大白菜蜡质缺失突变体YW71的遗传及序列变异分析.pdf

中中 国国 瓜瓜 菜菜2024，37（1）：32-38试验研究收稿日期：2023-09-20；修回日期：2023-11-23基金项目：河南省农业科学院优秀青年科技基金（2022YQ10）；河南省自然科学基金（222300420197）；国家自然科学基金（32202485）；河南省农业科学院科技创新团队（2022TD06）；河南省重点研发专项（221111110100）；河南省农业良种联合攻关项目（2022010504）；农业农村部现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-23-G15）作者简介：杨双娟，女，副研究员，主要从事大白菜育种研究。E-mail：sjyang_通信作者：张晓伟，男，研究员，主要从事大白菜育种研究。E-mail：原玉香，女，研究员，主要从事大白菜育种研究。E-mail：植物表面的蜡质也称蜡粉，是覆盖在植物表皮细胞外的一层由亲脂性化合物构成的疏水层1-2。蜡粉的主要作用是减少非气孔的水分散失、增强植株对生物胁迫和非生物胁迫的抗性等。此外，蜡质还影响植物的生长发育，蜡质缺失相关基因的突变会引起器官融合和育性降低3-4。白菜类作物（Bras-sica rapa L.）属于十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica），包括大白菜（B.rapa subsp.pekinensis）、小白菜（B.rapa subsp.chinensis）、芜菁（B.rapa sub-sp.rapifera）、菜心（B.campestris L.chinensis var.大白菜蜡质缺失突变体 YW71 的遗传及序列变异分析杨双娟1，唐昊1，2，赵艳艳1，魏小春1，王志勇1，苏贺楠1，张文静1，李林1，王坐京1，原玉香1，张晓伟1（1.河南省农业科学院蔬菜研究所郑州450002；2.河南科技学院园艺园林学院河南新乡453003）摘要：以大白菜蜡质突变体 YW71 为对象，研究其亮绿无蜡粉性状的遗传规律和调控基因。通过遗传分析，表明YW71 中的亮绿无蜡粉性状由隐性单基因控制。通过等位基因互补实验证明 YW71 的亮绿性状是 BrWAX2 等位突变引起的。序列分析表明，在 YW71 中 BrWAX2 基因在第 3 个外显子末端发生了 39 bp 的缺失，进而引起转录水平的可变剪切和翻译水平的提前终止。表达模式分析表明，BrWAX2 基因在 YW71 茎和叶中表达量显著下降。此外，研究针对 39 bp 的变异开发并验证了共显性标记 BrWAX2-InDel1。研究结果丰富了白菜类蔬菜蜡质突变遗传资源，将为亮绿无蜡粉品种的分子育种提供理论指导和技术支持。关键词：大白菜；亮绿突变体；等位基因互补实验；序列变异分析中图分类号：S634.1文献标志码：A文章编号：1673-2871（2024）01-032-07Inheritance and sequence variation analysis of a wax-less mutant YW71in Chinese cabbage（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）YANG Shuangjuan1,TANG Hao1,2,ZHAO Yanyan1,WEI Xiaochun1,WANG Zhiyong1,SU Henan1,ZHANG Wenjing1,LI Lin1,WANG Zuojing1,YUAN Yuxiang1,ZHANG Xiaowei1（1.Institute of Vegetables,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,Henan,China;2.College of Horticulture andLandscape Architecture,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,Henan,China）Abstract:In this study,we identified a wax-less Chinese cabbage（Brassica rapa）mutant YW71,the inheritance and thecontrolling gene for the glossy trait were studied extensively.Genetic analysis indicated that the glossy trait in YW71 wascontrolled by a single recessive locus.Allelic complementary experiment showed that the glossy trait in YW71 wascaused by mutation of the gene BrWAX2.Sequence analysis revealed that a 39 bp deletion was identified at the end of thethird exon of BrWAX2,resulting in alternative splicing at the transcription level and finally leading to a premature stopcodon at the translation level.Expression analysis showed that BrWAX2 was significantly down-regulated in stems andleaves of glossy YW71.Furthermore,a co-dominant marker BrWAX2-InDel was developed and validated.Overall,theseresults enrich the genetic resources of glossy mutants and provide applicable markers for marker-assisted selection（MAS）-based breeding of Chinese cabbage,which has pivotal significance in theory and practice.Key words:Chinese cabbage;Glossy mutant;Allelic complementary experiment;Sequence variation analysisDOI：10.16861/ki.zggc.2023.061932第1期，等：遗传及序列变异分析试验研究utilis Tsen et Lee）等多个亚种和变种，拥有共同的基因组（A 基因组），相互之间杂交可以结实，没有生殖隔离，在大白菜中鉴定的优异基因可以通过杂交并回交的方式转移到菜心和小白菜中5。白菜类作物中的菜心和薹菜等以鲜嫩的茎和叶为食用器官，其叶片和茎表皮蜡质性状是一个重要商品性状。蜡质缺失蔬菜的叶片和茎部表皮覆盖蜡质极少，颜色亮绿，有光泽，商品性好，食用品质佳，感官上更鲜嫩，更受消费者喜爱6-7。但是白菜类蔬菜的蜡质性状只有在抽薹开花期才能表现出来，在选育亮绿无蜡粉材料过程中费时费力，极大地延缓了育种进程。因此，鉴定新的亮绿无蜡粉基因，并开发实用的分子标记，进而利用分子标记辅助筛选对加快亮绿无蜡粉品种的育种速度具有重要意义。目前，白菜类蔬菜中克隆了 4 个亮绿无蜡粉基因。Zhang 等8以亮绿无蜡粉 08A235-2 为亲本，克隆了 BrWAX1 基因，该基因编码 BAHD 酰基转移酶，与拟南芥 CER2 基因同源。笔者研究团队前期以亮绿无蜡粉材料 Y1211-1 为亲本，克隆了 Br-WAX2 基因，该基因编码醛脱羧酶，与拟南芥 CER1基因同源9。研究表明，Y1211-1 材料完全缺失了BrWAX2 基因，阻碍了 C30 醛向 C29 烷烃的转化，导致了烷烃物质的含量降低，并最终表现出亮绿无蜡粉表型。此外，笔者研究团队以亮绿无蜡粉材料SD369 为亲本，克隆了 BrWAX3 基因，该基因编码酮脂酰 CoA 合酶，是 AtCER60 的同源基因10。最近，Li 等11以亮绿材料 HN19-G 为亲本，通过图位克隆方式分离了一个新的蜡质基因 Brcer2，该基因编码 BAHD 酰基转移酶，影响 C28 脂肪酸的延伸。前人分离蜡质基因大多通过正向遗传学的图位克隆方式获得目的基因，并解析蜡质突变基因的序列变异方式，但是近年来涌现出很多重复性研究工作，例如 Liu 等12于 2017 报道鉴定了甘蓝的一个蜡质基因 Cgl2，该基因在甘蓝基因组中对应基因Bol013612，是拟南芥 CER4 的同源基因，该基因在突变材料 LD10GL 中发生了一个 SNP 的突变导致了功能缺失；而相同的作者于 2018 年又报道鉴定了一个蜡质基因 BoWax1，该基因同样是拟南芥CER4 的同源基因，在基因组上对应相同的基因Bol013612，只 不 过 该 基 因 在 新 的 突 变 体 材 料HUAYOU2 中发生了 2 bp 的缺失13，与之前的序列变异方式不同而已。笔者认为这种相同基因的不同等位变异方式的解析，可以先通过突变体材料的杂交确定是否是等位基因，如果是等位基因，直接对目的基因进行测序进而解析其序列变异方式，如果不是等位基因，再进行图位克隆进行目的基因分离，如此可以避免图位克隆的重复性工作，提高基因利用效率。笔者以蜡质突变体 YW71 为研究材料，通过构建遗传群体分析了 YW71 中亮绿无蜡粉性状的遗传规律，通过等位基因检测方式判断 YW71 与已知蜡质突变体的关系，克隆了 YW71 中的蜡质基因，开发了基因内的分子标记，以期为白菜类蔬菜蜡质合成的分子机制解析和亮绿无蜡粉材料的分子辅助育种提供理论和技术支持。1材料与方法1.1供试材料与遗传分析笔者的试验选用小孢子培养获得的双单倍体DH 系 YW71、R16、YW81、Y1211-1 和 SD369 为供试材料，材料均由河南省农业科学院蔬菜研究所提供。YW71 为亮绿无蜡粉材料，R16 为正常的有蜡粉材料，以 YW71 和 R16 为亲本，杂交获得 F1，进而F1自交获得 F2。2022 年 1 月 5 日将 YW71、R16 以及 F1和 F2群体种植于河南省农业科学院蔬菜研究所原阳试验田，田间统一管理，待所有材料抽薹后调查每个植株花茎、叶片上有无蜡粉，根据 F2的有蜡粉植株和亮绿无蜡粉植株的分离比例进行遗传规律分析。YW81、Y1211-1 和 SD369 均为亮绿无蜡粉材料，YW81 的亮绿表型是由 BrWAX1 基因突变引起的8，Y1211-1 的亮绿表型是由 BrWAX2 基因完全缺失造成的9，SD369 的亮绿表型是由 BrWAX3 基因第一个外显子的 5567 bp 的插入突变引起的10。笔者 的 研 究 将 YW71 分 别 与 YW81、Y1211-1 和SD369 杂交获得 F1，进而观察 F1植株花茎和叶片表面蜡粉的有无。如果两个亮绿材料的 F1表现为有蜡粉表型，则表明两个亮绿材料携带的蜡质基因不是等位基因，在基因组上位于不同的位置；如果两个亮绿材料的 F1表现为亮绿无蜡粉表型，则表明两个亮绿材料携带的蜡质基因是同一个基因，即在基因组上位于同一基因座位。1.2基因组DNA提取和目的基因克隆采集供试材料的新鲜叶片，采用 CTAB 法14提取 所 需 材 料 的 基 因 组 DNA，用 NanoDrop One（Thermo Scientific 公司）和 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量和浓度。采用 BrWAX2 全长引物 BrWAX2-g1（表 1）9扩杨双娟，等：大白菜蜡质缺失突变体YW71的遗传及序列变异分析33中国瓜菜第37卷试验研究增 YW71 的 gDNA 全长和 CDS 全长序列。扩增所用 PCR 体系为 50 L：3 LDNA 模板（100 ngL-1），25 L Phanta Flash Master Mix（2）（诺唯赞生物科技股份有限公司），上下游引物各 3 L，16 LddH2O。PCR 扩增程序为第一阶段 98 变性 30 s；第二阶段 98 变性 10 s，55 退火 5 s，72 延伸30 s，共 35 个循环；第三个阶段 72 延伸 5 min。PCR 扩增产物送公司（上海铂尚生物科技有限公司）利用 F 和 R 引物进行双向 Sanger 测序，进而获得每份材料的基因序列。获得序列利用 DNA-MAN8.0 软件进行多重序列比对。1.3RNA提取和qPCR定量分析采集 YW71 和 R16 抽薹后的叶片和茎表皮，置于液氮中速冻。采用 TaKaRa 公司 RNAiso Plus 试剂盒提取总 RNA，使用 TransScript One-Step gDNARemoval and cDNA Synthesis Kit（全式金生物技术有限公司）将 YW71 和 R16 的 RNA 反转录成 cD-NA。以 BrGAPDH 作为内参基因15-16，用引物 Br-WAX2-Qua1（表 1）9进行表达量分析。定量分析所用试剂为 TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex TaqTMII，PCR 反应在 Roche LightCycler 480II 上进行。目的基因的相对表达量采用 2-Ct方法计算。表达量显著性分析和作图利用 GraphPad Prisim 完成。1.4常规PCR扩增和检测PCR 反应体系总体积为 20 L，其中包括 3 L50 ng L-1模板 DNA，上、下游引物（10 mol L-1）各 1 L，10 L 3G Taq Master Mix（诺唯赞生物科技股份有限公司），ddH2O 5 L。PCR 反应程序为：94 预变性 5 min；94 变性 30 s，58 退火 30 s，72 延伸 30 s，34 个循环；最后 72 延伸 5 min。PCR 产物使用 9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。2结果与分析2.1材料YW71中亮绿无蜡粉性状由隐性单基因BrWAX2控制YW71 的茎和叶表现为亮绿无蜡粉（图 1），R16 的茎和叶表面被覆蜡粉（图 1），两个亲本杂交得到的 F1表现为有蜡粉表型，F2群体中有蜡粉植株102 株，无蜡粉植株 40 株，经卡平方测验符合 3 1的分离比例（2=0.76 20.05=3.84，p 0.05）。综上，遗传分析表明 YW71 中亮绿无蜡粉性状由 1 对隐性核基因控制。表 1本研究所用引物及序列Table 1Primers and sequences used in this study引物名称Primer nameBrWAX2-g1BrWAX2-P2BrWAX2-P3BrWAX2-Qua1BrWAX2-InDel1BrGAPDH正向引物序列（5-3）Forward primer sequence（5-3）ATGGCTACGAAACCAGGCATCCTCACATGGCTACGAAACCAGGCATCCTCACCCTCTTTCCTCCTCTCAAGTTCACAGTTCCCCCTCAAGCAGTGGCTCCACAAAGCTCTTCACCAGAGCCGCTTCCTTCAACATCATT反向引物序列（5-3）Reverse primer sequence（5-3）TCAGGGGTATTGGAAGTGATGTGGAAGCGAACTTGAGAGGAGGAAAGAGGTCAGGGGTATTGGAAGTGATGTGGAAGCCATGCATTTCCCATCCTTCTCGTTGTCAACAATGGTATGGCGTGGGCACACGGAAGGACATACC图 1YW71 的蜡质表型特征及遗传分析Fig.1Phenotypic characterization and inheritance analysis the wax trait in YW71R16YW71Y1211-1（YW71Y1211-1）F134第1期，等：遗传及序列变异分析试验研究102030405060708090100110120130140150.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAATGGCTACGAAACCAGGCATCCTCACCGATTGGCCTTGGACACCCCTTGGGAATTTCAAGGTGCATTATTTTTTCTTTCTCTCTTTGCTTTGTCTATTTAATTATTATATATATTGTTCTACTAAAAAACACTATTACATAGTATATATA 150YW71-gDNAATGGCTACGAAACCAGGCATCCTCACCGATTGGCCTTGGACACCCCTTGGGAATTTCAAGGTGCATTATTTTTTCTTTCTCTCTTTGCTTTGTCTATTTAATTATTATATATATTGTTCTACTAAAAAACACTATTACATAGTATATATA 150R16-CDSATGGCTACGAAACCAGGCATCCTCACCGATTGGCCTTGGACACCCCTTGGGAATTTCAAG-60Yw71-CDSATGGCTACGAAACCAGGCATCCTCACCGATTGGCCTTGGACACCCCTTGGGAATTTCAAG-60160170180190200210220230240250260270280290300.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAGGTTGCACAAAAAAATATAGTATATATATATAACTCGTGCTTATGATCGAATCCCGTTTCTGATGCATGATATGGTACGTGGAAACAATTAATACAATAGTACATAGTAATAGCACCATGGGCGGTCCATAGCACATACAGGTTTGTGAC 300YW71-gDNAGGTTGCACAAAAAAATATAGTATATATATATAACTCGTGCTTATGATCGAATCCCGTTTCTGATGCATGATATGGTACGTGGAAACAATTAATACAATAGTACATAGTAATAGCACCATGGGCGGTCCATAGCACATACAGGTTTGTGAC 300R16-CDS-TACATAGTAATAGCACCATGGGCGGTCCATAGCACATACAGGTTTGTGAC 110Yw71-CDS-60310320330340350360370380390400410420430440450.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNATGATGATCCGGTGGATCTCGGATACTCCCTCGTATTACCCTTCTTGCTCTTCAGAATTCTTCACAACCAGGTTTGGATCTCTCTTTCCCGTTACTATACAACCAAGGGAAAGAGGCGCATCCTGGACAAAGGTATCGACTTCAATCAGGT 450YW71-gDNATGATGATCCGGTGGATCTCGGATACTCCCTCGTATTACCCTTCTTGCTCTTCAGAATTCTTCACAACCAGGTTTGGATCTCTCTTTCCCGTTACTATACAACCAAGGGAAAGAGGCGCATCCTGGACAAAGGTATCGACTTCAATCAGGT 450R16-CDSTGATGATCCGGTGGATCTCGGATACTCCCTCGTATTACCCTTCTTGCTCTTCAGAATTCTTCACAACCAGGTTTGGATCTCTCTTTCCCGTTACTATACAACCAAGGGAAAGAGGCGCATCCTGGACAAAGGTATCGACTTCAATCAGGT 260Yw71-CDS-60460470480490500510520530540550560570580590600.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNACGACAGGGAGACCAACTGGTGCGTTTTCTACTTTGTTTGTCATTTTATATAACTGCGTCGTTTGTGCTTTATGCGAGCTAAGTATGTATTCTTGATATTTACACGCGCAGGGATGACCAAATATTGTTCAACGGATTGCTGTTCTATATA 600YW71-gDNACGACAGGGAGACCAACTGGTGCGTTTTCTACTTTGTTTGTCATTTTATATAACTGCGTCGTTTGTGCTTTATGCGAGCTAAGTATGTATTCTTGATATTTACACGCGCAGGGATGACCAAATATTGTTCAACGGATTGCTGTTCTATATA 600R16-CDSCGACAGGGAGACCAACTG-GGATGACCAAATATTGTTCAACGGATTGCTGTTCTATATA 318Yw71-CDS-60610620630640650660670680690700710720730740750.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAGGGATCATGCTGCTGCCGCAGGCGAAGCAACTTCCCTTGTGGAGGACAGACGGAGTGTTGATGGCGGCGATGCTTCACGCCGGGCCGGTGGAGTTCCTCTATTATTGGCTCCACAAAGCTCTTCACCACCACTTTCTTTACTCCCGCTAC 750YW71-gDNAGGGATCATGCTGCTGCCGCAGGCGAAGCAACTTCCCTTGTGGAGGACAGACGGAGTGTTGATGGCGGCGATGCTTCACGCCGGGCCGGTGGAGTTCCTCTATTATTGGCTCCACAAAGCTCTTCACCACCACTTTCTTTACTCCCGCTAC 750R16-CDSGGGATCATGCTGCTGCCGCAGGCGAAGCAACTTCCCTTGTGGAGGACAGACGGAGTGTTGATGGCGGCGATGCTTCACGCCGGGCCGGTGGAGTTCCTCTATTATTGGCTCCACAAAGCTCTTCACCACCACTTTCTTTACTCCCGCTAC 468Yw71-CDS-60760770780790800810820830840850860870880890900.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNACATTCCCACCACCACTCCTCTATCGTCACTGAGCCCATCACTTGTAACTCTTATTTCTTATCTTTTATAATTTCCATCCAACATACGTAAAGTACACTTTTTCACGTCTAATTAGTAATATATATTTTAATCATTATATGCAGCGGTGAT 900YW71-gDNACATTCCCACCACCACTCCTCTATCGTCACTGAGCCCATC-CAACATACGTAAAGTACACTTTTTCACGTCTAATTAGTAATATATATTTTAATCATTATATGCAGCGGTGAT 861R16-CDSCATTCCCACCACCACTCCTCTATCGTCACTGAGCCCATCACTT-CGGTGAT 518Yw71-CDS-CGGTGAT 67910920930940950960970980990100010101020103010401050.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAACATCCATTTGCGGAGCATATAGCATACTTCATTCTTTTCGCCATACCATTGTTGACAACGTTGTTAACGAGAACGGCATCCATAGCGTCTTTCGCCGGATATGTAATCTACATAGACTTCATGAACAACATGGGACACTGCAACTTCGA 1050YW71-gDNAACATCCATTTGCGGAGCATATAGCATACTTCATTCTTTTCGCCATACCATTGTTGACAACGTTGTTAACGAGAACGGCATCCATAGCGTCTTTCGCCGGATATGTAATCTACATAGACTTCATGAACAACATGGGACACTGCAACTTCGA 1011R16-CDSACATCCATTTGCGGAGCATATAGCATACTTCATTCTTTTCGCCATACCATTGTTGACAACGTTGTTAACGAGAACGGCATCCATAGCGTCTTTCGCCGGATATGTAATCTACATAGACTTCATGAACAACATGGGACACTGCAACTTCGA 668Yw71-CDSACATCCATTTGCGGAGCATATAGCATACTTCATTCTTTTCGCCATACCATTGTTGACAACGTTGTTAACGAGAACGGCATCCATAGCGTCTTTCGCCGGATATGTAATCTACATAGACTTCATGAACAACATGGGACACTGCAACTTCGA 217106010701080109011001110112011301140115011601170118011901200.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAGCTCGTCCCTAAGCGACTTTTCCACCTCTTTCCTCCTCTCAAGTTCCTCTGCTACACTCCTTCGTATGTCCTTGCACTTCCGTCTTTCTATATATATACATAAATATTTATATATATATATCTCCTATATATTATTTGAGAAGCATTACA 1200YW71-gDNAGCTCGTCCCTAAGCGACTTTTCCACCTCTTTCCTCCTCTCAAGTTCCTCTGCTACACTCCTTCGTATGTCCTTGCACTTCCGTCTTTCTATATATATACATAAATATTTATATATATATATCTCCTATATATTATTTGAGAAGCATTACA 1161R16-CDSGCTCGTCCCTAAGCGACTTTTCCACCTCTTTCCTCCTCTCAAGTTCCTCTGCTACACTCCTTC-731Yw71-CDSGCTCGTCCCTAAGCGACTTTTCCACCTCTTTCCTCCTCTCAAGTTCCTCTGCTACACTCCTTC-280121012201230124012501260127012801290130013101320133013401350.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAACATATTTTTTGTAGTTACGTGTCATCACTAGAATGATTCTTAGAATCTTTAGAGAAATATGTTAGTCCATCTAAATATATAATAAACTTTTTATTAAACTAACCATAAATACATTATTAATGTGCTTTATTATTTCCATAAATTAAATT 1350YW71-gDNAACATATTTTTTGTAGTTACGTGTCATCACTAGAATGATTCTTAGAATCTTTAGAGAAATATGTTAGTCCATCTAAATATATAATAAACTTTTTATTAAACTAACCATAAATACATTATTAATGTGCTTTATTATTTCCATAAATTAAATT 1311R16-CDS-731Yw71-CDS-280136013701380139014001410142014301440145014601470148014901500.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|.|R16-gDNAACAGAATTACCTAATATGGCTAAAGTATATATGACAATTAATGAATTTAAATAATAAAGATTTGATAAAAATAAGTATATCTTATATTATATTTGTTTAATTTTAAACTATTACAATAAATTAAACAACCATAGTAGTCATTTAATAAAA 1500YW71-gDNAACAGAATTACCTAATATGGCTAAAGTATATATGACAATTAATGAATTTAAATAATAAAGATTTGATAAAAATAAGTATATCTTATATTATATTTGTTTAATTTTAAACTATTACAATAAATTAAACAACCATAGTAGTCATTTAATAAAA 1461R16-CDS-731YW81、Y1211-1 和 SD369 均为亮绿无蜡粉材料，携带的蜡质基因分别是 BrWAX1、BrWAX2 和BrWAX3。为了明确 YW71 携带的蜡质基因是否与上述 3 份亮绿无蜡粉材料携带的蜡质基因一样，将YW71 和这 3 份材料分别杂交获得 F1。结果表明，YW71 和 YW81 杂交得到的 F1植株表现为正常有蜡粉表型，（YW71SD369）F1也表现为正常有蜡粉表型，但是 YW71 和 Y1211-1 的杂交 F1植株表现为亮绿无蜡粉表型（图 1），表明 YW71 和 Y1211-1 携带蜡质基因相同，均是由 BrWAX2 基因突变引起的亮绿表型。2.2YW71 中亮绿无蜡粉 性 状 由 BrWAX2 基 因39 bp 缺失引起为了探明亮绿材料 YW71 中 BrWAX2 基因是如何变异导致的亮绿无蜡粉表型，笔者利用全长引物 BrWAX2-g1 扩增亮绿材料 YW71 的全长 DNA和 CDS 序列（图 2），序列分析表明在 DNA 水平上，与正常有蜡粉材料 R16 相比，亮绿材料 YW71 中BrWAX2 基因在 790 bp 处发生了 39 bp 的缺失，但是在 cDNA 水平上，R16 的 CDS 全长为 1887 bp，YW71 的 CDS 全长序列为 1436 bp，YW71 的 CDS全长序列比 R16 减少了 451 bp（图 3-A）。笔者在第 4 个外显子末端设计了 2 个反向互补引物 Br-WAX2-P2R 和 BrWAX2-P3F，分别与 BrWAX2-g1F和 BrWAX2-g1R 配对组成分段引物 BrWAX2-P2 和BrWAX2-P3，以 YW71 和 R16 的 cDNA 为模板进行扩增，结果表明，BrWAX2-P2 在 R16 中的扩增产物大小为 714 bp，在 YW71 中的扩增产物大小为263 bp（图 3-B），片段大小差异为 451 bp，而BrWAX2-P3 在 R16 和 YW71 中的扩增大小一致，均为 1195 bp，由此也进一证明，BrWAX2 基因在亮绿材料 YW71 中缺失了 451 bp 的 CDS 序列。将 2份材料 BrWAX2 基因的 DNA 和 CDS 序列进行比对分析，发现亮绿无蜡粉材料 YW71 中 39 bp 的缺失发生在第 3 个外显子末端 4 bp 和第 3 个内含子前端 35 bp 的邻接处，该 39 bp 的缺失引起了可变剪切，具体表现为第 2 和第 3 外显子的缺失（图3-C），最终导致翻译蛋白的提前终止和蛋白功能缺失（图 3-D）。2.3YW71中BrWAX2基因表达量显著下降前期研究表明，蜡质基因 BrWAX2 在茎、叶、萼片、花瓣等地上组织中表达量均较高9，为分析亮绿注：在 gDNA 水平上，YW71 相对 R16 发生了 39 bp 的缺失，该缺失发生在第 3 个外显子末端。Note:In the gDNAlevel,the BrWAX2 gene in YW71 has a 39 bp deletion compared to R16,which occurs at the end of the third exon.图 2YW71 和 R16 中 BrWAX2 基因部分序列比对Fig.2Partial sequence alignment of BrWAX2 in YW71 and R16R16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDSR16-gDNAYW71-gDNAR16-CDSYW71-CDS102030405060708090100110120130140150160170180190200210220230240250260270280290300310320330340350360370380390400410420430440450460470480490500510520530540550560570580590600610620630640650660670680690700710720730740750760770780910920930940950960970980990100010101020103010401050790800810820830840850860870880890900106010701080109011001110112011301140115011601170118011901200150150606030030011060450450260606006003186075075046860900861518671050101166821712001161731280杨双娟，等：大白菜蜡质缺失突变体YW71的遗传及序列变异分析35中国瓜菜第37卷试验研究ExonIntronR16C39 bp deletionYW71DE1E4E5E6E7E8E9E10E1E4E5E6E7E8E9E10E2E3Exon skippingAM YW71 R16 YW71 R16500020001000gDNAcDNAB20001000250YW71P W T P L G N F K RCCT TGG ACA CCC CTT GGG AAT TTC AAG CGG TGA*MYW71YW71R16R16BrWAX2-P2BrWAX2-P3cDNA4563 bp1887 bp714 bp263 bp1436 bp1195 bp1195 bp4524 bp无蜡粉材料 YW71 中 BrWAX2 基因的表达情况，研究 提 取 了 YW71 和 R16 茎 和 叶 的 RNA。以BrGAPDH 作为内参基因，用引物 BrWAX2-Qua1（表 1）检测 BrWAX2 基因在 YW71 中的相对表达量。结果表明，无论是在有蜡粉材料 R16 还是在亮绿材料 YW71 中，BrWAX2 基因在叶片中的表达量均高于在茎中的表达量（图 4）。BrWAX2 基因在材料 R16 茎表皮的表达量是 YW71 茎表皮中的 3.2