MiRNA调控脑缺血_再灌注诱导的自噬信号通路研究进展.pdf

第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）MiRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路研究进展刘筱蔼1，罗友根2（1.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520；2.江苏医药职业学院盐城市偏瘫康复工程技术研究中心，江苏 盐城 224005）摘要：脑卒中时缺血缺氧致脑组织功能损伤，且缺血后脑组织再恢复血液供应时，大量自由基、钙超载等引起脑缺血/再灌注损伤，进一步加重病情。自噬是一种维持细胞内环境稳态的自我保护机制，但过度自噬引起脑组织损伤。MiRNA为小的内源性非编码RNA分子，通过与其靶基因mRNA的3 -UTR中的互补序列结合，导致翻译抑制或mRNA降解，从基因水平上调控多种生理活动。MiRNA不仅直接作用于自噬相关蛋白，还可通过多种信号通路，参与缺血/再灌注诱导的自噬调控。但关于miRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路尚缺乏系统性归纳与分析。本文综述了miRNA-124、miRNA-298、miRNA-202-5p、miRNA-142以及miRNA-26b等miRNA通过不同信号通路调控脑缺血/再灌注中的细胞自噬，为脑卒中的自噬研究提供了系统的理论思路。关键词：脑缺血/再灌注损伤；微小RNA；自噬；信号通路；自噬相关蛋白；调控中图分类号：R363.2 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0021-07DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240004.003MiRNA Regulating Autophagy Signaling Pathway Induced by Cerebral Ischemia/ReperfusionLIU Xiaoai1，LUO Yougen2（1.Institute of Nursing，Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China；2.Yancheng Hemiplegia Rehabilitation Engineering Technology Research Center，Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng 224005，China）Correspondence to：LUO Yougen；E-mail：Abstract：Ischemia and hypoxia cause functional damage to brain tissues during stroke，and when blood supply is restored to brain tissues after ischemia，a large number of free radicals and calcium overload cause cerebral ischemia-reperfusion injury，which further aggravates the condition.Autophagy is a self-protection mechanism that maintains the homeostasis of the intracellular environment，but excessive autophagy causes brain tissue damage.MiRNA is a small endogenous non-coding RNA molecule that regulate various physiological activities at the gene level by binding to complementary sequences in the 3-UTR of its target gene mRNA，leading to translation inhibition or mRNA degradation.MiRNA not only directly acts on autophagy related proteins，but also participates in autophagy regulation induced by ischemia/reperfusion through various signaling pathways.However，there is still a lack of systematic induction and analysis of miRNA regulation of autophagy signaling pathways induced by cerebral ischemia/reperfusion.This article reviews the regulation of cellular au 综述 收稿日期：2023-10-16 录用日期：2023-12-11基金项目：国家自然科学基金（31660271），江苏省产学研合作项目（BY20221030），江苏省双创计划（JSSCBS20211166）；广东省医学科学技术研究基金（A2020164）；广东食品药品职业学院自然科学研究项目（2016YZ009），江苏医药职业学院博士科研启动项目（20200010）作者简介：刘筱蔼，第一作者，副教授，研究方向：神经损伤与修复，E-mail：；罗友根，通信作者，教授，E-mail：第45卷中山大学学报（医学科学版）tophagy during cerebral ischemia/reperfusion by miRNA-124，miRNA-298，miRNA-202-5p，miRNA-142，miRNA-26b and so on through different signaling pathways，providing a systematic and theoretical approach for the study of autophagy in stroke.Key words：cerebral ischemia reperfusion injury；MicroRNA；autophagy；signal pathway；autophagy related proteins；regulationJ SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（1）：21-27脑卒中具有高致残率和高死亡率的特点，早期预防具有十分重要的意义。临床上脑卒中主要类型包括缺血性脑卒中（短暂性脑缺血发作和脑梗塞）和出血性脑卒中1，它们引起神经元损伤的直接原因都是缺血缺氧。然而，缺血缺氧后的脑组织再恢复血液供应时，自由基大量产生、钙超载等因素引起缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion，I/R），导致病情更加严重2。自噬是机体在缺血和缺氧条件下产生的一种应激反应，也是维持细胞内环境稳态的自我保护机制。脑缺血/再灌注损伤（cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI）可以激活自噬，自噬不仅具有神经保护作用，而且还参与神经细胞死亡的过程3。研究发现微小 RNA（microRNA，miRNA）会影响缺血/再灌注诱导的脑损伤，miRNA表达变化和CIRI的发展有密切联系，并参与其多种病理过程的调节4-5，同时miRNA也可以影响自噬过程的不同阶段6，但 miRNA 在 CIRI诱导自噬过程中的作用机制尚未完全明了。本文概述了多种miRNA通过不同信号通路调控CIRI中的细胞自噬，为自噬在CIRI中的研究奠定理论基础。1 MiRNA与脑缺血再灌注损伤1.1脑缺血再灌注损伤缺血缺氧引起脑组织功能损伤涉及的生物学机制主要有：神经元凋亡、自噬、细胞炎症、线粒体功能紊乱等7-8。然而，医学家们渐渐发现，对组织造成损伤的主要因素，不是缺血缺氧本身，而是缺血缺氧后的脑组织再恢复血液供应时，产生大量的自由基、钙超载等导致严重的迟发性神经元损伤，引起CIRI9-10。因此，预防CIRI并取得最佳治疗效果已成为重要的临床问题。1.2MiRNA在脑缺血再灌注损伤中的作用MiRNA 是一种细胞内源性非编码小 RNA，通常由1825个核苷酸组成，miRNA通过碱基配对的方式与靶基因 mRNA 的 3非翻译区（untranslated regions，UTR）部分或者全部互补结合，抑制转录产物的翻译或将其降解，从而起到转录后调控靶基因表达的作用 11。生物学上miRNA扮演着多种重要角色，参与细胞自噬、凋亡、增殖与分化等12-13。近年来，越来越多的动物实验和临床研究表明，miRNA 参与 I/R（包括 CIRI），I/R 过程中大量miRNA 上调或下调14。Yuan 等15通过构建大鼠CIRI 模型，在 I/R 发生 30min 和 24h 后，分别检测miRNA 的表达，发现有 3040 种 miRNA 出现上调或下调，说明这些 miRNA 可能参与 CIRI 的调控。有研究证实CIRI后大鼠海马区的miRNA表达出现快速且广泛的变化，且伴随不同的miRNA变化趋势，在转录后水平调控多种基因的表达16-17。在CIRI的各个病理生理过程均有miRNA参与，且随CIRI程度、时间甚至细胞种类（如神经元、胶质细胞等）的不同，miRNA表达谱存在明显差异18-19。2 自噬与脑缺血再灌注损伤2.1自 噬自噬又称型细胞程序性死亡，是真核细胞一种高度保守的降解途径，通过清除被损坏的或非必需的细胞成分，来维持细胞的稳态和生存。根据细胞底物与溶酶体结合方式不同，细胞自噬可分为巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。真核细胞中，最容易发生巨自噬，其与CIRI的关系也最为密切20。自噬通常由自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）参与和调控，而 Beclin-1 作为酵母Atg6同源物，是哺乳动物参与自噬的特异性基因，也是参与自噬调控的重要正向调节因子，其表达强度与自噬活性密切相关21；LC3为Atg8基因的同源物，分为型和型。自噬产生时，LC3-经过酯22第1期刘筱蔼，等.MiRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路研究进展化修饰转化为LC3-，后者作为自噬体的标志物，LC3-/比值的大小可用来评估自噬水平的高低22。2.2自噬在脑缺血再灌注损伤中的作用在缺血性脑损伤中，自噬是一把双刃剑，正常的自噬对清除神经元中过多的蛋白起重要作用，而自噬系统的稳态被破坏或功能异常会导致神经细胞功能异常或死亡23。自噬在脑缺血/再灌注中的作用可因自噬程度和作用持续时间的不同而截然相反24。Shi等25通过构建体外I/R模型，在I/R后的前24 h内呈保护性自噬，而再灌注后4872 h，自噬过度激活，由神经保护作用转变为诱导细胞死亡。Peng等26研究发现，线粒体融合蛋白2主要通过增加自噬体的形成以及自噬体和溶酶体的融合，激活细胞自噬，从而减轻 CIRI 保护受损脑组织。Su等27的研究发现，缺血预适应能够激活自噬-溶酶体途径，从而对缺血再灌注脑组织产生显著的保护作用，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤能逆转这种保护作用，而自噬激动剂雷帕霉素使CIRI减轻。研究发现在I/R阶段，活性氧和自由基产生增多，引起氧化应激，p62蛋白作为氧化应激和自噬之间的桥梁和纽带，可通过调控自噬与抗氧化通路，减轻大鼠CIRI28。相反，一些研究显示，自噬对脑缺血具有不利影响，自噬抑制剂能减轻缺血引起的神经元损伤29-31。Yang等32研究显示，自噬作用增强可通过激活TLR4/NF-B途径加强炎症反应，不利于缺血性脑损伤恢复。3 miRNA调控脑缺血再灌注损伤中细胞自噬的相关通路MiRNA可直接作用于多种相关蛋白33-34。有研究发现抑制miR-124表达，可增加LC3-/值和Beclin-1的相对表达，参与细胞自噬和凋亡的调控，保护多巴胺能神经元 35。Fan 等36发现CIRI中miR-193b 表达较低；GATA6 通过转录激活 miR-193b 下 调 ATG7，抑 制 神 经 元 自 噬，从 而 减 轻CIRI。MiRNA 可以通过多条信号通路参与脑 I/R的自噬调控37-38，其中已经明确的有 PI3K/Akt/mTOR 通路、Akt/GSK-3 通路和 Act1/JNK/NF-B信号通路等，CIRI过程中不同阶段可能涉及不同的信号转导通路。3.1PI3K/Akt/mTOR信号通路PI3K/Akt/mTOR信号通路是调控细胞周期的经典通路之一39，对细胞自噬也起着重要的调控作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是进化保守的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它的活性是自噬体形成、成熟的关键。作为该通路中调控自噬的关键因子，尤其在缺血阶段，mTOR对自噬起重要作用40-41，Akt可直接或间接磷酸化mTOR，从而激活mTOR，形成mTOR复合物 1（mTOR compound 1，mTORC1），后者是 PI3K/Akt下游的核心组件42。mTORC1能够催化一系列自噬相关蛋白发生磷酸化或抑制参与自噬相关蛋白的合成，从而抑制或减轻自噬发生43。Miao等44利用小鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）所致的脑缺血模型，证实 miR-124与PI3K/Akt2之间存在互补的配对区域，PI3K/Akt2可能是miR-124的靶标，抑制miR-124可加强PI3K/Akt/mTOR信号通路，从而抑制细胞自噬和凋亡，发挥神经保护作用，并防止CIRI。Liu等45通过大鼠慢性脑灌注不足（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）模型，发现CCH后miR-96的水平升高，mTOR 水平降低，miR-96 在体内和体外均可调节mTOR表达。抑制miR-96表达可减轻CCH诱导的认知障碍，同时LC3、Beclin-1表达下调，减少自噬的激活，因此认为miR-96可能作为CCH治疗的潜在靶标。Li等46的研究显示，右美托咪啶预处理能减少 CIRI 后 Beclin-1 和 LC3-/I 比值而增加 p-Akt/Akt 和 p-mTOR/mTOR 比 值，通 过 PI3K/Akt/mTOR 途径抑制自噬，从而减轻 CIRI 引起的脑损伤。京都基因与基因组百科（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信 号 通 路 分 析 表 明miRNA-132-3p的靶基因与自噬密切相关。Zhang等47的研究发现丹红注射液使 p-PI3K、p-AKT 和mTOR 表 达 显 著 增 加 而 AMPK、ULK1、TG12、ATG16L1和 LC3/I 表达显著减少。双荧光素酶报告基因实验显示 miRNA-132-3p 可直接靶向ATG12 3-UTR 区。体外实验中，miRNA-132-3p对 OGD/R 诱导的 PC12 细胞氧化应激损伤具有保护作用，可提高细胞活力，并影响自噬途径相关蛋白的表达。体内转染实验表明，miR-132-3p过表达可减少CIRI诱导的自噬，保护神经元。提出丹23第45卷中山大学学报（医学科学版）红注射液可抑制脑缺血再灌注后神经元自噬，可能与 miR-132-3p 靶向 ATG12 并调节自噬信号通路蛋白表达有关。3.2Akt/GSK-3信号通路Akt/GSK-3信号途径在葡萄糖转运、细胞增殖、分化和凋亡等过程起调节作用。真核生物翻译起始因子 4E（eukaryotic translation initiation factor 4E，eIF4E）的活性决定翻译过程的起始，也是自噬途径的核心组成部分48，其功能受 PI3K/mTOR 上游信号通路的调控49。Li等50通过生物信息学分析发现 eIF4E 具有与 miR-202-5p 的结合位点，推测 eIF4E 可能是miR-202-5p的关键靶标，并通过构建 MCAO大鼠模型，证实 eIF4E 为 miR-202-5p 的靶基因；miR-202-5p 可下调 eIF4E 表达并降低 LC3-/的水平。MiR-202-5p 减少了 OGD/R 诱导的细胞中自噬体的数量，eIF4E的过表达减弱了miR-202-5p模拟物对细胞自噬的降低作用。因此认为，miR-202-5p通过靶向eIF4E上调Akt/GSK-3信号通路相关蛋白的水平，促进OGD/R诱导的N2a细胞的增殖和自噬抑制，提出 miR-202-5p 可能通过 eIF4E充当CIRI的保护剂。3.3Act1/JNK/NF-B信号通路研究显示，OGD/R处理的神经元显示24小时后与正常神经元相比，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化显著减少，而神经元 JNK 功能的丢失引起自噬的活化51-52。NF-B的活化剂Act1既能激活JNK，又能激活经典的NF-B途径，而JNK和NF-B都与细胞自噬有关。研究发现，缺血性中风引起Act1表达上调而miR-298表达下调；荧光素酶分析显示miR-298直接与Act1转录本3 -UTR结合；miR-298过表达通过对Act1/JNK/NF-B信号通路及其下游的自噬通路的负调控，促进细胞凋亡和自噬，加重缺血和神经损伤，提示miR-298可作为治疗缺血性中风的潜在治疗靶点53-54。Mo等55的研究显示，miR-379-5p表达的上调能减轻OGD诱导的HCN-2细胞的损伤，减少自噬标志蛋白Beclin1的表达，而自噬激动剂雷帕霉素能阻断miR-379-5p的细胞保护作用，并提出miR-379-5p 通过抑制 MAP3K2 和 JNK/c-Jun 通路减轻自噬从而保护神经元。3.4LncRNA/miRNA/mRNA信号通路长链非编码 RNA（long non-coding RNAs，LncRNAs）能够通过与 miRNA 的共享序列结合而与miRNA 的靶基因竞争，从而导致靶 mRNA 的降解56。LncRNAs 转移相关的肺腺癌转录物 1（LncRNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，Malat1）在缺血性中风条件的体外模拟物中高度表达，从而提出缺血性脑卒中的一种新的lncRNA/miRNA/mRNA调控网络，即缺血性卒中的Malat1-miR-30a-Beclin1。Malat1 可 以 直 接 与miR-30a相互作用并对其表达产生负向调控作用，自噬标志物 Beclin-1 被证明是 miR-30a 的靶标，Malat1 下调明显抑制了 OGD 时 LC3-转化为LC3-以及 Beclin-1 水平的增加，Malat1 通过抑制缺血性卒中miR-30a的表达，从而抑制Beclin-1依赖性自噬57。Li 等58通过 I/R 诱导的脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）损伤模型的研究发现，Malat1可直接结合 miR-26b，抑制miR-26b 表达，而上调其靶标自噬核心蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Unc-51 like kinase 2，ULK2）表达；在OGD/R条件下，ULK2敲低可以抑制BMEC自噬和存活，因此认为，在OGD/R条件下，BMEC自噬和存活与Malat1/miR-26b/ULK2信号通路有关。3.5miR-27a/LAMP-2信号通路溶酶体相关的2A型膜蛋白（lysosomal associated type 2A membrane protein，LAMP-2）是溶酶体的关键膜元件，它是巨自噬中自噬体-溶酶体融合的关键决定因素，也是分子伴侣介导的自噬中溶酶体膜上伴侣-底物蛋白复合物（底物蛋白-HSC70复合物）的唯一结合蛋白59。Che 等60通 过 大 鼠 CCH 模 型 研 究，发 现LAMP-2是 miR-27a的直接靶标，miR-27a通过特异性转录后抑制LAMP-2表达，miR-27a的过表达使LAMP-2下调，自噬体数量和LC3-水平增加，导致溶酶体功能障碍，自噬小体清除缺陷，提出miR-27a是CCH期间通过转录后水平调控LAMP-2蛋白表达来调节动态自噬过程的关键调节剂。3.6CircHectd1/miR-142/TIPARP信号通路环状 RNA（circular RNA，CircRNA）能够通过不同的分子和通路包括 miRNA、NF-B、PI3K/Akt等调节自噬，提出CircRNA 作为治疗急性中枢神经24第1期刘筱蔼，等.MiRNA调控脑缺血/再灌注诱导的自噬信号通路研究进展系统损伤的潜在靶标大有可为61。CircRNA在中枢神经系统中高表达，调节中枢神经系统的生理和病理生理过程。Han等62利用CircRNA 微阵列，发现短暂性大脑中动脉阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）模型中，缺血后脑组织中环状 RNA-Hectd1（circRNA-Hectd1，CircHectd1）水平显著升高，与急性缺血性卒中患者血浆样本中检测结果一致，敲除CircHectd1 表达，显著降低 tMCAO 小鼠的梗死面积，减轻神经元损伤，改善星形胶质细胞活化。该研究认为 CircHectd1 作用于内源性 miR-142 的免疫抑制，抑制 miR-142活性，进一步抑制 TCDD 诱导的多聚ADP核糖聚合酶（TCDD induce Poly ADP ribose polymerase，TIPARP）的表达，继而通过自噬途径抑制星形胶质细胞的活化。如果采用 CircHectd1 miRNA转染小鼠原代星形胶质细胞，则可显著抑制tMCAO诱导的星形胶质细胞LC3-表达的增加和细胞自噬。结果表明 CircHectd1-miR-142轴通过下游 TIPARP促进星形胶质细胞自噬，从而为CircHectd1作为脑卒中新的生物标志物和治疗靶点提供了证据。4 总结与展望本文分析了miRNA、自噬与脑缺血/再灌注损伤的相关性，揭示脑缺血/再灌注损伤不同阶段的miRNA 关键基因表达和表达水平的差异性，揭示miRNA作为生物标志物的潜在价值。而自噬作为一种维持细胞内环境稳态的自我保护机制，在脑缺血/再灌注损伤中发挥重要作用。MiRNA 除直接作用于自噬相关蛋白，还可以通过多条信号通路参与自噬的调控（附图1）。本文综述了 miRNA-124、miRNA-298、miRNA-202-5p、miRNA-142以及miRNA-26b等因子，通过不同信号通路调控脑缺血/再灌注损伤中的细胞自噬，提示 miRNA 有望成为 CIRI 中极为重要的治疗靶点，为缺血性脑卒中发病机制的研究奠定了基础，也为该疾病的治疗提供了进一步研究的方向或思路。但是各通路之间是否还可以通过某个或某些元件发生相互作用，从而构成miRNA 调控脑缺血/再灌注损伤中细胞自噬的相关网络，还值得进一步探究。参考文献1 Krishnamurthi RV，Feigin VL，Forouzanfar MH，et al.Global and regional burden of first-ever ischaemic and haemorrhagic stroke during 1990-2010：findings from the Global Burden of Disease Study 2010 J.Lancet Glob Health，2013，1（5）：e259-e281.2 Rana AK，Singh D.Targeting glycogen synthase kinase-3 for oxidative stress and neuroinflammation：opportunities，challenges and future directions for cerebral stroke management J.Neuropharmacology，2018，1（139）：124-136.3 Zeng X，Zhang YD，Ma RY，et al.Activated Drp1 regulates p62-mediated autophagic flux and aggravates inflammation in cerebral ischemia-reperfusion via the ROS-RIP1/RIP3-exosome axis J.Mil Med Res，2022，9（1）：25.4 Zhou J，Wu JS，Yan Y，et al.MiR-199a modulates autophagy and inflammation in rats with cerebral infarction via regulating mTOR expression J.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2020，24（11）：6338-6345.5 Cao Y，Zhang H，Lu X，et 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