基于16S_rRNA测序研...硬化小鼠肠道菌群结构的影响_肖刘成.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 848 基于16S rRNA测序研究小陷胸汤对动脉粥样 硬化小鼠肠道菌群结构的影响肖刘成1,2，曾思宇1，陈伟业1，贺美燕3，王慧颖1，范崇源1，谢雪姣1,3（1湖南中医药大学，长沙 410200；2常德市第一中医院，常德 415099；3郴州市第一人民医院，郴州 423099）摘要：目的：观察小陷胸汤对动脉粥样硬化小鼠肠道菌群的影响。方法：将30只雄性ApoE-/-小鼠随机分为空白对照组（n=6）和造模组（n=24）。喂养8周后，将造模组小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组、小陷胸汤原方组、小陷胸汤方剂组，每组6只。空白对照组与模型组小鼠给予等量无菌0.9%氯化钠溶液，阿托伐他汀组小鼠给药剂量为2.6 mgkg-1d-1，小陷胸汤原方组给药剂量为16.5 gkg-1d-1，小陷胸汤方剂组给药剂量为 5 gkg-1d-1。连续给药8周后取材。用油红O染色、HE染色检测主动脉根部斑块含量，基于16S rRNA基因测序技术分析小鼠肠道菌群。结果：与模型组比较，小陷胸汤原方组、方剂组主动脉根部斑块减少（P0.01）；小陷胸汤可以正向调节AS小鼠肠道菌群的2种差异菌门（拟杆菌门，厚壁菌门）与8种差异菌属（Alistipes属、毛螺菌 科-NK4A136-group、拟普雷沃菌属、拟杆菌属、Muribaculum属、罗氏菌属、瘤胃球菌科UCG组014属、普雷沃氏科UCG组001属）。结论：小陷胸汤对AS小鼠具有防治作用，该作用可能改善AS小鼠肠道菌群失调来实现的。关键词：动脉粥样硬化；小陷胸汤；16S rRNA技术；肠道菌群；斑块基金资助：国家自然科学基金项目（No.81603600），湖南省教育厅科学研究项目（No.19K069）Effects of Xiaoxianxiong Decoction on intestinal flora structure of atherosclerosis mice based on 16S rRNA sequencingXIAO Liu-cheng1,2,ZENG Si-yu1,CHEN Wei-ye1,HE Mei-yan3,WANG Hui-ying1,FAN Chong-yuan1,XIE Xue-jiao1,3(1Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410200,China;2Changde First Hospital of Traditional Chinese Medicine,Changde 415099,China;3Chenzhou First Peoples Hospital,Chenzhou 423099,China)Abstract:Objective:To observe the effects of Xiaoxianxiong Decoction on intestinal flora of atherosclerosis(AS)mice.Methods:Thirty male ApoE-/-mice were randomly divided into a blank control group(n=6)and a modeling group(n=24).After 8 weeks of feeding,the modeling group were randomly divided into a model group,atorvastatin group,Xiaoxianxiong Decoction original formula group and Xiaoxianxiong Decoction formula group,with 6 rats in each group.The blank control group and model group were given the same amount of sterile 0.9%sodium chloride solution.The dose of atorvastatin group mice was 2.6 mgkg-1d-1,the dose of Xiaoxianxiong Decoction original group was 16.5 gkg-1d-1,and the dose of Xiaoxianxiong Decoction group was 5 gkg-1d-1.The materials were drawn after 8 weeks of continuous administration.The plaque content of aortic root was detected by oil red O staining and HE staining,and the intestinal flora of mice was analyzed based on 16S rRNA gene sequencing technology.Results:Compared with the model group,the plaque of aortic root in Xiaoxianxiong Decoction group and formula group decreased;Xiaoxianxiong Decoction can positively regulate 2 different bacteria(Bacteroidetes,Firmicutes)and 8 different bacteria(Alistipes,Lachnospiraceae_NK4A136_group,Alloprevotella,Bacteroides,Roseburia,Muribaculum,Ruminococcaceae_UCG-014,Prevotellaceae_UCG-001)in the intestinal flora of AS mice.Conclusion:Xiaoxianxiong Decoction has a preventive and therapeutic effect on AS mice,which may be achieved by improving the imbalance of intestinal flora in AS mice.Key words:Atherosclerosis;Xiaoxianxiong Decoction;16S rRNA technology;Intestinal flora;PlaqueFunding:National Natural Science Foundation of China(No.81603600),Scientific Research Project of Hunan Provincial Department of Education(No.19K069)研究报告通信作者：范崇源，湖南省长沙市岳麓区湖南中医药大学，邮编：410200，E-mail：谢雪姣，湖南省长沙市岳麓区湖南中医药大学，邮编：410200，E-mail：内文2.indd 8482023/2/28 10:36:33中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 849 动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种涉及炎症和代谢途径的复杂疾病，是诸多疾病及心脑血管事件的主要发病基础1-2，AS引起的心脑血管疾病已成为非传染性疾病中首要威胁人类健康的疾病。研究3-4发现，人体肠道菌群及其代谢产物与AS存在密切的联系。肠道菌群是人体肠道内的正常微生物，具备免疫、代谢、维持黏膜屏障等多种功能5，近年来，临床与实验研究均证明中药在调节肠道菌群结构，改善肠道屏障功能障碍，降低机体慢性炎症从而抗AS方面具有不良反应少、防治结合等优势6，故被广泛应用于调控肠道菌群抗AS的防治中。小陷胸汤出自于伤寒论，由瓜蒌实、黄连、半夏3味药组成，具有清热化痰、宽胸散结的功效，主治痰热互结的小结胸病。现代多将小陷胸汤应用于消化、呼吸、心血管及代谢等多系统疾病的治疗7，疗效显著，安全性高。本研究则利用16S测序技术研究使用小陷胸汤治疗ApoE-/-小鼠AS过程中肠道菌群的变化情况，试从肠道微生物角度阐释小陷胸汤治疗AS的作用 机制。材料与方法1.动物 SPF级雄性C57BL/6J ApoE-/-小鼠30只，5周龄，体质量1922 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006。动物饲养于湖南中医药大学实验动物中心，SPF级屏障环境，室温2125，湿度40%50%，光照时间7：0017：00，自由进食饮水。实验室使用许可证号：SYXK（湘）2019-0009。本实验经湖南中医药大学实验伦理委员会批准（伦理审批号：LLBH-201907200016），实验严格遵循实验动物管理条例的相关规定，科学利用，合理保护实验动物。2.药物与制备 小陷胸汤原方组：根据伤寒论原文 138条“黄连一两，半夏半升（洗），瓜蒌实大者一枚”，参照目前通用的经方剂量折算方法，黄连一两约为15.6 g，半夏半升约42 g，瓜蒌实大者一枚约为70 g；小陷胸汤方剂组：根据十四五规划教材方剂学祛痰剂清热化痰剂中剂量，黄连6 g、法半夏12 g、瓜蒌实20 g；中药饮片均购自湖南中医药大学附属第一医院。先将药物加入超纯水中浸泡20 min，再将药物放在电热套中煎煮两次，第1次煎煮加入药物总量8倍量的水，煮沸后小火慢熬1 h，过滤。第2次煎煮加入药物总量6倍量水，煮沸后小火慢熬40 min，过滤。小陷胸汤原方组滤液浓缩至含生药量为 1.65 g/mL浓缩液，小陷胸汤方剂组滤液浓缩至含生药量为 0.5 g/mL浓缩液，20 储存备用。阿托伐他汀钙片（规格：10 mg，乐普制药科技有限公司）购于湖南中医药大学附属第一医院；将阿托伐他汀钙片研磨成粉末状，电子天平上称取13 mg研磨的细粉，加超纯水定容至 50 mL，用玻璃棒搅拌充分混匀，相当于药液浓度为0.26 mg/mL。3.试剂与仪器 DNeasy PowerSoil Kit（QIAGEN公司，批号：12888）；Qubit dsDNA Assay Kit（Life Technologies公司，批号：Q32854）；Tks Gflex DNA Polymerase（Takara公司，批号：R060B）。台式高速离心机（Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5418）；PCR仪（Bio-rad，型号：580BR10905）；凝胶成像仪（Tanon公司，型号：2500）。4.模型制备 将30只雄性ApoE-/-小鼠分笼饲养，实验前所有小鼠适应性喂养1周，按体质量随机选择6只小鼠作为空白对照组，以普通饲料喂养，剩余24只小鼠为造模组，饲喂高脂饲料（1%胆固醇+10%猪油+10%蛋黄粉+0.2%猪胆盐+78.8%基础饲料），喂养8周。5.分组与给药 将造模组小鼠按体质量随机分为模型组、阿托伐他汀组、小陷胸汤原方组、小陷胸汤方剂组，每组6只。空白对照组与模型组小鼠给予等量无菌0.9%氯化钠溶液，阿托伐他汀组小鼠给药剂量为2.6 mgkg-1d-1，小陷胸汤原方组给药剂量为16.5 gkg-1d-1，小陷胸汤方剂组给药剂量为 5 gkg-1d-1。以上给药剂量均按中药药理实验方法学中人和动物体表面积换算法计算所得。连续给药8周，给药阶段所有小鼠均普通饲料喂养。6.样本的采集 在末次给药24 h后，收集小鼠心脏纵轴垂直方向切下心尖处约1/3的组织，剩余组织保存于4%多聚甲醛中；取小鼠结肠内容物于无菌Ep管，置于-80 超低温冰箱 保存。7.小鼠主动脉根部染色 取固定好的心脏组织，经过冰冻切片制备与油红O染色、HE染色等常规步骤后，显微镜下观察并拍照保存图片。8.DNA的提取 每组中随机选取6个结肠内容物样本，采用DNA抽提试剂盒对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000检测DNA的浓度和纯度。9.PCR扩增和产物纯化 进行细菌16S rDNA V3-V4可变区PC扩增，前端引物：343F：5-TAC GGR AGG CAG CAG-3，后端引物：798R：5-AGG GTA TCT AAT CCT-3。以基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase进行PCR，确保扩增效率和准确性。对PCR产物使用电泳检测、磁珠纯化及Qubit 定量。10.Illumina NovaSeq测序 根据PCR产物浓度进行等量混样，使用Illumina NovaSeq 进行上机测序生成原始双端序列，称为raw data。对测序数据进行去杂、拼接、质控及除嵌合体等优化处理，最终得到valid tags，用于97相似性则分归为不同单元（一个单元即一个OTU）的划分。11.生物信息学分析 根据不同样本中OTU丰度不同，对肠道菌群进行物种注释与评估，对各样本的物种Alpha多样性予以分析，采用主坐标轴分析（PCoA）考察Beta多样性水平，并使用R语言程序作物种分布柱状图对所有样本在不同分类水平（属水平和门水平）的具体菌群进行组成分析。内文2.indd 8492023/2/28 10:36:34中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 850 12.统计学方法 本实验数据采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，数据以x-s表示，数据符合正态性和方差齐，两组比较采用t检验，多组比较用方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。结果1.小鼠主动脉根部油红O染色、HE染色结果 见表1，图1。与空白对照组比较，各组主动脉根部粥样硬化斑块面积均显著增多（P0.01）；与模型组比较，各药物组斑块面积均显著减少（P0.01）。空白对照组小鼠主动脉根部可见少量粥样硬化斑块，模型组斑块较多，各药物组斑块较模型组少，较空白对照组多。表1 各组ApoE-/-小鼠主动脉根部粥样硬化斑块面积比较（x-s，n=6，%）组别粥样硬化斑块面积百分比空白对照组12.002.19模型组35.954.76*阿托伐他汀组27.652.11*小陷胸汤原方组27.365.95*小陷胸汤方剂组24.634.16*注：与空白对照组比较，*P0.01；与模型组比较，P0.01。图1 ApoE-/-小鼠主动脉根部油红O（A）、HE染色（B）（100）注：Che.空白对照组；Mod.模型组；Ato.阿托伐他汀组；Ori.小陷胸汤原方组；Form.小陷胸汤方剂组。图4-图6同。CheAtoModOriFormAB2.OTU分析 见图2。本实验共得5 671条OTU，5组共有OTU序列为2 205条，空白对照组独有序列为2 113条，模型组独有序列为1 234条，阿托伐他汀组独有序列为1 826条，小陷胸汤原方组独有序列为1 881条，小陷胸汤方剂组独有序列为1 741条，其中空白对照组独有的OTU数目最多。说明高脂饮食会降低ApoE-/-小鼠的OTU数目，小陷胸汤和阿托伐他汀片干预可增加AS小鼠的OTU数目。3.Alpha多样性分析 由图3A可知，与正常组比较，模型组的Chao1指数显著降低（P0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组、小陷胸汤方剂组、小陷胸汤原方组Chao1指数显著回调（P0.01，P0.05）。由图3B可知，与正常组比较，模型组Shannon指数显著降低（P0.05）；与模型组比较，阿托伐他汀组、小陷胸汤方剂组、小陷胸汤原方组Shannon指数显著回调（P0.01，P0.05）。图3 各组Alpha多样性分析注：A.Chao1指数；B.Shannon指数。*P0.05，*P1%的优势菌门均为拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）。柱形图结果表明不同组别在门水图2 各组OTUs分布维恩图空白对照组小陷胸汤方剂组小陷胸汤原方组阿托伐他汀组模型组内文2.indd 8502023/2/28 10:36:36中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 851 平优势物种相同，但相对丰度不同。空白对照组为拟杆菌门（72.8）、厚壁菌门（25.6）、变形菌门（1.0）；模型组为拟杆菌门（89.6）、厚壁菌门（8.3）、变形菌门（1.5）；阿托伐他汀组为拟杆菌门（56.6）、厚壁菌门（39.2）、变形菌门（2.1）；小陷胸汤原方组为拟杆菌门（6.8）、厚壁菌门（20.2）、变形菌门（2.2）；小陷胸汤方剂组为拟杆菌门（75.8）、厚壁菌门（21.9）、变形菌门（1.7）。图5 门水平物种相对丰度柱状图相对丰度（%）ModOriCheAtoForn5.2 属水平菌群丰度分析 见图6。5个组丰度1%的优势菌属Alistipes属、毛螺菌科-NK4A136-group（Lachnospiraceae_NK4A136_ group）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）、Muribaculum属、罗氏菌属（Roseburia）、瘤胃球菌科UCG组014属（Ruminococcaceae_UCG-014）、普雷沃氏科UCG组001属（Prevotellaceae_UCG-001），柱形图结果表明不同组别在属水平优势物种相同，但相对丰度不同。空白对照组为Alistipes（9.0%）、毛螺菌科-NK4A136-group（6.9%）、拟普雷沃菌属（1.2%）、拟杆菌属（3.0%）、Muribaculum（1.9%）、罗氏菌属（1.7%）、瘤胃球菌科UCG组014属（2.8%）、普雷沃氏科UCG组001属（1.3%）；模型组为Alistipes（3.1%）、毛螺菌科-NK4A136-group（3.6%）、拟普雷沃菌属（6.5%）、拟杆菌属（4.1%）、Muribaculum（3.3%）、罗氏菌属（2.4%）、瘤胃球菌科UCG组014属（0.1%）、普雷沃氏科UCG组001属（0.1%）；阿托伐他汀组为Alistipes（10.4%）、毛螺菌科-NK4A136-group（10.2%）、拟普雷沃菌属（2.9%）、拟杆菌属（2.4%）、Muribaculum（0.7%）、罗氏菌属（3.5%）、瘤胃球菌科UCG组014属（0.6%）、普雷沃氏科UCG组001属（1.3%）；小陷胸汤原方组为Alistipes（6.3%）、毛螺菌科-NK4A136-group（3.6%）、拟普雷沃菌属（2.7%）、拟杆菌属（2.1%）、Muribaculum（1.9%）、罗氏菌属（0.6%）、瘤胃球菌科UCG组014属（0.8%）、普雷沃氏科UCG组001属（1.5%）；小陷胸汤方剂组为Alistipes（8.6%）、毛螺菌科-NK4A136-group（8.4%）、拟普雷沃菌属（2.8%）、拟杆菌属（2.2%）、Muribaculum（1.9%）、罗氏菌属（0.5%）、瘤胃球菌科UCG组014属（0.7%）、普雷沃氏科UCG组001属（0.9%）。图6 属水平物种相对丰度柱状图ModOriCheAtoForn相对丰度（%）AlistipesA2LachnoclostridiumLactobacillusFaecalibaculumLachnospiraceae_UCG-001Lachnospiraceae_UCG-006othersParasutterellaBacteroidesAlloprevotellaMuribaculumRoseburiaRuminococcaceae_UCG-014Prevotellaceae_UCG-001Lachnospiraceae_NK4A136_group讨论中医学并无“AS”一词，从临床表现上应属于“胸痹心痛”“眩晕”“痴呆”“中风”等范畴。本课题组认为，AS发病与现代人缺乏运动、饮食不节、喜食膏粱厚味等有关。嗜食膏粱厚味，则易致脾胃壅盛，膏脂难以运化，郁而为热，聚而为痰，导致痰热内生，如叶天士在临证指南医案中记载：“湿为重浊有质之邪必其人膏粱酒醴过度”8。故可以说痰热互结是AS的主要病理基础，“痰热互结”是胸痹心痛的核心病机之一，治当清热化痰，经方中小陷胸汤正合契机。小陷胸汤方中黄连苦寒，清泄心下之热结；半夏辛温，化痰消痞散结；瓜蒌实甘寒清润，既助黄连清热，又助半夏涤痰理气散结。三药配合，辛开苦降，宽胸散结，使痰热各自分消，方简而力雄。本研究探讨以清热化痰、宽胸散结立法的小陷胸汤调节肠道菌群抗AS的作用机制，采用16S rRNA高通量测序技术探究小陷胸汤对AS小鼠肠道菌群组成结构的影响。本研究小鼠主动脉根部油红O染色结果表明，高脂饲料喂养能增加ApoE-/-小鼠主动脉根部斑块面积，阿托伐他汀及小陷胸汤灌胃给药均可有效抑制主动脉根部斑块沉积，确有防治AS的功效。Alpha结果显示，肠道菌群丰富度和多样性可因AS发病而降低，因阿托伐他汀及小陷胸汤干预而提高。Beta多样性分析结果表明，经过药物干预后，阿托伐他汀及小陷胸汤方剂组、原方组的与空白对照组二维关系更为贴近、相似度更高，提示阿托伐他汀片及小陷胸汤不同剂量对肠道菌群的调整具有积极作用。从各肠道菌群样本在门分类水平柱状图中可观察到，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为优势菌，占总微生物95%以上的比例。相对于空白对照组，模型组小鼠肠道拟杆菌门丰度显著增加，厚壁菌门丰度显著降低。经阿托伐他汀及小陷胸汤不同剂量对AS小鼠干预后，拟杆菌门丰度占比下降而厚壁菌门丰度占比上升，可以认为治疗组小鼠的厚壁菌门和拟杆菌门菌群丰度水平向正常组的状态转化。进一步的属水平分类学组成分析发现，各组样本间菌群丰度在属水平存在差异，而相对丰度1%的差异菌群中，Alistipes属、罗氏菌属、瘤胃内文2.indd 8512023/2/28 10:36:37中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 852 球菌科UCG组014属、毛螺菌科-NK4A136-group与短链脂肪酸（SCFA）的生成有关9-11，其中Alistipes属、瘤胃球菌科UCG组014属、毛螺菌科-NK4A136-group与SCFA生成呈正相关。SCFA具有抗AS作用，可以在肠道中与G蛋白偶联受体GPR41和GPR43结合，对宿主起到抗炎和免疫的作用12。拟普雷沃菌属对溃疡性结肠炎模型具有保护作用，能恢复肠道屏障 功能13，阻止有害物质进入血液及其他组织，从而降低AS风险。拟杆菌属与AS的重要致病标志物氧化三甲胺（trimetlylamine oxide，TMAO）关系密切，TMAO增多能够影响心血管疾病发生已经被证实14-15。目前对Muribaculum属有关信息较少，有研究指出Muribaculum属与肠道炎症的产生有关16。普雷沃氏科UCG组001属与腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）信号通路呈正相关17，AMPK的激活是使其磷酸化，p-AMPK通过促进巨噬细胞脂质外流，减少泡沫细胞形成，保护血管内皮，减少脂质累计及斑块形成，延缓AS进程18。综上所述，本研究发现小陷胸汤对AS小鼠具有防治作用，该作用可能通过改善肠道菌群多样性，提高Alistipes属、毛螺菌科-NK4A136-group、瘤胃球菌科UCG组014属、普雷沃氏科UCG组001属相对丰度，降低拟普雷沃菌属、拟杆菌属、Muribaculum属、罗氏菌属相对丰度来实现的。参 考 文 献1 马丽媛,吴亚哲,陈伟伟.中国心血管病报告2018要点介绍.中华高血压杂志,2019,27(8):712-7162 Virani S S,Alonso A,Aparicio H J,et al.Heart disease and stroke statistics-2021 update:A report from the American Heart Association.Circulation,2021,143(8):e254-e7433 Wu W K,Ivanova E A,Orekhov A N.Gut microbiome:A possible common therapeutic target for treatment of atherosclerosis and cancer.Semin Cancer Biol,2021,70:85-974 Li X,Su C,Jiang Z,et al.Berberine attenuates choline-induced atherosclerosis by inhibiting trimethylamine and trimethylamine-N-oxide production via manipulating the gut microbiome.NPJ Biofilms Microbiomes,2021,7(1):365 aja F,Stakheev D,Chernyavskiy O,et al.Immune activation by microbiome shapes the colon mucosa:Comparison between 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8522023/2/28 10:36:37