好氧反硝化菌群强化A_O工艺脱氮性能研究_段州君.pdf

第45卷段州君，李鹏飞，王浩，等.好氧反硝化菌群强化A/O工艺脱氮性能研究J.环境科学与技术，2022，45（12）：52-60.Duan Zhoujun，Li Pengfei，WangHao，et al.Function of biological enhancement of nitrogen removal by aerobic denitrifying bacteria in A/O processJ.Environmental Science&Technology，2022，45（12）：52-60.Environmental Science&Technology第45卷 第12期2022年12月Vol.45 No.12Dec.2022环境科学与技术 编辑部：（网址）http:/（电话）027-87643502（电子信箱）收稿日期：2022-07-24；修回2022-10-08基金项目：国家重点研发计划项目（2019YFA0905504）；中央高校基本科研基金项目（2017KFKJFP002）作者简介：段州君（1990-），女，工程师，研究方向为污水处理，（电子信箱）；*通讯作者，教授，（电子信箱）。好氧反硝化菌群强化A/O工艺脱氮性能研究段州君1，2，3，李鹏飞1，2，3，王浩1，2，3，景方圆4，高亮1，2，3，周贤钢1，2，3，黄文1，2，3，胡智泉4*（1.湖北中烟工业责任有限公司，湖北武汉430040；2.湖北新业烟草薄片开发有限公司，湖北武汉430056；3.重组烟叶应用技术研究湖北省重点实验室，湖北武汉430040；4.华中科技大学环境科学与工程学院，湖北武汉430074）摘要：厌氧/好氧（A/O）活性污泥法是应用最广泛的污水处理工艺之一，然而该工艺脱氮效率通常只有70%80%，且需要较大的混合液回流比，导致其能耗偏高。该研究从活性污泥中筛选分离出多株好氧反硝化细菌并进行了优化组合，构建了高效好氧反硝化菌群，并应用于强化A/O反应器O池脱氮。结果表明，组合AD-1+AD-5+Z1脱氮效率最高，其最佳脱氮条件为30、pH 79、摇床转速150 r/min、C/N=10，在此条件下其对SNDM培养基中TN去除率达到98.38%。强化A/O工艺中混合液回流比从200%降低至50%，TN去除率仅略微降低2.5%，与传统A/O工艺相比，强化A/O主要脱氮途径由缺氧反硝化变为同步硝化反硝化。通过好氧反硝化菌群强化脱氮，A/O工艺可节省60%的回流能耗，对于降低该工艺的污水处理运行成本具有重要意义。关键词：好氧反硝化菌群；A/O工艺；混合液回流比；脱氮；生物强化中图分类号：X703；X172文献标志码：Adoi：10.19672/ki.1003-6504.1564.22.338文章编号：1003-6504(2022)12-0052-09Function of Biological Enhancement of Nitrogen Removal byAerobic Denitrifying Bacteria in A/O ProcessDUAN Zhoujun1，2，3，LI Pengfei1，2，3，WANG Hao1，2，3，JING Fangyuan4，GAO Liang1，2，3，ZHOU Xiangang1，2，3，HUANG Wen1，2，3，HU Zhiquan4*（1.China Tobacco Hubei Industrial Co.,Ltd.,Wuhan 430040,China;2.Hubei Xinye Reconstituted Tobacco Development Co.,Ltd.,Wuhan 430056,China;3.Hubei Key Lab of Applied Research Institute of Reconstituted Tobacco,Wuhan 430040,China;4.School of Environmental Science&Engineering,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430074,China）Abstract：Anaerobic/aerobic(A/O)activated sludge process is one of the most widely used sewage treatment processes,however its nitrogen removal efficiency is merely 70%80%,and besides it needs large reflux ratio of mixed liquid causinghigh energy consumption.In this study,a number of strains of aerobic denitrifying bacteria were isolated from activatedsludge,and were optimized to build up a high-efficiency aerobic denitrifying bacteria consortium,which was applied forenhancing of nitrogen removal efficiency of O tank in A/O reactor.Findings of the study indicated that the consortium AD-1+AD-5+Z1 had the best denitrification efficiency with a TN removal efficiency of 98.38%under the condition:incubation temperature of 30,value of pH 7-9,shaking speed of 150 r/min,and C/N of 10.In the case of the A/O process that had been enhanced,the reflux ratio of mixed liquid was reduced from 200%to 50%,and TN removal efficiency only slightly declined by2.5%;and unlike the traditional A/O process,the denitrification pathway of the enhanced A/O process changed from anoxicdenitrification to simultaneous nitrification and denitrification.As a result of using aerobic denitrifying bacteria to enhance nitrogen removal,the reflux energy consumption of A/O process could be saved 60%,which consequently was of significancefor reducing the operation cost of sewage treatment.Key words：aerobic denitrifying bacteria consortium;A/O process;mixed liquid reflux ratio;nitrogen removal;bio-augmentation第12期我国水环境的氮容量安全阈值为每年(52070)万t，但目前氮的实际排放量达到每年(1 450310)万t1。过量的氮释放到水中会导致水体富营养化，有害藻类大面积爆发，进而引起水生动植物死亡，不仅严重破坏水体生态环境，降低水体功能，还会对人体健康产生危害。富营养化是我国水环境治理亟需解决的重要问题，据统计，我国五大湖区中50%以上的典型湖泊处于不同程度的富营养化状态2。水体富营养化一旦形成，治理过程将十分困难，因此污水排入受纳水体前均要进行脱氮处理。目前污水厂主要利用生物法脱氮，传统生物脱氮通常包括2个步骤：好氧条件下自养生物的硝化作用和厌氧条件下异养生物的反硝化作用3。由于这两类微生物需要分别在好氧与厌氧条件下才能各自发挥作用，导致传统脱氮工艺必需设置好氧段和缺氧段，或通过间歇曝气来控制反应器中的溶氧量，造成反应器占地面积大、回流管道多、剩余污泥量大、运行能耗高4-6。随着我国环保要求的进一步提高，不少污水处理厂的出水水质，尤其是氮素指标，将难以达到排放标准，制约着污水厂的进一步提质增效7。利用生物强化对污水厂提标改造具有明显的技术经济优势，该技术通过引入一些特定降解功能的菌株，从而提高反应器对污染物的去除效率8，9。传统反硝化细菌多为自养厌氧型微生物，生长缓慢，且不易分离纯化10。好氧反硝化细菌（aerobic denitrifying bacterium，ADB）的发现，为活性污泥的强化生物脱氮提供了契机11。ADB是一类在有氧条件下利用好氧反硝化酶进行反硝化的微生物，与传统厌氧型脱氮微生物相比，ADB在生物脱氮方面具有明显的优势，一方面，其具有更强的环境适应性和较快的生长速率，可耐受高盐、低温、高氨氮等极端条件，可将铵态氮在好氧条件下直接转化为气态产物，在一个反应器中实现同步硝化反硝化，降低污水处理工程建设成本12，13。另一方面，好氧反硝化脱氮工艺中硝化和反硝化过程产生的酸碱可相互中和，系统的 pH 值基本不需要调节14。近年来，好氧反硝化脱氮技术受到广泛关注，学者们从不同的环境介质中分离出多种ADB，如 Zobellelladenitrificans A6315、Enterobacter cloacae strain F216、Pseudomonas stutzeri DZ1117等，为该技术的推广与应用提供了坚实的物质基础。先前的研究多侧重于ADB的筛选及脱氮性能分析，关于ADB的应用则主要集中于利用单一菌株强化SBR等间歇式生物反应器脱氮18，19，对于强化连续流反应器脱氮方面的研究则较少。本研究从活性污泥中筛选分离出多株ADB，基于生态位互补原理构建了好氧反硝化菌群（ADBs），并用于强化A/O工艺中O池脱氮，探究了低混合液回流比条件下外源强化菌群对A/O工艺去除生活污水中氮磷污染物效能的影响，以期为好氧反硝化技术在传统活性污泥处理工艺中的应用提供技术指导。1材料与方法1.1实验材料1.1.1培养基本实验所用的培养基包括富集培养基（EM）、溴百里酚蓝（BTB）培养基、异养硝化培养基（HNM）、好氧反硝化培养基（ADM）与同步硝化反硝化培养基（SNDM），培养基的组分设置参照Li等19所述。各培养基在使用前利用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl调节pH至7.0左右，并在121 下灭菌15 min。1.1.2活性污泥与实验废水用于菌株筛选的活性污泥取自于实验室稳定运行的A/O反应器好氧池，MLSS为3 5004 000 mg/L，SV为20%30%。实验废水采用人工模拟生活污水，以无水CH3COONa为碳源、NH4Cl为氮源、KH2PO4为磷源，主要水质指标：COD 300400 mg/L，NH4+-N3540 mg/L，PO43-P 68 mg/L。1.2实验方法1.2.1好氧反硝化细菌的筛选ADB的筛选参照Li等19所述方法：将5 mL污泥悬液添加到100 mL EM中，在摇床中（30、150 r/min）振荡培养48 h，然后取10 mL上清液接种于100 mLADM中，并在相同条件下培养48 h，再一次取10 mL上清液于100 mL ADM中培养48 h，重复接种若干次直至ADM中硝氮去除率达到稳定状态，随后取0.1 mL上清液涂布于BTB培养基上，在30 条件下培养直至出现蓝色菌落，采用划线法对菌株进行纯化，然后接种于ADM中培养（30、150 r/min）测试其好氧反硝化脱氮能力。1.2.2好氧反硝化菌群的构建与脱氮性能研究将筛选到的好氧反硝化菌株分别以单株、两株或多株的形式进行等比例组合，取总量为2 mL的混合菌液（OD600=1.0），投加到装有100 mL SNDM的锥形瓶中，30、120 r/min 摇床培养 24 h，检测水体中OD600、NH4+-N、NO3-N、NO2-N 及 TN 等指标。以CH3COONa 为碳源、NH4Cl（NH4+-N=40 mg/L）为氮源，选择脱氮性能最好的菌群为研究对象，考察其在不同温度（1535）、初始pH（511）、摇床转速（80180 r/min）及C/N（412）条件下的脱氮性能。1.2.3好氧反硝化菌群强化A/O处理生活污水段州君，等好氧反硝化菌群强化A/O工艺脱氮性能研究53第45卷A/O反应器由有机玻璃制成，包括进水、缺氧池（A池）、好氧池（O池）、沉淀池、出水及自动控制系统等六部分（图1），其中A/O池有效容积为25 L，A池和O池容积比为1 3，系统的进水、混合液回流、搅拌、曝气等由PLC程序自动控制。为避免强化菌随出水流失，采用填料（聚酯纤维）挂膜对ADBs进行固定化，生物强化时挂膜填料在O池中的填充比（以体积计）为20%。反应器污泥回流比为 50%，通过定期排泥使污泥 MLSS 浓度保持在3.5 g/L左右，每天取样检测出水中NH4+-N、NO3-N、NO2-N、PO43-P、COD等污染物的浓度。当系统稳定运行后，逐步降低混合液回流比（200%50%），研究低回流比下生物强化对A/O反应器处理效能的影响。1.2.4分析方法NH4+-N、NO3-N、NO2-N、COD等水质指标利用多功能水质测定仪（GL-800，山东格林凯瑞）分别采用纳氏试剂分光光度法、紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法、重铬酸钾快速消解法测定；菌体密度（OD600）利用分光光度计（UV-1100，上海美谱达）在600 nm波长下测定。微生物群落分析由北京诺禾致源科技股份有限公司提供，采用16S rDNA扩增子测序技术，测序平台为illumina NovaSeq。2结果与讨论2.1好氧反硝化菌群的构建及脱氮性能研究从活性污泥中共筛选出6株ADB，组合AD-1+AD-5+Z1为脱氮效率最高的混合菌群，24 h内其对SNDM 中TN去除率达到95.40%，高于组合中单菌株AD-1、AD-5和Z1的83.10%、84.45%以及86.53%（表1），因此选择该组合作为最佳复合菌群。16S rDNA鉴定结果表明，这3种细菌分别属于假单胞菌（Pseudomonas AD-1）、不动杆菌（Acinetobacter AD-5）与假单胞菌（Pseudomonas Z1），GenBank 登录号分别为MW426198、MW426203、MT898541。菌株AD-1AD-5Z1AD-1+AD-5+Z1OD6000.850.030.990.030.931.06氮浓度/(mgL-1)NH4+-N3.880.030.424.120.88NO3-N02.750.031.120.78NO2-N2.883.050.030.150.17TN去除率/%83.100.5084.450.5086.530.5095.400.50表1好氧反硝化菌及其复合菌群的脱氮性能Table 1Denitrifying capacity of aerobic denitrifying bacteria and their complex flora2.2环境因子对好氧反硝化菌群脱氮性能的影响低温会导致底物与酶分子活性部位接触不足，高温则会使蛋白酶变性失活20，由图2(a)可知，混菌的最适温度为30。中性环境更有利于混菌的生存，pH过高或过低均会降低混菌的脱氮效率（图2(b)）。混菌在转速为150 r/min时具有最高的脱氮效率，而转速为80 r/min时会严重抑制硝化过程（图2(c)），这可能是因为DO浓度过低影响了氨氧化酶的合成和活性21。C/N比对菌群的生长和脱氮效率产生了较大影响，C/N越高，脱氮效率越好，但当C/N超过10时脱氮效率基本不变（图2(d)），研究表明好氧反硝化适宜的C/N比通常在910之间，过高的C/N比反而会抑制好氧反硝化效率22。综上述，混合菌群最佳脱氮条件为30、pH 79、摇床转速150 r/min、C/N=10，此时其在24 h内对TN的去除率达到98.38%。2.3好氧反硝化菌群协同脱氮机理分析图3显示了单菌和混菌在SNDM中的生长及氮源利用情况。由生长曲线可知，单菌和混菌均在3 h开始大量繁殖，在18 h左右达到最大值，混菌具有更大的生长速率与生长量。单菌和混菌在同步硝化反硝化过程中对不同氮源显示出不同的降解特性，AD-1好氧反硝化性能强而异养硝化性能较弱；AD-5显示了较强的异养硝化能力，但会产生较高的NO2-N和NO3-N积累；Z1对NO2-N的降解性能较强，但对NH4+-N的降解能力偏弱；组合 AD-1+AD-5+Z1 对 NH4+-N、NO2-N 和 NO3-N 具有较强的降解能力，培养 24 h后，各形态氮素的积累量均不足1 mg/L。混菌的生长速率和脱氮效率均高于单菌，表明不同氮代谢特性的3种细菌在同步硝化反硝化过程中产生了协同效应，在脱氮功能上形成了互补，通过菌种间的相互作用，54第12期形成了一条高效、完整的氮代谢途径（图4）23。不少研究表明，具有不同氮代谢功能的菌株之间存在协同作用，与单一菌株相比，细菌群落核心物种间的竞争和协作显著促进了碳氮代谢24，25。2.4好氧反硝化菌群强化A/O工艺处理生活污水2.4.1强化A/O系统对污染物的处理效果段州君，等好氧反硝化菌群强化A/O工艺脱氮性能研究55第45卷如图5所示，在A/O运行的第阶段（010 d），混合液回流比为200%，反应器稳定运行时进水中COD、NH4+-N、TN及TP的平均去除率分别为87.06%、95.75%、78.18%与65.05%。在第阶段（1130 d），混合液回流比降至150%，COD及NH4+-N的去除率基本保持不变，TN去除率则降至63.23%，TP去除率升高至70.41%，这主要是因为低回流比下硝化液不能完全回流至缺氧池进行反硝化脱氮，导致大量NO3-N无法去除，而回流比降低有利于维持缺氧池中较低的DO浓度，促进PAOs充分释磷26。另一方面，低回流比条件下回流至缺氧池的NO2-N、NO3-N量减少，而缺氧池中的NOx-N会导致PAOs和反硝化菌竞争碳源，抑制PAOs胞内聚羟基烷酸（PHA）的合成和磷的释放，游离的 NO2-N 还会对 PAOs 的生长和繁殖产生影响27，28。第阶段前期（3135 d）加入空白填料，出水中TN去除率未出现明显变化；在36 d时取出空白填料，加入挂膜填料，TN 去除率从 64.04%逐步升至79.22%。第阶段（5170 d）和第阶段（71110 d），混合液回流比分别降至100%、50%，出水中TN去除率在短暂降低后均得到恢复，最终稳定时出水中COD、NH4+-N、TN及TP的平均去除率分别为88.49%、96.27%、76.23%与76.37%。金位栋等29利用反硝化菌剂强化A/O反应器的厌氧池，在混合液回流比为200%时TN去除率从强化强的60%左右提高至70%左右，本研究中在混合液回流比降低至50%时TN去除率依旧超过75%，表明好氧反硝化菌在强化A/O工艺脱氮方面更有优势。2.4.2A/O系统强化前后脱氮途径分析对A/O及强化A/O反应器稳定运行期间进水及出水TN浓度的检测结果（图6）表明，由于混合液回流比降低，A池无法充分反硝化，导致强化A/O反应器中A池出水TN浓度达到28.79 mg/L，明显高于A/O反应器的22.41 mg/L，但两种情况下O池出水中TN浓度均在12 mg/L左右，说明强化A/O反应器中O池对于TN的去除作用大大提升。对氮去除途径的分析结果表明，A/O反应器通过缺氧反硝化（A池）、同步硝化反硝化（O池）及沉淀去除的TN分别占进水TN量的41.53%、56第12期29.17%与7.48%，而强化A/O反应器中三者数据分别为26.06%、41.88%与10.22%，表明强化A/O反应器对TN的去除主要以同步硝化反硝化为主。2.4.3微生物群落结构分析对A/O反应器不同阶段（）O池活性污泥的高通量测序结果（图7）表明，稳定运行时O池活性污泥主要优势菌包括棒杆菌属（Corynebacterium，6.75%）、腐螺旋菌属(norank_f_Saprospiraceae，6.51%)、短波单胞菌属（Brevundimonas，4.02%）及球衣菌属（Sphaerotilus，3.31%），与硝化作用相关的亚硝酸菌属（Nitrosomonas，3.23%）及硝化螺旋菌属（Nitrospira，2.04%）丰度也较高，一些缺氧型反硝化细菌如陶厄氏菌属（Thauera，1.25%）、硫杆菌属（Thiobacillus，0.89%）在O池中也有发现。填料生物膜中的菌群结构与活性污泥中存在较大差异，其主要优势菌属为假单胞菌（18.54%）、亚硝酸菌属（6.76%）与不动杆菌属（5.29%），这与Chen等30的研究结果一致。假单胞菌与不动杆菌来自生物强化的ADBs，填料投加至O池初期这两种细菌的丰度在生物膜中占比超过80%，在与活性污泥中微生物长期竞争后，二者的丰度大大降低，但仍处于优势地位，李昂等31的研究也表明，利用填料挂膜的方式可以避免强化菌株的流失并在系统中保持优势种群地位。除强化好氧反硝化菌外，填料生物膜中还存在较高丰度的陶厄氏菌（1.42%）与脱氮单孢菌（Dechloromonas，1.96%），后者是一种典型的好氧反硝化细菌32，这些脱氮微生物的存在提高了O池的同步硝化反硝化效率。由图8可知，稳定运行时A池中主要优势菌属包括丝硫菌属（Thiothrix，8.05%）、硫杆菌属（Thiobacillus，7.32%）、陶厄氏菌属（6.59%）与Denitratisoma（4.58%）等。随着混合液回流比的降低，A池中丝硫菌、Candidatus_Competibacter与Accumulibacter等菌属的丰度均上升，而硫杆菌属的丰度则出现下降，这种细菌通常以NO3-N为氮源，通过硫自养反硝化脱氮33。在混合液回流比不断降低过程中，多数缺氧型反硝化细菌的丰度呈先上升后下降趋势，主要是因为回流的NO3-N量减少，无法为反硝化细菌提供足够的氮源。高通量测序结果表明，低混合液回流条件下，强化A/O工艺中脱氮菌群结构发生较大改变，ADBs成为主要的脱氮微生物。2.5强化A/O系统技术经济性分析强化A/O工艺与传统A/O工艺相比，系统出水TN去除率只降低了2.15%，但混合液回流比降低了150%，根据运行过程中的电耗统计，混合液回流比的降低约减少了60%的回流电耗。我国大中型厌氧好氧污水处理工艺中混合液回流所需电耗占生物处理总电耗的4.75%，生物处理阶段则占污水处理总电耗的60%左右34，因此若采用好氧反硝化菌群强化A/O处理工艺，通过降低混合液回流比，在保证出水水质不变的段州君，等好氧反硝化菌群强化A/O工艺脱氮性能研究57第45卷情况下可节省1.71%的污水处理总电耗，有效地降低了A/O工艺在污水处理中的运行费用。3结论（1）利用3株好氧反硝化细菌构建了好氧反硝化复合菌群，3种细菌存在功能互补关系，在同步硝化反硝化过程中产生了协同效应，其最佳脱氮条件为30、pH 79、摇床转速150 r/min、C/N=10。（2）利用好氧反硝化菌群强化A/O工艺中的O池，在混合液回流比为50%时，反应器对模拟生活污水中COD、NH4+-N、TN及TP的平均去除率分别为88.49%、96.27%、76.23%与76.37%，污染物去除效率与混合液回流比为200%时相当。强化A/O反应器中TN的去除主要依赖于同步硝化反硝化作用。（3）通过降低混合液回流比，强化A/O工艺可节省1.71%的污水处理总电耗，对于A/O工艺污水处理节能减排具有重要意义。参考文献1 Yu C Q,Huang X,Chen H,et al.Managing nitrogen to restorewater quality in ChinaJ.Nature,2019,567(7749):516-520.2 李娜,黎佳茜,李国文,等.中国典型湖泊富营养化现状与区域性差异分析J.水生生物学报,2018,42(4):854-864.Li Na,Li Jiaxi,Li Guowen,et al.The eutrophication and itsregional heterogeneity in typical lakes of ChinaJ.Acta Hydrobiologica Sinica,2018,42(4):854-864.3Liu X Y,Dang Y,Sun D Z,et al.Identification of optimalparameters for treatment of high-strength ammonium leachate by mixed communities of heterotrophic nitrifying/aerobic denitrifying bacteriaJ.Bioresource Technology,2021,336:125415.4 刘颖,田在锋.生物脱氮新工艺研究进展J.现代化工,2022,42(4):53-57.Liu Ying,Tian Zaifeng.Advances in research on new biological denitrification processJ.Modern Chemical Industry,2022,42(4):53-57.5Rahimi S,Modin 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