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灭菌工艺基础知识灭菌和消毒的目的与定义n消毒、灭菌的目的：抗生素发酵是纯种培养过程，培养基在储存、运输、加工、配制过程中不同程度污染了多种杂菌，需要通过严格的消毒、灭菌以彻底清除杂菌。n消毒的定义：消毒是指应用消毒剂等方法杀灭物体表面和内部的病原菌营养体，但不一定能杀死细菌芽孢的方法n灭菌的定义：用物理或化学方法杀灭或除掉物料及设备中所有的生命物质的工艺过程。包括致病和非致病微生物以及芽孢。灭菌比较彻底。n消毒、灭菌的重要性：消毒、灭菌工作在发酵车间占有举足轻重的地位。灭菌的方法n1、化学灭菌法：使用化学药剂如甲醛、苯酚、新洁尔灭、过氧乙酸、高锰酸钾、漂白粉等进行某些容器或物料及无菌区域的灭菌。n2、物理灭菌：主要有射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌。n3、按温度划分：100为常用消毒杀菌温度，100-120为高温灭菌，120-150为超高温灭菌。n4、湿热灭菌比干热灭菌更有效，对芽胞的杀灭效果更佳。湿热灭菌法湿热灭菌法的原理n通过饱和蒸汽加热、加压，使温度上升到微生物致死范围，菌体蛋白质或核酸发生变性、凝固、继而死亡。消毒介质-饱和蒸汽n抗生素培养基通常以饱和蒸汽做为灭菌介质。n饱和蒸汽灭菌（湿热灭菌）的优点(题解1）：1）本身无毒、无公害。2）蒸汽具有很大潜热，穿透力强，有利于彻底灭菌。3）制备输送容易，调节方便，操作上易管理。决定灭菌效果的主要因素n灭菌效果取决于菌的种类与灭菌温度。微生物有一个共同的行为特征耐热性。不同的微生物耐热性（灭菌温度）不同；相同温度下，芽胞比生长期细菌的耐热性强。灭菌效果仅与菌的种类与灭菌温度有关。细菌芽胞灭菌时间和温度细菌芽胞细菌芽胞名称名称灭菌时间（灭菌时间（min）100105 110 120 125 炭疽杆菌2-5枯草杆菌数小时40韦氏梭菌4527151肉毒梭菌3001209020嗜热杆菌400300358灰黄霉素的菌体形态（发酵液）决定灭菌效果的主要因素n由上表可以看出，芽胞比生长期细菌的耐热性强。n芽胞：是细菌抵抗外界不良环境（高温、低温、光线、干燥、化学品）的休眠体，具有很强的耐热性。n因此，以杀灭最耐热的芽胞为标准，把121、30分钟作为最安全的灭菌温度和灭菌时间。灭菌对培养基的影响n湿热灭菌属于高温灭菌，灭菌的时间越长、温度越高，营养成分破坏也越严重。n灭菌是一把双刃剑，在保证全部杀灭杂菌的同时为抗生素纯种发酵提供无菌培养基，还不同程度地破坏培养基，同时发生一系列物理、化学反应。n各车间根据培养基特点、工艺要求，在经过理论计算、工艺验证的基础上，制定不同的灭菌温度和灭菌时间。n此外，还要注意升温阶段、降温阶段，与保温阶段同样有灭菌效果。灭菌温度、时间对培养基的影响灭菌温度（）灭菌时间（min）破坏程度（%）10040099.3110306711515501204271300.5081400.0821500.011发酵培养基各组分的性质及作用n1、碳源：、碳源：为细胞生命活动提供能量以及合成产物的碳架。淀粉、糊精、豆油、葡萄糖、鱼油属于碳源。n2、氮源：、氮源：是构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。黄豆饼粉、豆粕粉、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、氨水属于氮源。黄豆饼粉、酵母粉为有机氮源，硫酸铵为无机氮源。n3、无机盐：、无机盐：硫酸亚铁、磷酸二氢钾、碳酸钙、硫酸镁。n4、微量元素、微量元素：氯化钴。n5、其它辅料、其它辅料：淀粉酶、抗生素、消泡剂等。消毒、发酵指标及常用参数n1、效价：抗生素是一种生理活性物质，其活性常用特定的单位-“效价”来表示，它是衡量抗生素有效成分的尺度，也是衡量其抗菌性能的标志。常用单位/毫升（r/ml）或单位/毫克（u/mg）来表示。n2、PH值要想得到比较理想的发酵单位，必须重视消前、消后、发酵过程中PH值的控制，即应将PH值控制在抗生素产生菌的生长繁殖及合成抗生素的最适合的PH值范围内。3、发酵液体积（一）理论放罐体积=发酵罐空罐体积装料系数 空罐体积=内半径的平方罐体高度+下封头容积 （二）放罐体积=（一、二级种子液+发酵罐消后体积+全程补料液体积）-蒸发量放罐总亿和发酵指数n根据发酵效价、体积、与泡沫系数，计算发酵产物的总亿效价n实体积虚体积=泡沫系数n虚体积泡沫系数=实体积n实体积放罐效价=发酵总亿n发酵指数是衡量发酵水平的技术指标。n 平均发酵单位平均放罐体积n发酵指数=平均发酵周期发酵罐空罐体积n发酵指数单位（发酵液总亿/小时m3）消后体积的重要性n对于种子罐、发酵罐、补料罐消毒体积的要求，必须保证碳、氮比例协调，符合工艺规定的消后指标。n对于种子罐的消后体积，体积过小，移入下级罐的接种量偏低，使产生菌生长代谢缓慢，起步单位低；体积过大，容易起沫染菌，不利于正常生产。n对于补料罐的消后体积，主要控制计料液的含糖量。发酵罐消后体积的重要性（题解2）n对于发酵罐的消后体积，除了要保证工艺条件外，还需考虑装料系数（理论放罐体积）和全程补料量，过大的体积会造成许多不利之处：1、体积过大，容易造成逃液。2、容易污染杂质，影响发酵水平。3、空气利用不好，影响溶氧。相反，体积过小，使放罐体积变小，发酵总亿达不到要求，产量偏低，设备利用率差，成本偏高。无菌空气系统n1、无菌空气在发酵生产中的作用：产生抗生素的微生物大多数是好氧菌（需氧菌），整个发酵过程需要不断通入无菌压缩空气，为微生物生长代谢持续供氧，并维持罐压防止外界杂菌侵入。n2、无菌空气的重要性：空气系统带菌造成的染菌约占染菌总数的20%，合理设计、安装空气净化设备，严格按无菌制度和操作规程使用空气，是保证空气无菌的关键。n3、无菌空气的预处理：空气中含有水分、尘埃、细菌，需要经过除水、多级过滤除菌等处理过程，方可用于发酵生产。无菌空气系统工作流程空气冷却器旋风分离器空气加热器总 过 滤 器空气冷却器旋风分离器空气加热器总 过 滤 器无菌空气的制备压缩空气经空压机压缩后，压强和温度提高，相对湿度下降，但湿含量不变，露点比压缩前提高，也就是下一步空气经冷却后很容易达到露点而析出水。如下表：温度温度表压表压相对湿度相对湿度湿含量湿含量压缩前压缩前20200MPa0MPa80.00%80.00%0.0298kg/kg0.0298kg/kg压缩后压缩后1041042.0MPa2.0MPa5.60%5.60%0.0298kg/kg0.0298kg/kg无菌空气的制备冷却压缩空气经冷却后，压强不变、温度降低，相对湿度提高，湿含量降低，且温度降低到露点以下、相对湿度100%时，水分析出。如下表：温度温度表压表压相对湿度相对湿度湿含量湿含量压缩前压缩前20200MPa0MPa80.00%80.00%0.0298kg/kg0.0298kg/kg压缩后压缩后1041042.0MPa2.0MPa5.60%5.60%0.0298kg/kg0.0298kg/kg冷却后冷却后3030（T T露）露）2.0MPa2.0MPa100.00%100.00%0.0048kg/kg0.0048kg/kg无菌空气的制备除水和加热n压缩空气冷却到露点以下后，空气中水分析出，由于空气在管道中流速较大，水滴或雾滴被空气所夹带，通常采用旋风分离器利用离心力除掉水滴及较重微粒。无菌空气的制备加热器n从除水设备中出来的空气，相对湿度仍达100%，直接进行过滤会浸湿过滤介质，影响过滤效果。因此需将空气进行加热升温，降低相对湿度，保证空气以较干燥状态进入过滤器。无菌空气的制备过滤空气中含有细菌、霉菌孢子、酵母菌、噬菌体、病毒等微生物，其中细菌芽胞和霉菌孢子较多，大小为0.5-1m，附着在尘埃和雾沫上，因此只要将大于0.5m的尘埃粒子除去，即可达到无菌要求。一般经两级总过滤器、一级预过滤器、一级精过滤器的分级过滤，可获得符合要求的无菌空气。典型发酵罐及管道、阀门组成？（题解3）n典型的发酵罐包括罐体、上下封头、人孔、传动装置（包括减速机或皮带轮、轴承箱、轴封、传动轴、联轴器、拉筋、搅拌浆）、蛇管或夹层、灯孔、视镜孔、接种口、压力表等仪表接口、温度计管（温度传感器）、电极座（PH、）、挡板等。n发酵罐附属的管道按功能分为进放料管道、进气排气管道、取样管道、冲视镜管道、间接冷却加热管道、消泡剂管道、移种管道、补料管道、通氨管道等系统。截止阀特点：n也叫球心阀，截阀。优点：密封面摩擦力小、耐用；严密性能好、易于开关、维修方便；开启高度可以使用丝扣拉杆控制，易于调节流量；耐受高温及压力，不易损坏。缺点：截止阀阀芯阻力大，影响流量和流速；截止阀不易于在黏稠的物料中使用，这样会造成阀门的密封面不严密而泄漏；截止阀安装时有方向性，逆向安装会造成阻力更大，但在发酵罐的连接上，必须注意与发酵罐为正向，与管路流向为逆向安装。针形阀特点n一般是用来控制微量调节的小型阀门，它的一般通径有15mm和10mm两种。n优点：耐受高温、高压、不易腐蚀；易于控制微量流速和流加、滴加补料；操作方便，易于更换。缺点：易于损坏，尤其是阀头容易掉头；因为结构小，通道小，所以容易被堵塞。旋塞阀特点n也称考克，是一种不耐受高温和高压，但又易于操作的阀门。材质一般以铸铁为主，这就决定了它不能耐受高温（一般要求小于等于100）和高压，不能猛力开关，以免扭断、变形。球形阀特点n也称球阀。特点：流体阻力小，流量大，极小有压差的表现；不受安装的方向性的制约；能耐受高温高压，耐腐蚀，严密性好，阀体本身不存在死角，结构简单，极少有渗漏点。缺点：不能做微量调节使用，最好是全开或全闭；尽管能耐受高温，也不要在长期高温管路上使用。手动隔膜阀特点n也称隔阀，它是依靠橡胶隔膜和聚四氟隔膜，通过手动拉杆的紧密压合而达到开启和密闭的。特点：流体阻力小，流速不受影响；可以在黏稠或有颗粒的介质上；介质不会于阀头部分接触，因此不存在阀头填料密封处泄漏的弊端；结构简单耐受腐蚀。缺点：除特制的耐高温高压的隔膜阀外，一般的手动隔膜阀不耐受高温高压，一般公称压力在6Kgf/cm2，温度为80，最高耐受温度180；容易损坏，渗漏，变形；必须定期更换隔膜阀垫。止回阀特点n又称止逆阀、单向阀等。止回阀是依靠液体本身的动力自动启闭阀门，它的作用是阻止介质的逆向流动。n特点：介质在阀体内单向流动，阻止介质倒流；耐受高温、高压，不易变形。缺点：不能使用在黏稠和有颗粒的物料介质上，因为止回阀的密封面一旦有黏稠物或有颗粒物的时候，止回阀就会失去单向的意义，起不到防止物料倒流的作用；不能使用在有腐蚀性介质的管路上。染菌率的计算染菌率的计算n以发酵总罐批为基准,染菌罐批应包括染菌重消后的重复染菌的罐批。发酵总过程(全周期)无论前期或后期染菌,均作“染菌”论处。发酵罐染菌罐批染菌率()X100%总投罐批题解4-设备造成染菌的原因n空气分布管安装不合理。n排气与排污管道相互串联在一起。n补料管道安装不合理造成死角。n分蒸汽管路进汽位置不合适，灭菌时“短路”。n管道中的阀门和法兰、丝扣等渗漏。n罐体穿孔或罐内冷却管穿孔。n轴封泄漏。题解5-空气过滤器注意事项?n（1）加强预过滤器的检查，加强蒸汽过滤器的检查。n（2）压降超标停止使用。n（3）安装新过滤器滤芯前严格检查滤层有无破损。n（4）保证空气湿度在60%以下，防止湿空气造成滤芯过滤效果下降。n（5）严禁培养基倒流入空气过滤器。n（6）灭菌时严禁空气、蒸汽同时使用，严禁超温超压，送空气时要缓慢。n（7）灭菌完要使蒸汽冷凝水彻底排净、吹干后使用。n（8）总过滤器滤芯采用自净方式处理，不得用蒸汽消毒。题解6-7n使用蒸汽前必须排尽蒸汽管道内的冷却水？蒸汽管道内的冷凝水夹带着少量铁锈及杂物，如不将其排尽，在通蒸汽时会直接引入罐内，引起阀门开启失灵，另外还会使消后体积不准，尤其是消空气滤芯更应排尽水。n灭菌操作中为什么要以温度为主，压力为辅进行控制？一般情况下，灭菌时达到一定罐压即表示温度也到了，但是若仅控制罐压，则并不安全可靠，因操作不当可能会出现虚假罐压，所以灭菌操作中必须要以温度为主，压力为辅进行控制。题解8消毒前空罐的准备包括哪些内容？n（1）罐内外设备的检查，罐内传动设备、罐内管路有无穿孔、堵塞、断裂，罐外设备、管路检查无泄露、堵塞、阀门换垫。n（2）罐内死角的清除。n（3）罐体焊缝、阀门、法兰的严密度检查，防止泄露。题解9消毒工应具备哪些能力？n（）良好的身体素质和心理素质。n（）精细的操作能力和多工种综合知识。n（）迅速反应能力和敏捷的思维。n（）具备强烈的安全、环保意识以及无菌观念。n（）团队意识强，具备合作能力。n（）学习能力强，善于分析总结和文字语言表达。n（）能够做到“三勤”即“腿勤、嘴勤、手勤”题解10：简述湿热灭菌的机理和影响因素？n灭菌机理：n湿热灭菌法是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键特别是氢键破坏，引起不可逆的变性，造成微生物死亡。n影响因素：n1、灭菌温度：提高灭菌温度，杂菌的死亡速度增加。n2、灭菌时间：适当提高灭菌时间，可保证灭菌效果，对培养基破坏程度也随之加大。n3、杂菌菌量：菌量增加，杂菌的耐热性提高，灭菌难度加大。n4、PH值的影响：培养基的PH值越低所需灭菌时间越短。n5、培养基成分：脂肪、糖类、蛋白质类培养基中的杂菌耐热性增加，高浓度盐类、色素则削弱杂菌的耐热性。n6、泡沫：培养基起泡，使微生物藏在泡内，形成隔离层，导热效果差，灭菌难度加大。n7、培养基颗粒：颗粒过大互相粘结成块状，难以完全杀灭其中杂菌，必须过滤除去大颗粒，并严禁团状物出现。制服染菌的要点（补充）n1.种子带菌或怀疑种子带菌9.648.接种管穿孔。0.29n2.接种时罐压降至大气压力0.199.阀门泄漏1.45n3.培养基消毒不透0.79110.搅拌轴封的泄漏2.09n4.总空气系统带菌19.611.罐盖泄漏1.54n5.泡沫升至罐顶0.4812.其它设备泄漏10.13n6.夹套穿孔12.3613.操作问题10.15n7.蛇管穿孔5.8914.原因不明24.91从上表可以看出的抗生素发酵染菌原因分析的统计资料看,空气净化系统带菌是导致染菌的主要因素。但仔细分析,设备穿孔和渗漏等造成的染菌占33.85，占第1位。发酵代谢的常规分析曲线（了解）代谢参数（了解）代谢参数（了解）OUR：菌体代谢耗氧速率：菌体代谢耗氧速率 CER：二氧化碳释放率：二氧化碳释放率 RQ ：呼吸商：呼吸商 KLa：氧传递系数：氧传递系数