安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究.pdf

赵拴平，金海，刘峻，等.安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究J.中国草食动物科学，2024，44（1）：1-7DOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2024.00.001安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究赵拴平1，金海1，刘峻2，李永胜3，金磊1，李倩1，徐磊1，贾玉堂1（1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所，畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，合肥230031；2.休宁县畜牧兽医技术推广站，休宁245000；3.黄山市畜牧兽医推广中心，黄山245700）摘要：试验旨在分析安徽省黄山市新安江流域上游地区新安江水牛群体的分子遗传特性，探究其母系起源与遗传多样性。利用PCR扩增和测序技术测定28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列，下载GenBank数据库中24个中国水牛群体的693条D-Loop序列，利用生物信息学分析其遗传多样性，构建Neighbor-joining系统发生树和Media-joining网络，探索不同水牛群体的遗传距离。结果显示，28头新安江水牛的mtDNA D-Loop序列共有117个变异位点，构成25种单倍型，其核苷酸多样性为0.026 020.003 03，单倍型多样性为0.9890.014。新安江水牛群体的变异性水平与中国其他水牛群体接近。N-J系统进化树显示，新安江水牛25个单倍型分为A、B两个支系，具有A支系和B支系2个母系来源，其中A支系占据主导地位。Media-joining进化网络显示，中国水牛主要为沼泽型水牛，分为沼泽型水牛A支系和B支系，B支系又分为b1亚支系和b2亚支系。综上，新安江水牛群体变异水平与中国其他地方水牛群体接近，群体遗传多样性丰富；且新安江水牛属于沼泽型水牛，具有2个线粒体母系来源，与我国其他地方水牛群体具有一定的遗传距离。关键词：水牛；线粒体DNA；遗传多样性；单倍型中图分类号：S823.2文献标志码：A文章编号：2095-3887（2024）01-0001-07Genetic Variation and Phyletic Evolution of Xinanjiang BuffaloBased on Mitochondrial DNA D-LoopZHAO Shuanping1,JIN Hai1,LIU Jun2,LI Yongsheng3,JIN Lei1,LI Qian1,XU Lei1,JIAYutang1(1.Anhui Province Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering,Institute of AnimalHusbandry and Veterinary Medicine,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China;2.XiuningCounty Husbandry and Veterinary Promotion Station,Xiuning 245000,China;3.Huangshan Husbandry andVeterinary Promotion Station,Huangshan 245700,China)Abstract:The objectives of this study were to investigate molecular genetic characteristics of Xin anjiang buffalo in theupper reaches of Xin an River basin of Huangshan city from Anhui province,and explore the maternal origin and geneticdiversity.The mtDNA D-Loop sequences of 28 Xin anjiang buffalo were sampled and determined by PCR amplificationand sequencing.693 D-Loop sequences of 24 Chinese buffalo were downloaded from GenBank database.Geneticbioinformatics were used to analyze genetic diversity,construct Neighbor-joining tree and Media-joining network,andexplore the distance between populations.The results showed that 117 nucleotide polymorphic sites and 25 haplotypeswere identified in Xin anjiang buffalo population,the estimated overall nucleotide diversity and haplotype diversity were0.026 020.003 03 and 0.9890.014,respectively.Genetic variation of Xin anjiang buffalo was similar to other buffalo收稿日期：2023-11-13基金项目:安徽省肉牛良种联合攻关项目（2021 1146）；安徽省科技重大专项（S202003b06020001）作者简介:赵拴平(1984-)，女，博士，研究方向为肉牛遗传育种通信作者:徐磊(1986-)，男，副研究员，研究方向为肉牛繁殖育种与健康养殖-1China Herbivore Science2024年第44卷第1期中国草食动物科学Vol.44 No.1 2024populations.The Neighbor-joining tree indicated that the 25 haplotypes of Xin anjiang buffalo were divided into A and Blines,with 2 maternal sources,of which A was dominant.The Media-joining evolutionary network showed that Chinesebuffalo were mainly swamp buffalo,including A and B lines,and the B line could be further divided into sub-lineages ofb1 and b2.In summary,there was rich mitochondrial genetic diversity in Xin anjiang buffalo population,and it wassimilar to other buffaloes in China;the Xin anjiang buffalo was a swamp buffalo with two mitochondrial maternalsources,which had a certain genetic distance from other buffalo populations in China.Keywords:buffalo;mitochondrial DNA;genetic diversity;haplotype自古以来，我国南方是水稻的主要种植区，水牛作为役畜在其生产中发挥了重要的作用。在系统分类学中，水牛分为亚洲水牛和非洲水牛，亚洲水牛根据其外貌、习性、生产性能等的不同，进一步分为沼泽型水牛和江河型水牛。新安江水牛属役用及役肉兼用型，主要分布于安徽省沿新安江上游地区的休宁县、歙县、徽州区等地。当地地貌类型多样，平原、岗地、丘陵和山地俱全，是安徽省内水热带最优越的区域，适合水牛生长，而且其独特隔绝的自然环境避免了新安江水牛与其他品种之间发生交流。新安江水牛耐粗放、适应性强、役用性能强，善于行走。线粒体 DNA（mtDNA）遵循母系遗传特性，其控制区D-Loop序列变异速率为其他片段的510倍，且不易发生基因重组，在家畜起源进化和群体遗传多样性等研究中有广泛的应用。研究发现，沼泽型水牛和江河型水牛不仅在形态学1、细胞学2-3和蛋白质多态性4-5上存在较大的差异，而且有较远的遗传距离6。Ting 等7通过分析 25 个沼泽型水牛和江河型水牛品种的121个全基因组，发现沼泽型水牛和江河型水牛的祖先在大约 23 万年前分化，然后经历了独立的驯化过程。Lei等8-9研究发现，中国本地水牛品种具有丰富的遗传多样性，中国沼泽型水牛具有两条线粒体DNA谱系，有2个母系起源。Yue等10通过对中国本地沼泽型水牛和江河型水牛mtDNA D-loop区的研究，发现大部分的中国沼泽型水牛属于 A支系，且 A支系很有可能在中国西南部驯化而成。亐开兴等11和张自芳等12通过研究滇东南水牛的 D-Loop区，发现滇东南水牛属于沼泽型水牛，存在 2个母系血统来源，受河流型水牛基因渗入较小。卢永芳等13和赵拴平等14通过分析安徽地区江淮水牛和东流水牛的 D-Loop 区，发现江淮水牛和东流水牛遗传多样性丰富，且具有2个线粒体母系来源。本研究通过分析 28 条安徽新安江水牛的线粒体 DNA D-Loop序列和 693 条中国其他地方水牛的 D-Loop 序列，探索新安江水牛群体的遗传多态性和系统进化关系，以期为中国地方水牛种质资源保护和创新利用提供科学依据。1材料与方法1.1材料在安徽省黄山市休宁县、徽州区等新安江水牛主产区，选择28头2536月龄、无亲缘关系的水牛个体，颈静脉每头采血10 mL，ACD抗凝，低温带回实验室冻存于-80冰箱中。同时从 GenBank 数据库（https：/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下载24个中国地方水牛群体 693 条 D-Loop 序列数据，合计 25 个地方品种共721份样本（表1）。1.2方法1.2.1DNA提取利用天根生化科技有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒提取新安江水牛的全基因组，利用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测DNA完整性，将检测合格的DNA样品使用双蒸水稀释至50 ng/L冷藏备用。1.2.2PCR扩增和测序新安江水牛 mtDNA D-Loop 全序列利用引物 D-Loop-F：5-TAGTGCTAATACCAACGGCC-3和 D-Loop-R：5-AGGCATTTTCAGTGCCTTGC-315进 行 扩 增。PCR反应体系25 L，包括1 L DNA，12.5 L 2Taq PCRMix缓冲液，正反向引物各1L（100 ng/L）和去离子水。扩增条件：95预变性5 min；95变性30 s，60退火30 s，72延伸1 min，32个循环；72总延伸5 min。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，阳性产物进行纯化与回收后委托上海生工生物工程有限公司测序。1.2.3数据分析利用 DNASTAR 5.0 和 Clustal X 软件分析校对测序获得的新安江水牛 mtDNA D-Loop 区序列，利用DnaSP 5.10软件16统计变异位点数、单倍型数、核苷酸多样性和单倍型多样性，利用MEGA 11.0.13软件17分析多态位点，构建 Neighbor-joining 系统发生树，利用Network10.2.0.018软件构建Media-joining网络。-2赵拴平，金海，刘峻，等.安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究J.中国草食动物科学，2024，44（1）：1-72结果与分析2.1新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传变异分析由表1可知，安徽新安江水牛的mtDNA D-Loop区完整序列长度为926933 bp，28个新安江水牛群体中共存在117个变异位点，构成25种单倍型，其中共有单倍型包括Hap5和Hap7，Hap5频率最大（10.7%，3/28），其他单倍型均为不同个体所特有。新安江水牛mtDNA D-Loop 区核苷酸多样性为 0.9890.014，单倍型多样性为0.026 020.003 03，说明其遗传多样性丰富。中国25个地方水牛群体的721条mtDNA D-Loop序列共存在226个变异位点，构成了224个单倍型，核苷酸多样性为 0.018 150.002 42，单倍型多样性为0.8830.011，其中18个单倍型在新安江水牛群体首次发现。新安江水牛群体单倍型多样性和核苷酸多样性与其他水牛群体无显著差异，其群体遗传多样性与其他水牛群体接近。2.2新安江水牛群体mtDNA D-Loop区的系统进化树分析利用新安江水牛群体构建 Neighbor-joining 系统发生树，结果如图1所示，25个单倍型分为A、B两个大的支系，A支系由21个单倍型构成，代表24个水牛个体，占总水牛群体的85.71%（24/28），B支系由4个单倍型构成，代表4个水牛个体，说明新安江水牛具有A支系和B支系2个母系来源，其中A支系占据主导地位。2.3基于mtDNA D-Loop区的中国水牛群体的遗传距离和系统进化树分析以肉牛（Bos taurus）（NC_006853）作为外群体参照，利用 MEGA11.0.13 软件对获得的 25 个水牛群体表1中国25个地方水牛群体遗传多样性比较群体新安江水牛东流水牛江淮水牛海子水牛江汉水牛恩施水牛信阳水牛温州水牛信丰水牛峡江水牛鄱阳湖水牛滨湖水牛汉中水牛陕南水牛贵州水牛西林水牛富钟水牛广西水牛德宏水牛滇东南水牛涪陵水牛德昌水牛宜宾水牛兴隆水牛福安水牛总计样本数/头28548225252529251924282516242515252939252224314512721单倍型数/个25354713141117131112161981214815192218151115227224A支系n2446681818212619172124191317181711201633171320386560k213039910915101011141479106181512159710194152B支系n48147743623463777451361291176161k4584422312252342741036453472单倍型多样度0.9890.0140.9440.0230.9550.0130.9070.0430.9370.0290.7670.0860.9260.0340.8100.0790.8890.0580.7570.0940.8700.0580.9730.0190.8500.0750.8220.0740.9100.0430.8290.0850.8470.0580.9630.0190.9230.0230.9430.0370.9390.0370.9130.0310.8560.0480.8640.0460.8940.0630.8830.011核苷酸多样度0.026 020.003 030.013 310.002 080.014 890.002 320.017 870.001 990.017 290.001 980.011 900.001 890.010 560.003 840.016 980.002 120.009 390.002 090.010 350.002 040.010 850.001 900.048 280.007 810.015 790.002 390.017 130.001 980.019 110.002 140.017 470.002 300.013 330.001 980.040 480.002 810.015 530.002 270.022 030.002 150.021 690.002 110.018 700.001 860.018 670.001 860.012 430.001 810.022 560.002 360.018 150.002 42注：n为样本数，k为单倍型数-3China Herbivore Science2024年第44卷第1期中国草食动物科学Vol.44 No.1 2024721个mtDNA D-Loop序列进行遗传距离分析，结果如表2所示。新安江水牛与东流水牛、江淮水牛和峡江水牛的遗传距离最近，与广西水牛的遗传距离最远，为0.054。由图2可知，新安江水牛与中国其他地方水牛群体聚为一类，广西水牛单独聚为一类，可能与广西水牛群体在长期培育过程中，有江河型水牛基因渗入有关。2.4基于 mtDNA D-Loop 单倍型间的 Media-joining进化网络分析进化网络图（Network）能客观地描述物种内不同单倍型间的遗传进化关系，呈现物种的进化进程19。本研究利用DnaSP 5.10和Network10.2.0.0软件构建了721条mtDNA D-Loop序列224个单倍型的网络图，结果如图 3 所示。224 个单倍型分为 A 和 B 两个支系，图125个新安江水牛线粒体D-Loop区单倍型的Neighbor-joining系统发生树图225个中国地方水牛群体Neighbor-joining系统发生树图325个中国地方水牛群体线粒体D-Loop单倍型的Media-joining进化网络图-4赵拴平，金海，刘峻，等.安徽新安江水牛mtDNA D-Loop区遗传多样性与系统进化研究J.中国草食动物科学，2024，44（1）：1-7表2中国25个地方水牛群体遗传距离项目新安江水牛东流水牛肉牛福安水牛温州水牛信阳水牛广西水牛西林水牛汉中水牛涪陵水牛滨湖水牛德昌水牛滇东南水牛德宏水牛恩施水牛富钟水牛贵州水牛海子水牛江汉水牛陕南水牛信丰水牛兴隆水牛峡江水牛鄱阳湖水牛宜宾水牛江淮水牛新安江水牛0.0120.2430.0280.0190.0200.0540.0230.0220.0270.0200.0250.0260.0230.0210.0210.0240.0230.0210.0240.0200.0220.0170.0190.0250.013东流水牛0.2350.0240.0150.0120.0490.0150.0140.0210.0190.0190.0200.0150.0130.0130.0170.0160.0160.0170.0120.0140.0120.0120.0190.012肉牛0.2350.2340.2330.2270.2330.2350.2350.2380.2390.2390.2390.2380.2380.2390.2390.2380.2390.2380.2390.2380.2350.2360.235福安水牛0.0220.0220.0500.0220.0230.0230.0230.0230.0240.0240.0220.0230.0230.0230.0230.0230.0230.0230.0230.0230.0220.022温州水牛0.0140.0490.0170.0160.0210.0190.0190.0210.0170.0150.0150.0180.0170.0170.0180.0140.0160.0140.0150.0200.014信阳水牛0.0480.0150.0130.0200.0180.0170.0200.0140.0120.0130.0160.0160.0150.0160.0110.0130.0110.0120.0180.011广西水牛0.0490.0490.0500.0500.0500.0500.0490.0480.0490.0500.0500.0490.0490.0490.0490.0480.0480.0490.048西林水牛0.0160.0210.0200.0190.0210.0170.0150.0160.0180.0180.0180.0180.0150.0160.0150.0150.0200.014汉中水牛0.0210.0190.0190.0210.0160.0140.0140.0180.0170.0170.0170.0130.0150.0130.0140.0200.013涪陵水牛0.0230.0220.0230.0220.0200.0210.0220.0220.0220.0220.0200.0210.0200.0210.0220.020滨湖水牛0.0210.0210.0200.0190.0180.0200.0190.0190.0200.0180.0190.0180.0180.0220.018德昌水牛0.0220.0190.0170.0180.0190.0200.0200.0200.0170.0180.0170.0180.0210.017滇东南水牛0.0210.0200.0200.0210.0210.0210.0210.0190.0200.0190.0200.0220.019德宏水牛0.0150.0160.0180.0180.0180.0180.0140.0160.0140.0150.0210.014恩施水牛0.0140.0160.0160.0160.0160.0120.0140.0120.0130.0190.012富钟水牛0.0170.0160.0160.0170.0130.0140.0120.0130.0190.012贵州水牛0.0190.0190.0190.0160.0170.0160.0170.0210.016海子水牛0.0180.0190.0150.0170.0150.0160.0210.015江汉水牛0.0180.0150.0170.0150.0160.0200.015陕南水牛0.0160.0170.0160.0170.0200.016信丰水牛0.0130.0110.0120.0190.011兴隆水牛0.0130.0130.0200.013峡江水牛0.0120.0190.011鄱阳湖水牛0.0170.010宜宾水牛0.017江淮水牛-5China Herbivore Science2024年第44卷第1期中国草食动物科学Vol.44 No.1 2024A支系呈现以单倍型Hap_15和Hap_174为中心，周围单倍型环绕的星状辐射结构；B支系包含b1和b2两个亚支系，b1支系以Hap_7为中心，b2支系以Hap_22为中心，均呈现星状辐射结构。距离A支系和B支系较远的9个单倍型，代表广西水牛的16个个体。3讨论新安江水牛主要分布于安徽省沿新安江流域上游地区，主要产区为安徽省黄山市的休宁县、歙县、徽州区和祁门等地。南宋罗愿所著 新安志 记载，“水牛色苍而多力其角如环，所谓吴牛也”。安徽新安江流域雨水充沛，气候温和湿润，自古以来就有种植水稻的历史，山间水田面积小，交通不便，当地农民多饲养水牛用于耕田，水牛作为当地传统农业不可分割的一部分，饲养历史悠久。当地人们的传统思想认为，牛是财富的象征。生物群体丰富的遗传多样性不仅有助于适应不同的生态环境，更是其可持续稳定发展的重要基石。核苷酸多样度和单倍型多样度是衡量群体遗传变异程度的重要指标，核苷酸多样度和单倍型多样度越高，群体的遗传变异程度越高。本研究通过分析28头安徽新安江水牛 mtDNA D-Loop 区的核苷酸变异，发现其群体中共存在117个变异位点，核苷酸多样性为0.9890.014，单倍型多样性为0.026 020.003 03；新安江水牛的单倍型多样性高于中国其他地方水牛品种，与东流水牛、江淮水牛、滨湖水牛和广西水牛较为接近；其核苷酸多样度低于滨湖水牛和广西水牛，高于其他地方水牛品种。说明新安江水牛线粒体D-Loop区遗传变异率较高。系统进化树分析发现，新安江水牛具有2个母系来源（A支系和B支系），本研究结果与Lei等8-9所发现的中国水牛群体 2 个母系遗传起源的观点一致。遗传进化分析发现，新安江水牛与东流水牛（安徽）、江淮水牛（安徽）和峡江水牛（江西）遗传距离最近，与广西水牛遗传距离最远。N-J系统发生树显示，新安江水牛与中国其他地方水牛群体聚为一类，说明新安江水牛属于沼泽型水牛。进化网络图描述了25个水牛群体224个单倍型的遗传进化关系，呈现A支系以单倍型Hap_15和Hap_174为中心的星状辐射结构；亚支系b1和b2也具有星状结构的特征，预示着中国水牛经历了群体的扩张。距离A支系和B支系较远的9个单倍型，代表广西水牛的16个个体，与赵拴平等14报道的广西水牛具有江河型水牛血统的研究结果一致。新安江水牛是安徽优良地方水牛品种之一，是我国丰富基因库的重要组成部分。本研究发现，新安江水牛属于沼泽型水牛。历史研究证明，沼泽型水牛在社会生产生活中主要用来役用，是水稻田耕作重要的劳动力20，与新安江流域自古以来就有种植水稻的历史相符合。近年来，对沼泽型水牛驯化地点和时间的研究仍然存在争议。Yue等10研究认为，沼泽型水牛在中国西南地区驯化形成，而Colli等21和Zhang等22认为，沼泽型水牛在中国西南-东南亚边境和泰国北部地区驯化形成。据联合国粮食及农业组织2017年数据统计，中国是世界3个主要水牛饲养大国之一，共饲养水牛2 347万头，占世界总头数的11.68%23。近年来，由于农业产业结构调整和农村劳动力的转移，机械逐渐取代了役用水牛，加之本土水牛缺乏完善的遗传资源保护和利用，我国面临着本土水牛种质资源退化，群体数量和质量大幅度下降的窘况。据统计，2022年底具有种用价值的新安江水牛仅有4 129头。因此，迫切需要加大对新安江水牛的保护力度，应在保种的基础上加以开发利用。4结论本试验研究了我国安徽新安江水牛群体线粒体D-Loop区的遗传多样性及系统进化关系，证明新安江水牛属于沼泽型水牛，具有个母系起源，其群体变异水平与中国其他地方水牛群体接近，且新安江水牛与我国其他地方水牛具有一定的遗传距离。参考文献1 BEATON W G.The husbandry and health of the domestic buffalo J.Tropical Animal Health and Production，1975，7：40.2 黄右军，刘业基.三品种杂交水牛及其亲子代染色体的研究 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