析及iELISA检测方法的建立D.泰安：山东农业大学，2022.曲磊，朱日宁，鞠安琪，等.基于截短绵羊鹦鹉热衣原体rMOMP183-390蛋白的间接ELISA 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