不同授粉方式对连翘果实农艺性状和品质的影响.pdf

第 43 卷第 2 期2024 年 2 月中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant ResourcesVol.43 No.2Feb.2024不同授粉方式对连翘果实农艺性状和品质的影响薛帼珍1，刘佳宁2，闫晓睿1，杨晓霞1，刘计权1*（1.山西中医药大学 中药与食品工程学院，山西 榆次 030619；2.北京协和医学院 药物研究所，北京 100050）摘要 目的：研究不同授粉方式对连翘果实农艺性状和主要药用成分含量的影响。方法：花期采用不同方式对连翘进行授粉，在青翘收获期测定结果率、果长、果宽、鲜重、干重、折干率等农艺性状指标和连翘酯苷A、连翘苷2个品质指标。结果：连翘长 短异花授粉产生的果实农艺性状和含量最优；其余果实农艺性状和含量测定值由大到小依次为连翘短 长异花授粉、短 短（同型异花）授粉、长 长（同型异花）授粉，连翘自花授粉不结实；长 短异花授粉后的结果率、鲜重、干重、折干率、连翘酯苷A和连翘苷含量显著高于短 短（同型异花）授粉和长 长（同型异花）授粉。结论：连翘长 短异花授粉的果实农艺性状、连翘酯苷A和连翘苷含量最佳，可为连翘的规范化种植提供参考依据。关键词 连翘；授粉方式；结果率；连翘酯苷A；连翘苷中图分类号：R931.2 文献标识码：A 文章编号：1006-9690（2024）02-0073-05Effects of Different Pollination Methods on the Fruit Agronomic Characters and Quality of Forsythia suspensaXue Guozhen1，Liu Jianing2，Yan Xiaorui1，Yang Xiaoxia1，Liu Jiquan1*（1.College of Chinese Medicine and Food Engineering，Shanxi University of Chinese Medicine，Yuci 030619，China；2.Institute of Materia Medica，Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）Abstract Objective：To study the effects of different pollination methods on the agronomic characters and major medicinal components of Forsythia suspensa fruit.Methods：Different methods of pollination were used in florescence，and the agronomic characters of F.suspensa fruit such as fruit percentage，fruit length，fruit width，fresh weight，dry weight and drying rate were measured in harvest.The contents of forsythiaside A and phillyrin were determined by HPLC.Results：The determination values of agronomic characters and contents were the largest in the cross-pollinated（L S）fruits of F.suspensa.Then the measured values from large to small were cross-pollination（S L），isotype cross-pollination（S S），isotype cross-pollination（L L）.There was no fruit on the self-pollination plants of F.suspensa.The fruit percentage，fresh weight，dry weight，drying rate，and contents of forsythiaside A and phillyrin from cross-pollination（L S）were significantly higher than those of isotype cross-pollination（S S）and isotype cross-pollination（L L）.Conclusion：The determination values of agronomic characters and contents of forsythiaside A and phillyrin were the largest in the cross-pollinated（L S）fruits of F.suspensa.The results could provide reference for the standardized planting of F.suspensa.doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2024.02.012收稿日期：2023-03-07，录用日期：2024-01-08基金项目：国家中医药管理局全国中药资源普查项目（GZY-KJS-2018-004）；山西省自然基金面上项目（20210302123233）；山西道地药材品质形成机制创新团队（2022TD2009）；山西中药材产业技术体系（CZ2023018）；山西中医药大学太行本草专项（2022PY-TH-30）；山西中医药大学中药资源学科建设项目（2023XKJS-24）。作者简介：薛帼珍（1997-），女，硕士研究生，研究方向为中药资源及新产品开发。E-mail：*通讯作者：刘计权（1972-），男，博士，教授，研究方向为中药资源、中药材规范化种植及新产品开发。E-mail： 73中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷Key words Forsythia suspensa；Pollination mode；Fruit percentage；Forsythiaside A；Phillyrin连翘来源于木犀科（Oleaceae）药用植物连翘 Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl 的干燥果实，秋季果实初熟尚带绿色时采收，习称“青翘”，果实熟透时采收，习称“老翘”，具有清热解毒、消肿散结、疏风散热的功效1-3。连翘含有连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素、生物碱、香豆精、毛柳苷等多种化学成分4-6。2020版 中国药典 规定，连翘酯苷A和连翘苷为连翘质量评价的2个重要指标成分1。连翘主要分布于山西、河南、河北、陕西、山东等地，以山西和河南产量最大7-8。山西是野生连翘资源最丰富的省份，也是野生连翘资源分布的中心，其中太岳山、中条山和南太行山为山西野生连翘的三大分布区9。2020年11月11日，山西省卫健委将连翘认定为山西“十大”晋药之一10。近年来，由于我国中医药行业的健康发展，市场对连翘的需求与日俱增，连翘的生产由原来单一依靠野生采集为主逐渐形成了目前的野生抚育、仿野生栽培和人工规范化栽培并存的生产模式11-12。根据连翘雄蕊的长短可分为长花柱连翘和短花柱连翘，不同花柱类型之间授粉会影响到连翘后期的坐果率13。本文在以前学者研究的基础上，对连翘不同花柱类型授粉后对连翘果实农艺性状和品质的影响进行了研究，以期为连翘的人工规范化栽培提供一定的参考依据。1材料1.1仪器与设备Waters 2695 高效液相色谱仪，Empower 工作站，Waters 2998检测器（美国Waters公司）；AlltimaTM C18色谱柱（250 mm 4.6 mm，5 m），HH-4-40276数显水浴锅（金坛杰瑞尔电器）；AR323CN电子天平奥豪斯仪器（常州）有限公司；AB135-S十万分之一天平（梅特勒托利多仪器制造商）等。1.2试药与药材连翘酯苷 A、连翘苷（中国食品药品检定研究院，批号分别为 111810-201707、110821-201816）；甲醇 色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甲醇（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；娃哈哈纯净水。药材来源：连翘果实采自山西中医药大学校园内连翘种植区，经山西中医药大学刘计权教授鉴定，确定为木犀科药用植物连翘的果实。2方法2.1连翘授粉方式授粉试验在山西中医药大学药用植物园5年生连翘种植区进行，选择连翘长、短花柱 2种类型植株，于2020年4月7 9日对不同花柱类型的连翘进行授粉试验，授粉后用硫酸纸袋进行套袋。试验设6个处理组合：a.长花柱自花授粉（长 长）；b.短花柱自花授粉（短 短）；c.长花柱同型异花授粉（长 长）；d.短花柱同型异花授粉（短 短）；e.长花柱母本 短花柱父本（长 短）；f.短花柱母本 长花柱父本（短 长）。每个处理套袋 300个左右。2.2果实农艺性状的测量2020年8月30日采集青翘，用游标卡尺分别测量不同授粉方式各30粒鲜果的果长、果宽（在果实最宽处，分别沿腹缝线、背缝线平面进行测定，计算二者平均值作为果宽），不足30粒的全部测量；用电子天平分别称量不同授粉方式各30粒果实的鲜重和干重，不足30粒的全部称量，计算折干率14、单果鲜重和干重15。2.3连翘酯苷A和连翘苷含量测定2.3.1溶液的制备2.3.1.1对照品溶液的制备精密称取连翘酯苷A、连翘苷对照品适量，加甲醇制成每 1 mL 含连翘酯苷 A 0.979 mg 和连翘苷0.105 mg的混合对照品溶液16。2.3.1.2供试品溶液的制备取连翘果实粉末（过五号筛）约 0.5 g，精密称定，置 50 mL具塞锥形瓶中，精密加入 50%甲醇溶液25 mL，称重，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用 0.45 m 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得17。2.3.2色谱条件依据参考文献 18 的色谱条件进行测定。色谱柱：Alltima C18（250 mm 4.6 mm，5 m）；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0 8 min，30%33%A；8 24 min，33%40%A；24 39 min，40%48%A；39 55 min，48%64%A；55 65 min，64%30%A；65 75 min，30%A）；检测波长：74第 2 期薛帼珍，等：不同授粉方式对连翘果实农艺性状和品质的影响280 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：室温。2.3.3方法学考察2.3.3.1线性关系精密吸取连翘酯苷 A和连翘苷混合对照品溶液6、8、10、12、14、16 L，依次进样开展色谱分析，以进样量X（g）为横坐标，峰面积积分值Y为纵坐标，绘制标准曲线，计算得连翘酯苷A和连翘苷的回归方程和相关系数。2.3.3.2方法学试验制备混合对照品溶液和供试品溶液，按照2.3.2项下色谱条件对其进行含量测定，分别开展精密度试验、重复性试验和稳定性试验，进行方法学试验考察。2.3.3.3加样回收试验精密称取已知连翘酯苷 A和连翘苷含量的连翘药材粉末0.25 g，共6份，每份均精密加入连翘酯苷A和连翘苷的混合对照品溶液，按照2.3.1.2项下方法制备供试品溶液，进行色谱分析，测定峰面积值，计算连翘酯苷A和连翘苷含量及加样回收率。2.4含量测定分别取不同授粉方式产的连翘果实样品3份，按照2.3.1.2项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 L进样，按照2.3.2项下色谱条件测定样品中连翘酯苷A和连翘苷的含量。2.5数据处理采用 SPSS 20.0 软件，根据邓肯的多重比较进行显著性分析，显著性界值为P 0.05。3结果与分析3.1不同授粉方式对连翘结果率的影响授粉后于2020年5月8 9日解袋，统计连翘不同授粉方式的坐果数量，计算结果率。连翘不同花柱类型授粉试验结果见表1。由表1试验结果可以看出，连翘长 长（自花）、短 短（自花）授粉的结果率均为0.00%；连翘长 长（同型异花）、短 短（同型异花）授粉的结果率非常低，分别为3.81%和5.32%，短 短（同型异花）授粉的结果率略高于长 长（同型异花）授粉的结果率；连翘长 短、短 长异花授粉结果率很高，分别达到 89.90%和 83.49%，长 短授粉的结果率略高于短 长授粉的结果率。由此可见，生产上连翘果实主要来源于连翘长、短花柱之间的异花授粉。3.2不同授粉方式对果实外观性状的影响连翘不同授粉方式对果实外观性状影响的试验结果见表2。表2测定结果表明，长 短异花授粉后，果长、果宽、鲜重、干重、折干率的测定值均表现为最大，其次是短 长异花授粉，2种授粉方式除在果实鲜重、干重方面有显著差异外，在果长、果宽、折干率方面无显著差异；短 长异花授粉后果实的5项测定指标均高于短 短（同型异花）授粉的果实，前者的折干率显著高于后者；短 短（同型异花）授粉后果实的5项测定指标均高于长 长（同型异花）授粉的果实，前者果实鲜重、干重显著高于后者。3.3不同授粉方式对连翘酯苷A和连翘苷含量的影响3.3.1线性关系试验结果连翘酯苷 A和连翘苷混合对照品溶液及连翘供试品溶液HPLC色谱图如图1所示。连翘酯苷A和连翘苷线性关系试验结果见表3，结果表明连翘酯苷A和连翘苷各组分在其相应的线性范围内线性关系良好。3.3.2方法学试验结果对混合对照品和供试品溶液分别进行检测，连翘酯苷 A 和连翘苷的精密度试验 RSD 值分别为0.23%和1.87%；重复性试验RSD值分别为0.97%和表1连翘不同授粉方式结果率的试验结果Tab.1Experimental results of fruit percentage by different pollination methods处理套袋数（个）结果数（个）结果率（%）长 长（自花）30400.00e短 短（自花）29500.00e长 长（同型异花）289113.81cd短 短（同型异花）301165.32c长 短（异花）30727689.90a短 长（异花）31526383.49ab注：根据邓肯的多重比较，同行数据后面带有相同字母表示无显著差异，不同字母表示具有显著差异，P 0.05。下同。75中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷1.33%；稳定性试验RSD值分别为2.12%和0.17%，结果表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。3.3.3回收率试验结果回收率试验测得连翘酯苷 A和连翘苷的平均回收率分别为 98.61%和 97.54%，对应的 RSD值分别为 1.53%和 1.72%。表明该方法准确度良好，结果见表4。3.3.4不同授粉方式对果实连翘酯苷A和连翘苷含量的影响测定结果表明，连翘长 短和短 长异花授粉后，果实中连翘酯苷A和连翘苷的含量均高于药典标准，2种授粉方式之间没有显著差异；连翘长 长（同型异花）和短 短（同型异花）授粉后，果实中连翘酯苷A和连翘苷的含量均低于药典标准，2种授粉方式之间没有显著差异（表5）。4讨论4.1自交不亲和性对连翘结果率的影响在植物界中，自交不亲和性广泛存在19-21。连翘的花属于两性花，如果在生长发育过程中因自花授粉而导致近亲繁殖，最终会降低连翘后代对生长环境的适应性，所以在长期的进化过程中，逐渐形成了抑制近亲繁殖的自交不亲和性，如通过花的特征变化，形成长花柱（短花药）花、短花柱（长花药）花来避免自花授粉而产生后代。试验研究表明，长 长（同型异花）和短 短（同型异花）授粉的结果率也非常低，只有长 短和短 长之间的异花授粉才能繁殖大量的后代，说明连翘在分子水平上同样形成了基因干预的自交不亲和性。自交不亲和性是一个多基因协同作用的复杂过程22-23。在连翘实际生产中，普遍存在坐果率低、产量和质量不均匀等问题，该类问题在某些区域表现的特别严重，表2授粉方式对果实外观性状的影响Tab.2Effects of pollination methods on fruit appearance traits授粉方式长 长（自花）短 短（自花）长 长（同型异花）短 短（同型异花）长 短（异花）短 长（异花）果长（cm）-1.80b1.94ab2.44a2.12a果宽（cm）-0.71b0.85ab1.01a0.96a单果鲜重（g）-0.42c0.64b0.89a0.65b单果干重（g）-0.13c0.20b0.33a0.24b折干率（%）-30.95b31.25b37.08a36.92a图1对照品（a）及样品（b）的HPLC图Fig.1HPLC chromatograms of reference materials（a）and samples（b）注：1：连翘酯苷A；2：连翘苷。表3连翘酯苷A和连翘苷回归方程及线性范围Tab.3Linear range and regression of forsythiaside A and phillyrin成分连翘酯苷A连翘苷线性回归方程Y=32.195X-26.492Y=13.765X-0.101 8相关系数（r）0.999 90.999 7线性范围（g）5.87 15.660.63 1.68 76第 2 期薛帼珍，等：不同授粉方式对连翘果实农艺性状和品质的影响而且常年出现连翘光开花不结果的现象24-25，其根本原因在于连翘的自交不亲和性，只有不同花柱之间的花授粉才能结果，生产中由于长花柱植株和短花柱植株在一个群落中分布不均匀，导致不同花柱之间的异花授粉受限，进而影响到连翘的结果率26。所以在生产中应通过平衡长、短花柱连翘在群落结构中的比例，以提高连翘果实的产量和品质。4.2授粉方式对连翘果实性状和品质的影响药用植物授粉方式不同，来自父母双方的遗传特性也不同，进而会影响到后代的生长发育、药材产量和品质的形成，不同授粉方式产生的果实在农艺性状和活性成分含量上会表现出一定的差异性。研究报道，连翘短花柱花的花粉活力显著高于长花柱花的花粉活力12，27，所以将连翘短花柱花的花粉授予长花柱花的雌蕊后，结果率提高。后期果实发育良好，其农艺性状指标（果长、果宽、鲜重、干重、折干率）和品质指标（连翘酯苷A、连翘苷含量）测定值最大；而以长花柱花的花粉授予短花柱花的雌蕊后，其测定值相对较小。2 种同型异花授粉（短 短、长 长）实验结果相比，短 短授粉测定值较大，这可能也与短花柱花的花粉活力较高有关。2020版 中国药典 规定，青翘中连翘苷和连翘酯苷A的含量分别不低于0.15%和3.5%，还规定青翘含挥发油的含量不得少于 2.0%1。由于条件所限，本次试验没有进行青翘中挥发油的对比研究，后期将进一步完善研究内容。参考文献:1 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）M.北京：中国医药科技出版社，2020：177-178.2 黄鹏.连翘全光喷雾扦插育苗试验 J.中国野生植物资源，2019，38（2）：78-81.3 黄春阳，郑鸿娟，零新岚，等.连翘乙酸乙酯提取物体外抗氧化活性研究 J.中国野生植物资源，2017，36（1）：15-17.4 高学敏.中药学 M.北京：中国中医药出版社，2009：109.5 沈菲，邹立思，文红梅，等.HPLC-PDA指纹图谱结合UFLC-Q-TOF-MS定性鉴别评价连翘药材质量 J.中国中药杂志，2019，44（20）：4495-4503.6 Sun L，Rai A，Rai M，et al.Comparative transcriptome analyses of three medicinal Forsythia species and prediction 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长（异花）连翘酯苷A含量（%）-2.16b2.21b3.92a3.67a连翘苷含量（%）-0.08b0.09b0.24a0.21a（下转第90页）77中 国 野 生 植 物 资 源第 43 卷42李龙.黄芪多糖、淫羊藿多糖免疫增强作用研究 D.乌鲁木齐：新疆农业大学，2013：7-10.43魏国燕，陈建军，廖思红，等.光照对淫羊藿活性成分生物合成的影响 J.植物科学学报，2012，30（4）：415-422.44雷荣，汪卓逸，汪永平，等.遮阴度对“黔藿 1 号”箭叶淫羊藿生长及产质量的影响 J.中药材，2021，44（11）：2501-2505.45罗燕.遮阴对朝鲜淫羊藿生理生态特性及药效成分影响的研究 D.长春：吉林农业大学，2018：10-18.46李小明，潘俊倩，落艳娇，等.不同光强下光质对拟巫山淫羊藿生长发育和淫羊藿苷类黄酮含量的影响 J.中国中药杂志，2020，45（11）：2502-2508.47代艾林，张永刚，艾强，等.不同光质对朝鲜淫羊藿生长、生理和黄酮类成分积累的影响 J.中国农业科技导报，2022，24（4）：85-92.48徐宠然，葛慧，贾袭伟，等.淫羊藿种子变温层积过程中胚形态及生理生化变化 J.草地学报，2022，30（8）：2075-2081.49陈彦，贾晓斌，蔡垠，等.温度和受热时间影响淫羊藿苷含量的两个关键因素 J.中成药，2007，7：1038-1041.50李仁清.4种淫羊藿同质园栽培质量变化及淫羊藿多苷成分动态累积规律研究 D.南昌：江西中医药大学，2021：8-14.51董博，王克鹏，郭天文，等.甘肃不同产地淫羊藿有效成分含量与土壤养分相关性分析 J.时珍国医国药，2015，26（8）：2027-2029.52孟芳芳，张强，姜大成，等.不同生长区朝鲜淫羊藿土壤化学指标的相关性分析 J.特产研究，2021，43（3）：83-88.53钱一凡，黎云祥，陈兰英，等.施肥对巫山淫羊藿和柔毛淫羊藿产量的影响 J.西华师范大学学报（自然科学版），2014，35（1）：57-62.54邓爱平，方文韬，周青罡，等.淫羊藿质量影响因素及质控对策分析 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